ПРИМЕНЕНИЕ ПРОИЗВОДНОГО ХИТОЗАНА ДЛЯ ИЗБИРАТЕЛЬНОЙ ДОСТАВКИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ И БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ КОМПЛЕКСОВ

Изобретение относится к применение производного хитозана для избирательной доставки лекарственных препаратов и биологически активных комплексов и может найти применение в медицине, ветеринарии, косметологии, пищевой промышленности.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Из уровня техники известно применение хитозана в качестве матричного носителя в фармацевтической композиции для обеспечения контролируемого высвобождения тербуталина сульфата (EA 013969 B1, TE ИОРДАНИЭН ФАРМАСЬЮТИКАЛ МЭНЬЮФЕКЧУРИНГ КО., 30.08.2010).

Известно применение хитозана в композиции для интраназального введения для регулирования скорости всасывания фентанила (EA 008500 B1, АРКИМИДИЗ ДИВЕЛОПМЕНТ ЛИМИТЕД, 29.06.2007).

Известно применение хитозана в качестве стабилизатора препарата для фотодинамической терапии онкологических заболеваний для снижения общей токсичности и повышения специфических свойств препарата (EA 002318 B1, НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННОЕ РЕСПУБЛИКАНСКОЕ УНИТАРНОЕ ПРЕДПРИЯТИЕ «ДИАЛЕК», 25.04.2002).

Известно применение сшиваемой хитозановой композиции для доставки активного агента (RU 2482133 C2, ВИСКОГЕЛЬ АБ, 20.05.2013).

Известно применение сукцината хитозана и диоксидина в антибактериальном комплексе с хлоргексидином (RU 2471477 C1, ФГБОУ ВПО «ВГУ», 10.01.2013).

Известно применение модифицированного карбодиимидом сукцината хитозана для повышения бактерицидной активности (RU 2269542 C1, ООО «МЕЖДУНАРОДНЫЙ ИНСТИТУТ ЭКОЛОГО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОБЛЕМ», 10.02.2006).

Известно применение тиолированного хитозана и N-триметил кватернизованного хитозана (ТМС) в качестве носителя для доставки макромолекулярных полимерных лекарственных препаратов (WO 2010041279 A2, VB MEDICARE PVT LTD, 15.04.2010).

Известно применение хитозана и его производных, в том числе, выпадающих в осадок в интервале pH 5,0-7,5, в виде конъюгата с лекарственным средством для длительного высвобождения лекарственного средства из фармацевтической композиции (WO 2006087028 A1, JORDANIAN PHARMACEUTICAL MFG, 24.06.2008).

Известно применение функционализированного сукцинатом хитозана в качестве биосовместимой полимерной матрицы для иммобилизации биоактивного агента (US 2007077305 A1, LE TIEN C, 05.04.2007).

Известно применение амфифильного производного хитозана в виде макромолекулы для загрузки лекарственным средством (US 2012153520 A1, LIU DEAN-МО, 21.06.2012).

Известно применение амфифильного производного хитозана для получения нагруженной лекарственным средством мицеллы (CN 102961322 A, HANGZHOU PUSHKANG BIOLOG SCIENCE & TECHNOLOGY СО LTD, 13.03.2013).

Известно применение амфифильного производного хитозана для изготовления лекарственного средства для нацеливании на клетки опухоли (CN 102924625 A, UNIV CHINA PHARMA, 13.02.2013).

Известно применение амфифильного производного хитозана для загрузки лекарственным средством (CN 102775515 A, CHINESE ACAD INST CHEMISTRY, 14.11.2012).

Известно применение макромолекулярного пролекарства на основе амфифильного производного хитозана для целевой доставки в клетки опухоли (CN 102688498 A, UNIV SHANDONG, 26.09.2012).

Известно применение амфифильного производного хитозана для получения нацеленного контрастного средства и противоракового лекарственного средства (KR 20080019507 A, KOREA INST SCI & TECH, 04.03.2008).

Настоящее изобретение направлено на разработку нового производного хитозана, предназначенного для доставки лекарственных препаратов и биологически активных комплексов, предпочтительно, избирательной доставки.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В последнее время значительный интерес проявляется к наноструктурированным полимерам. В силу большой удельной поверхности наночастицы проявляют отличные от обычных полимеров свойства и существенное увеличение характерных им. Это открывает большие возможности использования их в различных отраслях науки и техники, в частности при создании лекарственных средств. Такие структуры имеют большое сродство к мембране клетки, а малые размеры позволяют легко проникать в ядро клетки.

Наночастицы в основном представляют интерес в качестве вектора для доставки биологически активного материала в клетку. Наночастицы на основе производных хитозана отвечают требованиям, предъявляемым к таким системам. Благодаря высокой плотности заряда на поверхности они активно взаимодействуют с мембраной клеток. Частицы биосовместимы с живыми тканями организма, т.к. не вызывают аллергических реакций и отторжения, постепенно биодеградируют под действием ферментов на аминосахара, которые полностью усваиваются в живом организме. Они не токсичны и легко выводятся из организма, не вызывая конкурентных побочных реакций. Эффективность действия большинства биологически активных веществ часто ограничивается из-за невозможности подойти к органу-мишени (месту терапевтического действия) с сохранением их изначальных свойств. Применение наночастиц на основе хитозана в качестве подложки для биологически активных веществ должно обеспечить их целевую доставку, снизить применяемую дозу, пролонгировать эффективность действия и обеспечить возможность использования для орального или назального введения, как наиболее удобных путей для введения в живой организм. Известно, что введение гидрофобных групп в молекулу хитозана приводит к увеличению стабильности коллоидных систем, полученных на их основе.

Задачей настоящего изобретения является получение нового наноструктурированного производного олигосахарида хитозана с высокой трансдермальной и мембранной проницаемостью, повышенной сорбционной емкостью, содержащего гидрофобный и гидрофильный лиганд, а также растворимого в широком диапазоне pH, в котором хитозановый фрагмент имеет общую формулу (I), и его применение для доставки лекарственных препаратов и биологически активных комплексов, преимущественно, избирательной доставки.

где

R - остаток жирной или аминокислоты,

n составляет от около 12 до около 25% относительно количества моносахаридных остатков хитозана,

m составляет от около 30 до около 60% относительно количества моносахаридных остатков хитозана.

Задача решается наноструктурированным хитозаном, модифицированным остатками жирной кислоты и ангидридом янтарной кислоты, имеющим рабочую область (растворимого в широком диапазоне pH) pH от около 2 до около 9, предпочтительно от около 4 до около 9, более предпочтительно от около 6 до около 9, наиболее предпочтительно от около 7 до около 8, например около 7.4, где хитозан представлен сферической структурой с размером частиц от около 1 нм до около 2000 нм, предпочтительно от около 1 нм до около 1500 нм, более предпочтительно от около 1 нм до около 900 нм, еще более предпочтительно от около 1 нм до около 400 нм, наиболее предпочтительно от около 1 нм до около 100 нм.

Задача решается также наноструктурированным хитозаном, модифицированным аминокислотой и ангидридом янтарной кислоты, имеющего рабочую область (растворимого в широком диапазоне pH) pH от около 2 до около 9, предпочтительно от около 4 до около 9, более предпочтительно от около 6 до около 9, наиболее предпочтительно от около 7 до около 8, например около 7.4, где хитозан представлен сферической структурой с размером частиц от около 1 нм до около 2000 нм, предпочтительно от около 1 нм до около 1500 нм, более предпочтительно от около 1 нм до около 900 нм, еще более предпочтительно от около 1 нм до около 400 нм, наиболее предпочтительно от около 1 нм до около 100 нм.

Для получения амфифильного производного хитозана, имеющего содержание гидрофильного лиганда от около 12% до около 25%, предпочтительно от около 15% до около 25%, более предпочтительно от около 18% до около 25%, наиболее предпочтительно от около 20% до около 25%, и содержание гидрофобного лиганда от около 30% до около 60%, предпочтительно от около 35% до около 55%, более предпочтительно от около 40% до около 50%, наиболее предпочтительно от около 45% до около 50%, используют исходный хитозан с молекулярной массой (ММ) от около 5 кДа до около 100 кДа, предпочтительно от около 7 кДа до около 80 кДа, более предпочтительно от около 10 кДа до около 60 кДа, наиболее предпочтительно от около 30 кДа до около 50 кДа, например, около 23 кДа.

В качестве гидрофильного лиганда могут быть использованы различные химические соединения с определенным набором свойств и их производные.

Примерами жирных кислот являются каприловая, каприновая (декановая), пальмитиновая (насыщенные жирные кислоты) и олеиновая (ненасыщенная жирная кислота).

Для придания заданных свойств к полисахариду последовательно присоединяют два лиганда: остаток жирной или аминокислоты для обеспечения несущих свойств и сродства связывания с мембраной живой клетки, и остаток янтарной кислоты для обеспечения растворимости в более широком диапазоне pH, в том числе при физиологических значениях (pH около 7.4).

Таким образом, настоящее изобретение касается применения производного хитозана, в котором хитозановый фрагмент имеет общую формулу (I)

где

R - остаток жирной или аминокислоты,

n для гидрофильного лиганда составляет от около 12 до около 25% относительно количества моносахаридных остатков хитозана,

m для гидрофобного лиганда составляет от около 30 до около 60% относительно количества моносахаридных остатков хитозана,

для изготовления лекарственного средства или биологически активного комплекса.

Лекарственное средство предназначено для избирательной доставки в организм.

Лекарственное средство предназначено для избирательной доставки в организм человека.

Биологически активный комплекс предназначен для избирательной доставки в организм.

Биологически активный комплекс предназначен для избирательной доставки в организм человека.

Указанный остаток жирной кислоты представляет собой остаток каприловой кислоты.

Указанный остаток аминокислоты представляет собой остаток валина.

Указанное производное наноструктурировано.

Указанное производное имеет трансдермальную и/или мембранную проницаемость.

Указанное производное имеет повышенную сорбционную емкость.

Указанное производное растворимо при pH от около 2 до около 9, предпочтительно от около 4 до около 9, более предпочтительно от около 6 до около 9, наиболее предпочтительно от около 7 до около 8.

Указанное производное растворимо при pH около 7.4.

Указанное производное имеет сферическую структуру с размером частиц от около 1 нм до около 2000 нм, предпочтительно от около 1 нм до около 1500 нм, более предпочтительно от около 1 нм до около 900 нм, еще более предпочтительно от около 1 нм до около 400 нм, наиболее предпочтительно от около 1 нм до около 100 нм.

Указанное производное имеет содержание гидрофильного лиганда предпочтительно от около 15% до около 25%, более предпочтительно от около 18% до около 25%, наиболее предпочтительно от около 20% до около 25%.

Указанное производное имеет содержание гидрофобного лиганда предпочтительно от около 35% до около 55%, более предпочтительно от около 40% до около 50%, наиболее предпочтительно от около 45% до около 50%.

Исходный хитозан указанного производного имеет молекулярную массу от около 5 кДа до около 100 кДа, предпочтительно от около 7 кДа до около 80 кДа, более предпочтительно от около 10 кДа до около 60 кДа, наиболее предпочтительно от около 30 кДа до около 50 кДа.

Исходный хитозан указанного производного имеет молекулярную массу около 23 кДа.

Исходный хитозан указанного производного имеет степень деацетилирования 85+2%.

Указанное производное является связываемым с клеткой.

Указанное производное биодеградируемо.

Таким образом, настоящее изобретение касается также композиции лекарственного средства или биологически активного комплекса, содержащая производное хитозана, в котором хитозановый фрагмент имеет общую формулу (I)

где

R - остаток жирной или аминокислоты,

n для гидрофильного лиганда составляет от около 12 до около 25% относительно количества моносахаридных остатков хитозана,

m для гидрофобного лиганда составляет от около 30 до около 60% относительно количества моносахаридных остатков хитозана.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

ФИГ.1 (1-2). Компонентный состав образцов, используемыз в экспериментальных испытаниях.

ФИГ.2 (3-4). Компонентный состав образцов, используемыз в экспериментальных испытаниях.

Фиг.3. Анализ биологических аспектов полученных наночастиц хитозана на биосовместимость, связывание с клеткой и биодеградацию.

Фиг.4. Анализ биологических аспектов полученных наночастиц хитозана на биосовместимость, связывание с клеткой и биодеградацию.

Фиг.5. Анализ биологических аспектов полученных наночастиц хитозана на биосовместимость, связывание с клеткой и биодеградацию.

Фиг.6. Анализ биологических аспектов полученных наночастиц хитозана на биосовместимость, связывание с клеткой и биодеградацию.

Фиг.7. Анализ биологических аспектов полученных наночастиц хитозана на биосовместимость, связывание с клеткой и биодеградацию.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В представленных примерах используется фракция олигосахарида хитозана со средней ММ около 23 кДа и степенью деацетилирования 85±2% (произв. Sigma Co.).

Способ получения производного хитозана включает следующие стадии:

1. Взаимодействие жирной кислоты с N-гидроксисукцинимидом в присутствии N,N′-дициклогексилкарбодиимида с получением N-окисукцинимидного эфира жирной кислоты.

N-Оксисукцинимид растворяли в 10,5 мл сухого зтилацетата, добавляли раствор КДИ (N,N′-дициклогексилкарбодиимид) в 6,3 мл этилацетата и жирную кислоту. Раствор перемешивали при КТ (комнатной температуре) в течение 15 ч. Образовавшуюся мочевину отделяли фильтрованием, этилацетат упаривали на роторном испарителе, при этом получали N-оксисукцинимидный эфир жирной кислоты в виде масла, которое хранили в холодильнике.

2. Ацилирование (25/100 МО (молекулярных остатков)) хитозана N-оксисукцинимидным эфиром жирной кислоты.

Хитозан растворяли в 1,05 мл 0,1% уксусной кислоты с добавлением 0,1 мл 0,5% уксусной кислоты и 2 мл метанола. К раствору приливали раствор N-оксисукцинимидного эфира жирной кислоты в 0,53 мл метанола. Раствор перемешивали при КТ в течение 12 часов. Метанол упаривали на роторном испарителе. Продукт высушивали на воздухе.

3. Карбоксиацилирование (30/100) янтарным ангидридом хитозана, ацилированого (25/100 МО) N-оксисукцинимидным эфиром жирной кислоты.

Хитозан, ацилированый (25/100 МО) N-оксисукцинимидным эфиром жирной кислоты, растворяли в 1 мл 0,1% уксусной кислоте с добавлением 4 мл метанола. К раствору добавляли янтарный ангидрид. Раствор перемешивали при КТ в течение 12 часов. При осаждении ацетоном наблюдали почти мгновенное выпадение рыжеватого осадка. Продукт отделяли на центрифуге. Сушили на воздухе

Альтернативно, при использовании в качестве гидрофобного лиганда аминокислоты способ включает следующие стадии:

1. Получение N-оксисукцинимидного эфира аминокислоты взаимодействием аминокислоты с HBTU (N,N,N′,N′-tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate - N,N,N′,N′-тетраметил-O-(1H-бензотриазол-1-ил)урониум гексафлюорофосфат)

Взаимодействие с HOBt (hydroxybenzotriazole)

N-Оксисукцинимид растворяли в 10,5 мл сухого этилацетата, добавляли раствор КДИ в 6,3 мл этилацетата и аминокислоту. Раствор перемешивали при КТ в течение 15 ч. Образовавшуюся мочевину отделяли фильтрованием, этилацетат упаривали на роторном испарителе, при этом получали N-оксисукцинимидный эфир аминокислоты в виде масла, которое хранили в холодильнике.

2. Ацилирование (25/100 МО) хитозана N-оксисукцинимидным эфиром аминокислоты.

Хитозан растворяли в 1,05 мл 0,1% уксусной кислоты с добавлением 0,1 мл 0,5% уксусной кислоты и 2 мл метанола. К раствору приливали раствор N-оксисукцинимидного эфира аминокислоты в 0,53 мл метанола. Раствор перемешивали при КТ в течение 12 часов. Метанол упаривали на роторном испарители. Продукт высушивали на воздухе.

3. Карбоксиацилирование (30/100) янтарным ангидридом хитозана, ацилированого (25/100 МО) N-оксисукцинимидным эфиром аминокислоты.

Хитозан ацилированый (25/100 МО) N-оксисукцинимидным эфиром аминокислоты растворяли в 3 мл 0,1% уксусной кислоте с добавлением 4 мл метанола. К раствору добавляли янтарный ангидрид. Раствор перемешивали при КТ в течение 12 часов. При осаждении ацетоном наблюдали почти мгновенное выпадение белого осадка.

Удаление Fmoc-защитной группы осуществляют стандартными методами в стандартных условиях (T=40 минут в растворе ДМФА: пиперидин 1:1 на водяной бане при 40°C); продукт промывают ацетоном и лиофильно высушивают.

Для оценки матриц использовали прибор динамического светорассеяния 90 Plus S/N, Brookhaven Instruments Corporation, США.

Для определения размера (диаметра) частиц использовали автоматическую функцию 90 Plus/BI-MAS, а для определения зета-потенциала (суммарного заряда на поверхности частицы) - ZetaPlus и 90 Plus.

Измерения проводили при pH раствора 5.0 и t=25°C

Размер (диаметр) частиц определяли для образцов R2 и R3 (см. выше) в соответствии с Фиг.1(1-2) и 2(3-4), соответственно.

Построение модели полученных частиц.

С начала исследований для получения частиц использовали хитозан молекулярной массы около 25 кДа. Подсчитали, что количество моносахаридных звеньев в молекуле такого веса составляет около 156. Используя программы пространственного молекулярного моделирования измерили, что длина в пространстве хитозанового полимера такой длины составит около 70 нм.

Соответственно, для образца R2, с экспериментальным диаметром частиц в 458 нм по формуле l=2 pr, где l - длина окружности, а r - радиус сферы наночастицы, получается l=1438 нм. Таким образом, длина окружности этих сферических наночастиц, в среднем, равна 1438 нм. Сферическая частица используемого здесь полимерного хитозана в 25 кДа с такой окружностью может существовать, и представляет собой сферу с окружностью, формируемую, в среднем, 21 полимерной цепью хитозана.

Мы не подвергаем сомнению, что матрицы R2 формируют именно сферу или близко аппроксимируемый сферой многоугольник. Сферическая форма является энергетически низкой формой существования в растворе, а каких-либо структурных особенностей матриц R2, сильно меняющих энергетические предпочтения в формировании ими сферы в растворе нет.

Для R2, пересчитывая полученные на 100 моносахаридов данные ЯМР (Фиг.1(1-2)) на исследуемый полимер 156 моносахаридов, получаем, что каждая из такой 21 полимерной цепи окружности наночастицы содержит 18 цепей жирной каприловой кислоты, обращенных внутрь наночастицы, и 45 сукцинильных цепей, обращенных в раствор.

Аналогично провели расчеты для наночастиц образца R3. Частицы из хитозана ММ 25 кДа и экспериментально полученного радиуса в 314 нм также могут существовать. При этом, для этого образца, длина окружности наночастицы-сферы составляет 986 нм, и она формируется 14 хитозановыми полимерами указанной ММ. На один хитозановый полимер (в 156 моносахаридов) образца R3 приходится около 38 каприловых остатков и 90 сукцинильных.

Результаты измерений зета-потенциала (на примере образца R3) показали, что сукцинильные цепи, как и предполагалось, выходят на внешнюю поверхность частицы, внося свой вклад отрицательного заряда в суммарный поверхностный заряд и обеспечивая растворимость частиц при физиологических pH 7.4. По проведенным итерациям получили результаты по поверхностному заряду частиц как -7, -5, -6, -1 мВ. Поверхностный заряд наночастиц хитозана, не модифицированного янтарной кислотой, находится в диапазоне от +25 до +54 мВ [11] или от +22 до +28 мВ (в настоящем исследовании, приведено ниже). Все приведенные зета-потенциалы были измерены для растворов наночастиц pH 5.0-5.5.

Анализ биологических аспектов полученных наночастиц хитозана: биосовместимость, связывание с клеткой и биодеградация.

Подготовка клеток для анализа биологических аспектов.

В работе использовали клеточные линии эпидермоидной карциномы человека A431, кератиноцитов человека НаСаТ, карциномы молочной железы человека ВТ-474. Клеточные линии НаСаТ и ВТ-474 культивировали на среде DMEM. Остальные клеточные линии культивировали на среде RPMI-1640. В среды добавляли фетальную бычью сыворотку (FBS) 8%, L-глютамин 300 мкг/мл, антибиотики ампицилин/стрептомицин 50 мкг/мл, 2-меркаптоэтанол 5×10E-5M. Клетки культивировали в CO2-инкубаторе.

Индексы ингибирования клеточной пролиферации, II, увеличивающихся титровок наночастиц на линиях клеток HEK-Т, K562 и Wnt1204 приведены на Фиг.3. Концентрации (титровки; по оси абсцисс) частиц-реагентов измерены в мкг/мл.

Анализ наночастиц на связывание с клетками и биодеградацию.

Связывание и биодеградацию наблюдали с помощью конфокальной микроскопии на конфокальном микроскопе Эклипс E2000 фирмы Никон (Япония). Микроскоп оснащен лазерами 405, 488 и 514 нм.

Для наблюдения за хитозановыми наночастицами и, для сравнения, молекулярным хитозаном с помощью конфокальной микроскопии мы пометили их флюоресцентным красителем ФИТЦ (производное флюоресцеина - изотиоционат). При проведении реакции ФИТЦ присоединяется к хитозану молекулярному или в составе наночастиц. Реакцию 50-100 мкг/мл хитозана или хитозановых частиц и 500 мкг/мл ФИТЦ проводили в кислой среде в течение 3 часов при комнатной температуре в темноте. После окончания реакции препараты диализовали в течение ночи в 0,1% растворе уксусной кислоты для удаления несвязавшегося ФИТЦ. После диализа препараты центрифугировали 10 мин. при 2000 об/мин для удаления образовавшегося нерастворимого осадка. Супернатант переносили в новую пробирку и использовали для экспериментов с клетками.

Использовали такое подобранное соотношение ФИТЦ к хитозану и частицами, чтобы свечение хитозана и частиц на конфокальном микроскопе было приблизительно адекватно их размеру и на глаз не было избыточной флюоресценции. При таком соотношении присоединение молекул ФИТЦ происходит по каждому 2-му хитозановому моносахариду в составе полимера. В программном обеспечении используемого конфокального микроскопа есть, так называемая, встроенная линейка, с помощью которой можно измерять размеры частиц или агломератов. Надо сказать, что при всей относительной точности такого метода в определении размера частиц наблюдаемые нами размеры на конфокальном микроскопе были такими же, как и при наблюдении методом светорассеяния, описанные выше.

Клетки после трипсинизации переносили на 6-луночные планшеты с вложенными в них стерильными покровными стеклами. Клетки наращивали до конфлюэнтного монослоя в питательной среде. Препараты молекулярного или наночастиц хитозана вносили в культуральную среду и инкубировали при 37°C от 1 до 48 часов. На последние 30 минут добавляли ядерный (синий) краситель Н33342 (Invitrogen) 10 мкг/мл. После этого в культуральную среду добавляли 4% параформальдегид до конечной концентрации 1% для фиксации клеток. Клетки фиксировали 30 мин при 37°C, после чего среду отмывали 2 раза в фосфатном буфере по 5 минут. Стекла осушали и наклеивали на смолу Mowiol 4.88 на предметные стекла клетками вниз.

Часовая инкубация клеток (с наночастицами хитозана вида R2: с 12 мол % остатков жирной каприловой кислоты и 30 мол % остатков янтарной кислоты) показала, что они за 1 час уже проникают внутрь клетки в соответствии с рисунком 5. Диаметр наночастиц, оцененный с помощью встроенной линейки: 0,4 мкм, т.е. 4 00 нм, т.е. такой же, как и измеренный с помощью метода светорассеяния (см. выше).

Визуализация связывания наночастиц ФИТЦ-меченых частиц с клетками А431 приведена на Фиг.4.

Ядро клетки флюоресцирует синим. Видно, что частицы проникли внутрь клетки и группируются вокруг клеточного ядра. Увеличение 2000x и 5000x и 15000x. Размеры частиц 0,3-0,4 мкм.

Для анализа биодеградации наночастиц использовали длительную 24- и 48-часовую инкубацию ФИТЦ-меченных препаратов с клетками A431, ВТ-474 и НаСаТ. За 24 ч время свечение значительно снижалось, а через 48 ч практически исчезало.

В зависимости от используемых в их составе хитозановых матриц R1, R2 или R3 (см. Таблицу 1). По картинкам с конфокального микроскопа, в соответствии, мы пришли к предварительному заключению, что проникновение в клетку, а, соответственно, затем и биодеградация в клетке для матриц R3 осуществляется в несколько более короткий временной промежуток, чем для матриц R1 и R2.

После 4-х часовой инкубации (Фиг.5, Визуализация связывания с клетками НаСаТ после 4-часовой инкубации: слева матриц R3, справа матриц R2. Увеличение 4000x), видно, что для R3 (слева) уже происходит биодеградация. Свечение ФИТЦ рассеяно, а не компактно по наночастицам. Полимерный хитозан расщеплен по отдельным моносахаридам с присоединенной флюоресцирующей молекулой ФИТЦ к каждому, которые равномерно распределяются по клеточной полости. А для R2 (справа) еще отчетливо видны наноструктуры.

После 8-часовой инкубации (Фиг.6, Визуализация связывания с клетками CHO-RFP после 8-часовой инкубации: слева матриц R3, справа матриц R1. Увеличение 1000x), видно, что для R3 (слева) биодеградация уже прошла (видно только свечение артефактных ФИТЦ молекул, не связавшихся с исследуемыми), а для R1 (справа) биодеградация хитозановых частиц продолжается - зеленое свечение ФИТЦ распределено вокруг клеточных ядер (синее свечение).

Иллюстрации соответственно Фиг.7 (Визуализация связывания с клетками CHO-RFP после 8-часовой инкубации: слева матриц R1, справа матриц R2. Увеличение 2000x) приведены, чтобы показать, что через 8 часов инкубации частицы R1 или R2 одинаково еще продолжают биодеградировать в отличие от R3, биодеградация которых закончена.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1

Получение N-оксисукцинимидного эфира, каприловой кислоты.

N-Оксисукцинимид (367 мг, 3,18 ммоль) растворяли в 10,5 мл сухого этилацетата, добавляли раствор КДИ (639 мг, 3,18 ммоль) в 6,3 мл этилацетата и каприловую кислоту (458 мг, 3,18 ммоль). Раствор перемешивали при КТ в течение 15 ч. Образовавшуюся мочевину отделяли фильтрованием, этилацетат упаривали на роторном испарителе, при этом получали N-оксисукцинимидный эфир каприловой кислоты в виде масла, которое хранили в холодильнике.

Ацилирование (25/100 МО) хитозана N-оксисукцинимидным эфиром каприловой кислоты.

Хитозан (23 мг, 1 ммоль) растворяли в 1,05 мл 0,1% уксусной кислоты с добавлением 0,1 мл 0,5% уксусной кислоты и 2 мл метанола. К раствору приливали раствор N-оксисукцинимидного эфира каприловой кислоты (7,3, мг, 30 ммоль) в 0,53 мл метанола. Раствор перемешивали при КТ в течение 12 часов. Метанол упаривали на роторном испарители. Продукт высушивали на воздухе.

Карбоксиацилирование (30/100) янтарным ангидридом хитозана ацилированого (25/100 МО) N-оксисукцинимидным эфиром каприловой кислоты.

Хитозан ацилированый (25/100 МО) N-оксисукцинимидным эфиром каприловой кислоты (29,7 мг, 0,7 ммоль) растворяли в 1 мл 0,1% уксусной кислоте с добавлением 4 мл метанола. К раствору добавляли янтарный ангидрид (3,7 мг, 36,9 ммоль). Раствор перемешивали при КТ в течение 12 часов. При осаждении ацетоном наблюдали почти мгновенное выпадение рыжеватого осадка. Продукт отделяли на центрифуге. Сушили на воздухе.

ПРИМЕР 2

Получение N-оксисукцинимидного эфира Nα-трет-бутоксикарбонил-L-валина.

N-Оксисукцинимид (367 мг, 3,18 ммоль) растворяли в 10,5 мл сухого этилацетата, добавляли раствор КДИ (639 мг, 3,18 ммоль) в 6,3 мл этилацетата и Nα-трет-бутоксикарбонил-L-валин (690 мг, 3,18 ммоль). Раствор перемешивали при КТ в течение 15 ч. Образовавшуюся мочевину отделяли фильтрованием, этилацетат упаривали на роторном испарителе, при этом получали N-оксисукцинимидный эфир Nα-трет-бутоксикарбонил-L-валина в виде масла, которое хранили в холодильнике.

Ацилирование (25/100 МО) хитозана N-оксисукцинимидным эфиром Nα-трет-бутоксикарбонил-L-валина.

Хитозан (23 мг, 1 ммоль) растворяли в 1,05 мл 0,1% уксусной кислоты с добавлением 0,1 мл 0,5% уксусной кислоты и 2 мл метанола. К раствору приливали раствор N-оксисукцинимидного эфира Nα-трет-бутоксикарбонил-L-валина (9,48, мг, 30 ммоль) в 0,53 мл метанола. Раствор перемешивали при КТ в течение 12 часов. Метанол упаривали на роторном испарители. Продукт высушивали на воздухе.

Карбоксиацилирование (30/100) янтарным ангидридом хитозана ацилированого (25/100 МО) N-оксисукцинимидным эфиром Nα-трет-бутоксикарбонил-L-валина.

Хитозан ацилированый (25/100 МО) N-оксисукцинимидным Nα-трет-бутоксикарбонил-L-валина (20,7 мг, 0,7 ммоль) растворяли в 3 мл 0,1% уксусной кислоте с добавлением 4 мл метанола. К раствору добавляли янтарный ангидрид (3,7 мг, 36,9 ммоль). Раствор перемешивали при KT в течение 12 часов. При осаждении ацетоном наблюдали почти мгновенное выпадение белого осадка. Продукт отделяли на центрифуге. Сушили на воздухе.