Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ПРЕЭКЛАМПСИИ У БЕРЕМЕННЫХ С ХРОНИЧЕСКОЙ АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТЕНЗИЕЙ

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и может быть использовано для диагностики преэклампсии у беременных женщин с хронической артериальной гипертензией в сроки гестации 24-37 недель.

Актуальность проблемы вызвана необходимостью поиска критериев присоединения преэклампсии у женщин с хронической артериальной гипертензией для разработки адекватной тактики ведения беременных женщин с гипертензивными расстройствами.

Сложности диагностики преэклампсии у беременных с хронической артериальной гипертензией могут определяться несколькими причинами. В ряде случаев на фоне исходно высокого артериального давления клинически не всегда удается отметить начало развития преэклампсии, когда еще отсутствует протеинурия и церебральная симптоматика и лишь периодически отмечается нестабильность артериального давления и недостаточный эффект гипотензивной терапии. С другой стороны, снижение артериального давления на протяжении первого и второго триместра на фоне гипотензивной терапии либо за счет физиологических изменений сердечно-сосудистой системы при беременности могут приводить к тому, что уровень артериального давления у многих женщин с хронической гипертензией остается в пределах нормальных значений, создавая впечатление о благоприятном течении беременности.

Поэтому одной из главных задач в определении тактики ведения и своевременного начала лечения преэклампсии у беременных с хронической артериальной гипертензией является выявление дополнительных диагностических критериев данного осложнения беременности.

В настоящее время существуют методы, позволяющие осуществлять диагностику преэклампсии. Однако большинство из них не учитывают наличие у беременной женщины хронической артериальной гипертензии.

Известен способ диагностики преэклампсии на основе определения концентрации гормонов лептина и грелина в венозной крови методом иммуноферментного анализа (RU 2476880 C1, Шкурат Т.П. и др., 27.02.2013). При увеличении концентрации гормона лептина в сыворотке крови более 37,89 нг/мл и одновременном снижении концентрации гормона грелина в плазме крови ниже 0,26 нг/мл диагностируют гестоз тяжелой степени. Недостатком метода является то, что возможна диагностика преэклампсии только тяжелой степени. Кроме того, повышение уровня лептина может быть ассоциировано с наличием ожирения, метаболического синдрома, сахарного диабета и эссенциальной артериальной гипертензии (Тендерные особенности концентрации лептина и внутрипочечной гемодинамики у больных эссенциальной артериальной гипертензией и ожирением. / В.И. Подзолков, А.Е. Брагина, Ю.Н. Родионова // Системные гипертензии. - 2011. - №2. - С. 42-46), что может способствовать гипердиагностике преэклампсии.

Имеется способ диагностики гестоза путем определения уровня альфа-амилазы в сыворотке крови количественным методом (RU 2426129 C1, Гребенкин Б.Е. и др., 10.08.2011). При уровне альфа-амилазы 28-100 Ед./л диагностируют нетяжелый гестоз. При уровне альфа-амилазы >100 Ед./л устанавливают гестоз тяжелой степени. К недостаткам способа следует отнести возможность получения высоких значений альфа-амилазы и, следовательно, ложноположительного результата при наличии заболеваний поджелудочной железы, а также невозможность проведения дифференциальной диагностики гипертензивных расстройств у беременных.

Существует способ дифференциальной диагностики артериальной гипертензии при беременности (RU 2429784 C1, И.Б. Фаткуллина и др., 27.09.2011). Этот способ позволяет диагностировать гипертензию, связанную с беременностью, и хроническую артериальную гипертензию при исследовании ряда функциональных и лабораторных показателей в третьем триместре беременности. С этой целью у беременных в 3 триместре определяют следующие показатели: X1 - рост в см; Х2 - индекс резистентности в правой маточной артерии; Х3 - индекс резистентности в левой маточной артерии; Х4 - содержание общего белка крови в г/л; Х5 -уровень креатинина плазмы крови в мкмоль/л; Х6 - уровень щелочной фосфатазы плазмы крови в Е/л; Х7 - количество тромбоцитов в периферической крови на 109/л; Х8 - концентрация растворимых фибринмономерных комплексов в крови в мг/100 мл; Х9 - индекс измерений систолического артериального давления в ночное время в %; Х10 - величина утреннего подъема диастолического артериального давления в мм рт.ст. Далее рассчитывают диагностические коэффициенты F1 и F2 по формулам. При значениях F1 больше F2 диагностируют гипертензию, связанную с беременностью, при F2 больше F1 - хроническую артериальную гипертензию.

Недостатками способа являются: значительная вариабильность ряда параметров, используемых при расчете диагностических коэффициентов; изменение ряда показателей, используемых при расчете диагностических коэффициентов (общий белок, креатинин), отмечается в основном при тяжелых формах гестоза (Айламазян Э.К., Мозговая Е.В. Гестоз: теория и практика. - М.: МЕДпресс-информ, 2008. - 272 с.; Артериальная гипертония беременных: механизмы формирования, профилактика, подходы к лечению / А.Л. Верткин, Л.Е. Мурашко, О.Н. Ткачева, И.В. Тумбаев // Российский кардиологический журнал. - 2003. - №6. - С. 59-65), что может определять снижение чувствительности предлагаемого способа при выявлении легких и средних форм заболевания; проведение суточного мониторинга АД отсрочивает правильную постановку диагноза; способ чрезвычайно трудоемок - требует определения 10 показателей и трудозатрат 4 врачей (двух врачей-лаборантов, врача функциональной диагностики, врача ультразвуковой диагностики), что значительно повышает себестоимость исследования.

Наиболее близким по техническому решению к заявляемому способу является «Способ диагностики преэклампсии у беременных с хронической артериальной гипертензией» (Патент РФ №2483311. Способ диагностики преэклампсии у беременных с хронической артериальной гипертензией / Макаров О.В., Богатырев Ю.А., Осипова Н.А. // Изобретения. Полезные модели. - 2013. - №15). Указанный способ выбран в качестве прототипа. Он позволяет диагностировать преэклампсию у беременных с хронической артериальной гипертензией в сроки 24-40 недель. С этой целью у беременных с помощью твердофазного иммуноферментного анализа сыворотки крови определяют содержание аутоантител класса IgG к двуспиральной ДНК, антигенам мембран тромбоцитов TrM-001-15 и TrM-015-12, антигенам почечной ткани KiM-05-300 и KiS-07-120 и антигену митохондрий печени НММР. Для каждого вида исследованных антител определяют соотношение аутоантител в опытной сыворотке к контрольной сыворотке. При показателе, меньшем или равном 0,55 по меньшей мере для трех видов аутоантител, один из которых относится к антителам к почечной ткани, а другой - к двуспиральной ДНК, диагностируют преэклампсию. Недостатками способа-прототипа являются: необходимость исследования 6 показателей; диагностическая значимость возможна при изменении уровня по меньшей мере трех видов аутоантител; присутствие этих антител так же может быть специфично для многих аутоиммунных заболеваний - диффузных болезней соединительной ткани (Possible novel biomarkers of organ involvement in systemic lupus erythematosus / D. Su, R. Liu, X. Li, L. Sun // Clin Rheumatol. - 2014 Mar 6.), аутоиммунной тромбоцитопении (McMillan R., Imbach P.A. Immune thrombocytopenic purpura. In: Loscaizo J., Schafer A.I., eds. Thrombosis and Hemorrhage. Boston: Blackwell Scientific; 1994:575-95.), гломерулонефритов и пиелонефритов (Мальцев C.B. Роль аутоиммунных нарушений в патологии человека / Мальцев C.B., Мансурова Г.Ш. // практическая медицина. - 2010. - №6. - с. 7-13) аутоиммунных поражений и хронических заболеваний печени (Primary biliary cirrhosis: a multi-faced interactive disease involving genetics, environment and the immune response / R. Uibo, C.Y. Yang; K.E. Kisand; M.E. Gershwin // APMIS: acta pathologica, microbiologica, et immunologica Scandinavica. - 2012; 120(11):857-871.); кроме того в тексте не приводятся данные о чувствительности и специфичности этого способа диагностики, не известна точность способа.

Техническим результатом патентуемого способа является повышение точности, расширение арсенала диагностических средств и упрощение определения преэклампсии у беременных с хронической артериальной гипертензией.

Заявляемый технический результат достигается тем, что у беременных с хронической артериальной гипертензией в сроки гестации 24-37 недель в периферической венозной крови определяют показатель относительного содержания CD49b+клеток в популяции нейтрофилов. При значении показателя равном или более 73% у беременной диагностируют присоединение преэклампсии.

Новизна заявляемого способа заключается в том, что впервые предлагается диагностировать преэклампсию у беременных с хронической артериальной гипертензией по определению в периферической венозной крови беременной женщины относительного содержания CD49b+ клеток в популяции нейтрофилов.

В литературе имеются данные об экспресии молекул CD49b различными клетками при хроническом гепатите С (CD49b, a major marker of regulatory t-cells type 1, predicts the response to antiviral therapy of recurrent hepatitis С after liver transplantation / Fabien S. [et al.] // Biomed Res Int. Epub 2014 Jan 19), миелодиспластическом синдроме (Serine protease inhibitor kunitz-type 2 is downregulated in myelodysplastic syndromes and modulates cell-cell adhesion / Roversi F.M. [et al.] // Stem Cells Dev. 2014 Feb 18), раке молочной железы (Martin, T.A. Evaluation of the expression of stem cell markers in human breast cancer reveals a correlation with clinical progression and metastatic disease in ductal carcinoma / Martin T.A., Jiang W.G. // Oncol Rep.Epub 2013 Oct 24). Однако при преэклампсии показатель содержания CD49b+ нейтрофилов ранее не изучался.

Исследованиями последних лет было установлено, что в основе иммунных механизмов хронической артериальной гипертензии лежит накопление Т-клеток, В-клеток и макрофагов в адвентиции и периваскулярной жировой ткани сосудов в результате процесса экстравазации (Harrison D.G., Marvar P.J., Titzel J.M. / Vascular inflammatory cells in hypertension // Frontiers Physiology. - 2012 May 7;3:128.). Патологические эффекты этих клеток при гипертензии определяются продукцией реактивных форм кислорода и цитокинов, что приводит к повреждению эндотелиоцитов (Sprague А.Н., Khalil R.A. Inflammatory Cytokines in Vascular Dysfunction and Vascular Disease // Biochem Pharmacol. 2009 September 15; 78(6): 539-552.).

Роль нейтрофилов в патогенезе гипертензии в настоящее время остается не ясной. Экспрессия интегрина CD49b является критической для процесса экстравазации полиморфноядерных нейтрофилов и их мобилизации в ткани, окружающие сосуды (Integrin alpha(2)beta(1) (VLA-2) is a principal receptor used by neutrophils for locomotion in extravascular tissue / Werr J., Johansson J., Eriksson E.E., Hedqvist P., Ruoslahti E., Lindbom L. // Blood. - 2000). Молекулы CD49b экспрессируются только на поздних этапах активации нейтрофилов. Высокий уровень CD49b+ клеток в популяции нейтрофилов у женщин с хронической артериальной гипертензией при присоединении преэклампсии может быть обусловлен длительным характером активации иммунной системы матери факторами плодово-плацентарного происхождения, что вызывает усиление экспрессии данных адгезионных молекул нейтрофилами.

Способ осуществляется следующим образом:

1) У беременной женщины однократно производят забор венозной крови из локтевой вены, 100 мкл гепаринизированной венозной крови инкубируют с 5 мкл моноклональных анти-CD49b, меченных FITC в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте, после чего лизируют эритроциты стандартными растворами фирм-производителей (OptiLyse В, Beckman Coulter; FACS Lysing Solution, BD Biosciences и др.). Клетки отмывают 1 раз 1 мл физиологического раствора центрифугированием при 1500 об/мин в течение 2 минут и ресуспендируют в 500 мкл физиологического раствора. Учет реакции проводят на проточном цитометре, определяя относительное содержание CD49b+ клеток в нейтрофильном гейте. Результат читается в процентах (%). Время проведения исследования составляет 1 час.

Использование предлагаемого способа позволяет с высокой точностью - 90,2%, чувствительностью - 88,2%, специфичностью - 91,7% определить присоединение преэклампсии у беременных с хронической артериальной гипертензией.

Отличительными признаками способа являются:

- выявлен пограничный критерий относительного содержания CD49b+ клеток в популяции нейтрофилов, при значении которого равном или более 73% диагностируют присоединение преэклампсии.

Сущность заявляемого способа поясняется следующими примерами:

Пример 1. Женщина Р. 42 лет, беременность 37 недель, на приеме у врача в женской консультации. В соматическом анамнезе - наличие хронической артериальной гипертензии в течение последних 5 лет, хронический пиелонефрит. Исходное артериальное давление при постановке на учет - 140/100 мм рт.ст., получает гипотензивную терапию (допегит), на фоне которой артериальное давление в пределах 130/80-140/90 мм рт.ст. При осмотре артериальное давление 140/100 мм рт.ст., в общем анализе мочи - протеинурия 0,3 г/л. При обследовании заявленным способом было установлено, что показатель содержания CD49b+ клеток в популяции нейтрофилов составил 73%. В данном случае диагностирована преэклампсия на фоне хронической артериальной гипертензии. Женщина направлена в стационар, где была назначена комбинированная гипотензивная терапия, магнезиальная терапия. На вторые сутки - артериальное давление в пределах 130/80-140/90 мм. рт.ст., суточная протеинурия 0,6 г/л. При ультразвуковом исследовании - признаки плацентарной недостаточности, задержки развития плода, по данным кардиотокографии - снижение компенсаторных возможностей плода. В динамике на фоне лечения - нарастание протеинурии. Учитывая наличие преэклампсии, отсутствие эффекта проводимой терапии и внутриутробное страдание плода, принято решение о подготовке беременной к досрочному родоразрешению.

Пример 2. Женщина Г. 38 лет, беременность 24 недели. Поступила в отделение патологии беременности. Страдает гипертонической болезнью в течение 8 лет. При беременности АД в пределах 130/90-140/90 мм рт.ст., у терапевта и кардиолога не наблюдалась, гипотензивная терапия не проводилась. При поступлении - артериальное давление 150/100 мм рт.ст., в моче - следы белка. При обследовании заявленным способом было установлено, что показатель содержания CD49b+ клеток в популяции нейтрофилов составил 42%, диагностирована хроническая артериальная гипертензия. Беременной была назначена гипотензивная терапия (допегит). За время наблюдения артериальное давление стабилизировалось на значениях 120/80-130/90 мм рт.ст., протеинурия в динамике не выявлена, состояние плода по данным дополнительного обследования - удовлетворительное. Беременность пролонгирована, женщина выписана под динамическое диспансерное наблюдение в стабильном удовлетворительном состоянии.

Пример 3. Пациентка К., 31 год, беременность 32 недели. Поступила в акушерский стационар с жалобами на высокое артериальное давление. Периодическое повышение артериального давления отмечает с 17 лет (до 150/100 мм рт.ст.), постоянной терапии вне беременности не получала. При беременности с ранних сроков периодически отмечается повышение артериального давления до 150/110 мм рт.ст., гипотензивные препараты принимала только при высоких значениях артериального давления. При поступлении - артериальное давление - 150/100 мм рт.ст., протеинурия в разовой порции мочи - 0,066 г/л. При обследовании заявленным способом было установлено, что показатель содержания CD49b+ клеток в популяции нейтрофилов составил 80,5%. В данном случае диагностирована преэклампсия на фоне хронической артериальной гипертензии. Женщине назначена комбинированная гипотензивная терапия, магнезиальная терапия, начата профилактика респираторного дистресс-синдрома плода. На фоне лечения сохранялось высокое артериальное давление, нарастала протеинурия, по данным кардиотокографии и допплеровского исследования отмечено ухудшение состояния плода. В связи с отсутствием эффекта от проводимой терапии и ухудшением внутриутробного состояния плода принято решение о досрочном родоразрешении.

Указанным способом проведено обследование 41 беременной женщины с хронической артериальной гипертензией. У 24 из обследованных женщин содержание CD49b+ клеток в популяции нейтрофилов было равно или более 73%, что соответствовало диагностическому критерию преэклампсии на фоне хронической артериальной гипертензии. При этом ложноположительный результат получен в 2 случаях из 24. У 17 женщин содержание CD49b+ нейтрофилов было менее 73%, что соответствовало отсутствию преэклампсии при наличии хронической артериальной гипертензии; у 2 женщин из 17 при обследовании был получен ложноотрицательный результат.

Точность диагностики преэклампсии у женщин с хронической артериальной гипертензией составила 90,2%, чувствительность - 88,2%, специфичность - 91,7%.

Данные исследований приведены в таблице 1.

Преимущества заявляемого способа:

1. высокая точность, чувствительность и специфичность;

2. небольшой временной интервал выполнения исследования;

3. простота и доступность выполнения методики;

4. экономическая эффективность по расходу реактивов и трудозатратам специалистов.