НАБОР ПРАЙМЕРОВ ДЛЯ АМПЛИФИКАЦИИ ПОЛНОЙ НУКЛЕОТИДНОЙ СР-ГЕНА Potato virus Y МЕТОДОМ ОТ-ПЦР

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к молекулярной диагностике и представляет собой сконструированный набор праймеров, инициирующий амплификацию полной нуклеотидной последовательности гена оболочечного белка (coat protein gene, CP) Y-вируса картофеля (Potato virus Y, PVY) методом обратнотранскриптазной полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР).

Сфера применения изобретения: скрининг РVY-позитивных образцов пробирочных и полевых растений картофеля, а также решение научно-исследовательских задач по изучению генетического разнообразия данного вирусного патогена.

Существуют различные наборы праймеров для амплификации полной нуклеотидной последовательности СР-гена PVY методом ОТ-ПЦР. Так, при использовании пары праймеров («fwd_seq»: 5′-GCAAATGACACAATTGAT-GC-3′ и «rev_seq»: 5′-TCACATGTTCTTGACTCCAAG-3′), отобранных S. Zheng & Z. Liu (2006) [1], достигается амплификация нуклеотидной последовательности СР-гена Y вируса картофеля. Однако, ввиду того, что данные праймеры [1] фактически фланкируют последовательность СР-гена, не представляется возможным оценить уровень полиморфизма его концевых участков с помощью последующей процедуры прямого секвенирования полученного ПЦР-продукта размером 804 bp, так как концевые участки амплификата будут полностью соответствовать нуклеотидным последовательностям праймеров.

В тоже время, знание молекулярного разнообразия концевых последовательностей СР-гена имеет принципиальное значение, поскольку именно концевые аминокислотные последовательности оболочечного белка (СР), детерминируемые нуклеотидной последовательностью СР-гена, определяют эффективность диагностики данного патогена при применении иммунобиологических методов исследования. Известно, что иммунологически-активными являются именно N- и С-концевые участки СР PVY. Данные концевые области экспонированы на поверхности вирусной частицы. Так, С-концевые участки содержат 18-20 аминокислотных остатков, N-концевые области - от 30 до 67 аминокислот. Наибольшая вариабельность характерна для N-концевых участков, а для С-областей характерны незначительные замены в 1-2 аминокислоты [2].

Цель изобретения - конструирование набора олигонуклеотидных праймеров, инициирующего амплификацию полной нуклеотидной последовательности СР-гена PVY методом ОТ-ПЦР, обеспечивающего возможность оценки полиморфизма концевых последовательностей гена оболочечного белка данного вируса.

Нами сконструирован набор праймеров для амплификации полной нуклеотидной последовательности гена оболочечного белка Y-вируса картофеля методом обратнотранскриптазной полимеразной цепной реакции, отличающийся от прототипа [1] тем, что используются другие последовательности олигонуклеотидных праймеров, а именно:

инициирующие амплификацию полной нуклеотидной последовательности СР-гена Potato Virus Y с генерацией ОТ-ПЦР-продукта размером 890 bp, фланкированного по концам локусами NIb-гена и 3′-UTR, что обеспечивает возможность оценки полиморфизма концевых последовательностей СР-гена PVY.

Условия проведения реакции.

Для теоретического обоснования работоспособности сконструированных нами праймеров «PVY-CP-fl» и «PVY-CP-r2» были проведены практические исследования, направленные на доказательство эффективности амплификации ожидаемого специфичного ОТ-ПЦР-продукта размером 890 bp.

Экстракция нуклеиновой кислоты из исследуемого материала растений картофеля, инфицированных PVY, осуществлялась сорбционным способом («Рибосорб», ЦНИИЭМ, Россия).

ОТ-ПЦР выполняли согласно протоколам, представленным в табл. 1 и 2.

ОТ-ПЦР проводили на амплификаторе Mastercycler GRADIENT (Eppendorf, Германия).

Детекцию результатов ОТ-ПЦР осуществляли методом горизонтального электрофореза в 2% агарозном геле в буфере ТВЕ (рН 8,0), содержащем этидий бромид в концентрации 0,5 мкг/мл, с последующей визуализацией амплифицированных продуктов в ультрафиолетовом трансиллюминаторе (λ=310 нм). Размеры фрагментов ДНК оценивали по подвижности в сравнении со стандартными ДНК маркерами.

В работе были использованы продукты для молекулярно-биологических исследований производства ООО «СибЭнзим», Россия.

Краткое описание графических материалов

Пояснение к фиг. 1.

Фланкируемые участки праймеров, используемых для амплификации полной нуклеотидной последовательности СР-гена Potato virus Y

Пояснение к фиг. 2.

Электрофореграмма результата тестирования праймеров «PVY-CP-fl» и «PVY-CP-r2» в градиентной ОТ-ПЦР с температурой отжига 53°C-60°C.

Обозначение: М) ДНК-маркеры 1000-100 bp (СибЭнзим). 1-8) Положительный контрольный образец (ПКО): сорт картофеля Невский, инфицированный Potato virus Y: 1) Ta=53°C; 2) Та=54°C; 3) Ta=55°C; 4) Та=56°C; 5) Ta=57°C; 6) Ta=58°C; 7) Ta=59°C; 8) Та=60°C.

Пояснение к фиг. 3.

Электрофореграмма результата ОТ-ПЦР с праймерами «fwd_seq»+«rev_seq» и «PVY-CP-fl »+«PVY-CP-r2».

Обозначения: М) ДНК-маркеры 1000-100 bp (СибЭнзим). 1-2) Положительный контрольный образец (ПКО): сорт картофеля Невский, инфицированный Potato virus Y: 1) ОТ-ПЦР с праймерами «fwd_seq»+«rev_seq» [амплификация специфичного фрагмента длиной 809 bp] (S. Zheng & Z. Liu, 2006). 2) ОТ-ПЦР с праймерами «PVY-CP-fl»+«PVY-СР-r2» [амплификация специфичного фрагмента длиной 890 bp] (предложенный набор праймеров).

Пояснение к фиг. 4.

Электрофореграмма результата ОТ-ПЦР с праймерами PVY-CP-fl» и «PVY-CP-r2» исследуемых образцов картофеля.

Обозначения: М) ДНК-маркеры 1000-100 bp (СибЭнзим). 1-2) Исследуемые образцы картофеля: 1) сорт Сказка, 2) Сорт Жуковский ранний, 3) Положительный контрольный образец (ПКО): сорт картофеля Невский, инфицированный Potato virus Y.

Пояснение к фиг. 5.

Нуклеотидные последовательности 5/-терминального (а) и 3′-терминального фрагментов СР-гена изолятов PVY. Представлено сравнение с прямым («fwd_seq»), и обратным («rev_seq») праймерами-аналогами.

Заключение

По результатам практических исследований, направленных на апробацию сконструированного набора праймеров «PVY-CP-fl» и «PVY-CP-r2» для амплификации полной нуклеотидной последовательности СР-гена Potato virus Y нами получен обеспечиваемый заявленным набором олигонуклеотидных праймеров технический результат, выраженный в эффективной генерации ожидаемого специфичного ОТ-ПЦР-продукта размером 890 bp у PPY-позитивных образцов растений картофеля.

Полученный набор праймеров был использован для определения нуклеотидной последовательности СР-гена изолятов, выделенных на территории Среднего Поволжья и прилегающих регионов России. Эффективность разработанных праймеров была подтверждена в ходе секвенирования, при котором были выявлены однонуклеотидные замены в 5 - (фиг. 5а) и 3′-терминальных участках (фиг. 5б), которые невозможно обнаружить с помощью праймеров-аналогов.

Анализ результатов секвенирования ДНК подтвердил целесообразность применения разработанных праймеров. В 5′- и 3′-терминальных районах СР-гена был выявлен однонуклеотидный полиморфизм C₂G и C₇₉₂T, а также обнаружено несоответствие между структурой праймера «fwd_seq» и нуклеотидной последовательностью всех исследованных изолятов в позиции T₁₅C.

Источники информации

1. National Center for Biotechnology Information [Электронный ресурс]: NCBI GenBank (A/N: EF063710 - Potato vims Y isolate SL053 coat protein (cp) gene, partial cds // Zheng, S. and Liu, Z. - Электрон, дан. - GenBank (NCBI), Bethesda, MD, USA, 2010, - Режим доступа: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ EF063710, свободный.

2. Гнутова, Р.В. Серология и иммунохимия вирусов растений / Р.В. Гнутова // М.: Наука, 1993. - 301 с.