Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ ПРОЛАПСА ГЕНИТАЛИЙ У ЖЕНЩИН С РОДОВЫМИ ТРАВМАМИ В АНАМНЕЗЕ

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, и может быть использовано для прогнозирования повышенного риска развития пролапса гениталий у женщин с родовыми травмами в анамнезе.

Пролапс тазовых органов (ПТО) является наиболее частой патологией тазового дна. В нашей стране данное заболевание наблюдается у 15-30% женщин, а в возрасте старше 50 лет этот показатель возрастает до 40% (Буянова С.Н., Щукина Н.А., Журавлева А.С. Эффективность использования сетчатых протезов при осложненных формах пролапса гениталий. Российский вестник акушера-гинеколога 1, 2009, с. 76-81). ПТО - заболевание полиэтиологичное, и в его развитии важную роль играют физические, генетические и психологические факторы. Одной из ключевых причин данного заболевания называют родовую травму как естественного (разрыв промежности), так и хирургического характера (наложение акушерских щипцов, эпизио- и перинеотомия, вакуум-экстракция плода) (Albers L.L., Anderson D., Cragin L. et al. Factors related to perineal trauma in childbirth. J Nurse Midwifery 1996; 41: 4: 269-276. Bodner K., Bodner-Adler B., Wagenbichler P. et al. Perineal lacerations during spontaneous vaginal delivery. Wien klin Wschr 2001; 113: 19: 743-746; Handa VL, Blomquist JL, Knoepp LR, Hoskey KA, McDermott КС, Munoz A. Pelvic floor disorders 5-10 years after vaginal or cesarean childbirth. Obstet Gynecol 2011; 118: 777-84).

В настоящее время есть несколько способов прогнозирования повышенного риска развития ПГ у женщин. Так, Ящук А.Г. с соавт. предложили способ прогнозирования вероятности формирования постгистерэктомического пролапса (ПГП) гениталий (патент RU 2341181 C1 от 20.12.2008), основанный на оценке ряда критериев: возраст впервые возникшего ПГП; возраст менопаузы; длительность постменопаузального периода; паритет; наличие в анамнезе хронических бронхо-легочных заболеваний, связанных с хроническим кашлем; наличие в анамнезе ПТО у родственников первой линии родства; возраст на момент гистерэктомии; определяют наличие признаков дисплазии соединительной ткани, оценивая степени ее выраженности по шкале Смольновой Т.Ю.; наличие ПТО до гистерэктомии; уровень суточной экскреции оксипролина. Полученные анамнестические данные и результаты обследования подставляют в математические прогностические модели, по большему из полученных коэффициентов прогнозируют вероятность развития ПГП гениталий.

Недостатком данного способа является прогнозирование лишь предрасположенности к ПТО после гистерэктомии, что не дает возможность прогнозировать риск развития заболевания при отсутствии каких-либо симптомов патологии.

Также известен способ профилактики развития пролапса гениталий после гистерэктомии, разработанный Ильиной И.Ю. с соавт. (патент RU 2461826 C1 от 25.02.2011). Данный подход заключается в определении содержания в крови C-концевых телопептидов, оксипролина и пирилинкс-D в моче, являющихся биохимическими маркерами распада только коллагена I типа. При содержании C-концевых телопептидов больше 0,6 нг/мл, оксипролина более 180 ммоль/л, пирилинкс-D больше 8 нмоль ДПИД/моль креатинина выполняют гистерэктомию влагалищным доступом с дополнительной фиксацией связочного аппарата матки. Способ позволяет уменьшить риск развития генитального пролапса в послеоперационном периоде. Однако данный подход основан на выявлении повреждений лишь части только коллагеновых волокон, но не эластического волокна. Также остается неизвестным катаболизм какого коллагена определяют.

Способ ранней диагностики развивающегося пролапса тазовых органов у женщин репродуктивного возраста при отсутствии клинических признаков (патент RU 2498308 C1, Камоева С.В. и др. от 10.11.2013), который заключается в отборе материала ткани стенки влагалища, проведении гистохимического анализа, определении количества и состояния эластиновых фибрилл, содержания матриксных белков LOXL1 и FBLN5. Развивающийся пролапс тазовых органов диагностируют при снижении количества эластических волокон, их фрагментации и при одновременном уменьшении содержания матриксных белков FBLN5, LOXL1 в эпителии, эндотелии сосудов, фибробластах, экстрацеллюлярном матриксе по отношению к одноименным показателям у здоровых женщин. Недостатком данного способа является ранняя диагностика начинающегося ПТО, а не его прогнозирование.

Описан способ прогнозирования десценции тазового дна, который основан на выявлении полиморфизма гена интерстициального коллагена Col3AI (RU 2310849 C1, Ящук А.Г. и др., 20.11.2007 - прототип). После выделения ДНК из лейкоцитов периферической венозной крови методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК амплифицируют фрагменты локусов Alu и VNTR гена коллагена 3 типа. При выявлении генотипов Alu -/- с отсутствием инсерции и VNTR*2*2 аллеля, прогнозируют риск развития тазовой десценции у обследуемых.

Однако в прототипе в качестве негенетических факторов риска, учтенных в логистическом регрессионном анализе, указаны следующие ковариаты: гипермобильность суставов, варикозное расширение вен нижних конечностей, костные нарушения, наследственная отягощенность. Между тем хорошо известно, что наибольшей специфичностью относительно риска развития ПТО являются такие факторы, как возраст и повреждения мягких родовых путей во время родов. Кроме того, предложенный способ основан на выявлении полиморфных вариантов в генах, контролирующих процессы формирования коллагенового, но не эластического волокна в структурах соединительной ткани.

Задача настоящего изобретения - разработка способа прогнозирования риска развития ПТО у женщин с родовыми травмами в анамнезе.

Диагностика риска развития ПТО у женщин заключается в отборе биоматериала для выделения ДНК и проведении генотипирования ДНК методом тетра-праймерной аллель-специфической ПЦР реакции с целью выявления полиморфизма гена FBLN5 по сайтам rs12586948, rs2018736, rs12589592 и rs2474028. Высокую степень риска развития пролапса гениталий прогнозируют при наличии совокупности генотипов rs12586948-A/*, rs2018736-C/*, rs12589592-G/G и rs2474028-T/*, а низкую степень риска - при наличии совокупности генотипов rs12586948-G/G, rs2018736-A/A, rs12589592-A/A и rs2474028-C/C.

Технический результат - выявление объективных и информативных критериев прогнозирования высокого риска развития ПТО у женщин с родовыми травмами в анамнезе.

В формировании ПТО решающую роль играет не столько количество родов, сколько их особенности. Риск развития заболевания, по их мнению, увеличивается при осложненном течении беременности и родов, в том числе при стремительных родах, разрывах промежности, наложении акушерских щипцов, вакуум-экстракции плода, эпизио- и перинеотомии, способствуя перерастяжению и повреждению тканей связочного аппарата матки и тазового дна (Fritel X, Ringa V, Varnoux N, Zins M, Bréart G. Mode of delivery and fecal incontinence at midlife: a study of 2,640 women in the Gazel cohort. Obstet Gynecol. 2007 Jul; 110(1): 31-8; Handa VL, Blomquist JL, McDermott KC, Friedman S, Muñoz A. Pelvic floor disorders after vaginal birth: effect of episiotomy, perineal laceration, and operative birth. Obstet. Gynecol. 2012, 119, 233-239). Исследования показали, что ключевым, решающим фактором для восстановления поддерживающих структур после вагинальных родов является синтез и объединение эластических волокон стенки влагалища (Nguyen A.D., Itoh S., Jeney V., Yanagisawa H., Fujimoto M., UshioFukai M., Fukai T. Fibulin-5 is a novel binding protein for extracellular superoxide dismutase. Circ Res 2004; 95: 1067-1074). Важную роль в данном процессе играет белок соединительной ткани фибулин 5 (FBLN5). В экспериментальных исследованиях показана роль FBLN5 в аномальном эластогенезе, увеличении протеазной активности и ослаблении «поддержки» тазовых органов (Drewes PG, Yanagisawa Н, Starcher B, Hornstra IK, Csiszar K, Marinis SI, Keller P, Word RA. Pelvic organ prolapse in Fibulin-5 knockout mice: pregnancy changes in elastic fiber homeostasis in mouse vagina. Am J Pathol 2007; 170: 578-589). Таким образом, ген FBLN5 может рассматриваться как один из наиболее перспективных для изучения в качестве гена предрасположенности к ПТО.

Ген FBLN5 не имеет известных функциональных полиморфных вариантов, для которых была бы показана устойчивая ассоциация с экспрессией гена и заболеваниями соединительной ткани (Badger SA, Soong CV, O′Donnell ME, Sharif MA, Makar RR, Hughes AE. Common polymorphisms of Fibulin-5 and the risk of abdominal aortic aneurysm development. Vase Med. 2010 Apr; 15(2): 113-7). Для ассоциативного исследования ПТО выбор сайтов для генотипирования был основан на использовании ресурса HaploView (version 4.2) для подбора таргетных SNP (tagSNP) с целью покрытия всего гена. На фигуре 1 показана гаплотипическая структура гена FBLN5 с указанием количества блоков и силой их сцепления, а также имеющиеся tagSNP для каждого блока. Ген включает девять блоков сцепления, в каждом из которых было прогенотипировано по одному из таргетных SNP. Список прогенотипированных SNP с указанием соответствующего блока сцепления и идентификационного номера в dbSNP приведен в таблице 1. Методом тетра-праймерной аллель-специфической ПЦР реакции нами было исследовано распределение частот аллелей таргетных однонуклеотидных вариантов FBLN5 у пациенток с ПТО и у здоровых женщин. Обе группы состояли из женщин с травмами мягких родовых путей и были аналогичны по факторам риска (возраст, ИМТ, репродуктивный, пременопаузальный период или постменопауза, количество родов через естественные родовые пути). Статистическая обработка данных основывалась на множественном регрессионном анализе с учетом в качестве ковариат факторов риска.

Все изученные варианты находились в состоянии равновесия по Харди-Вайнбергу. Минорные аллели rs12586948-A, rs2018736-C и rs2474028-T чаще встречались у женщин с ПГ по сравнению с контрольной группой, а также был обнаружен протективный эффект аллеля rs12589592-A, который встречался чаще у здоровых женщин (множественный регрессионный анализ: доминантная модель, P=0.047, OR=1.83, 95% ДИ: 1.00-3.35; P=0.0033, OR=2.52, 95% ДИ: 1.35-4.71; P=0.028, OR=1.96, 95% ДИ: 1.07-3.59; рецессивная модель, Р=0.0018, OR=0.27, 95% ДИ: 0.11-0.64, соответственно; Таблица 2). Гаплотип rs12586948(A) - rs2018736(C) - rs12589592(G) - rs2474028(T) при частоте встречаемости 16.12%) характеризовался значимостью эффекта: P=0.0079, OR=3.51, 95% ДИ: 1.40-8.78.

В протокол обследования включается генотипирование на предмет выявления полиморфных вариантов гена FBLN5 (rs12586948, rs2018736, rs12589592 и rs2474028), которое проводится в один этап на стандартном оборудовании для ПЦР-лаборатории. Образцы крови собирают в вакутейнеры, содержащие ЭДТА, и хранят при -(20-80)°C до выделения ДНК. Для генотипирования ДНК выделяют из цельной крови с помощью наборов Diatom DNA Prep 200, основанных на использовании гуанидинтиоционата и Nucleus-сорбента (Isogene Lab. Ltd, Россия). Для проведения ПЦР реакции используют лиофилизированные готовые наборы Master Mix (Фирма Изоген), в которые добавляют 10 мкл ПЦР-растворителя (Фирма Изоген), 3 мкл праймеров (оптическая плотность 3-4 о.е.), 2 мкл деионизованной воды, 5 мкл исследуемой ДНК. Праймеры и условия ПЦР реакции описаны в таблице 3. Амплификацию проводят в амплификаторе Applied Biosystems 9700 (GeneAmp® PCR System 9700). Визуализацию результатов осуществляют в 2% агарозном геле с добавлением бромистого этидия.

В нижеследующих примерах приведены доказательства возможности реализации заявленного назначения и достижения указанного технического результата

Обе группы состояли из женщин с травмами мягких родовых путей в анамнезе и были аналогичны по факторам риска (возраст, ИМТ, репродуктивный период или пременопауза/постменопауза, количество родов естественным путем). Статистическая обработка данных основывалась на множественном регрессионном анализе с учетом в качестве ковариат факторов риска.

Пример 1. Пациентка из основной группы (образец №65)

- пременопаузальный период (49 лет),

- не занималась тяжелым физическим трудом,

- без вредных привычек,

- 1 роды, вес ребенка менее 4 кг, во время родов проведена эпизиотомия,

- опущение стенок влагалища 2 ст.

Пациентка являлась носительницей рисковых генотипов по 4 сайтам гена FBLN5 (rs12586948-G/A, rs2018736-C/A, rs12589592-G/G, rs2474028-C/T), ассоциированных по результатам исследования с наследственной предрасположенностью к ПГ у женщин с травмами мягких родовых путей.

Пример 2. Пациентка из основной группы (образец №316)

- постменопаузальный период (58 лет),

- не занималась тяжелым физическим трудом,

- без вредных привычек,

- 2 родов, ребенок (дети) до 4 кг, в анамнезе разрыв промежности и перинеотомия,

- ПТО 3 степени (POP-Q).

Пациентка являлась носительницей рисковых генотипов по 4 сайтам гена FBLN5 (rs12586948-G/A, rs2018736-C/C, rs12589592-G/G, rs2474028-T/T), ассоциированных по результатам исследования с наследственной предрасположенностью к ПГ женщин с мягкими перинеальными травмами.

Пример 3. Пациентка из контрольной группы (образец №228)

- постменопаузальный период (57 лет),

- не занималась тяжелым физическим трудом,

- без вредных привычек,

- 3 родов, ребенок (дети) более 4 кг, в анамнезе разрыв промежности и эпизиотомия.

Пациентка является гомозиготной носительницей протективных аллелей по 4 сайтам гена FBLN5 (rs12586948-G/G, rs2018736-A/A, rs12589592-A/A, rs2474028-C/C), ассоциированных по результатам исследования со снижением риска формирования ПТО у женщин с травмами мягких родовых путей.

Таким образом, высокую степень риска развития ПТО у женщин с перинеальными травмами возможно прогнозировать при выявлении аллелей однонуклеотидных вариантов гена FBLN5 rs12586948-A, rs2018736-C, rs12589592-G, rs2474028-T, а пониженную степень риска - при наличии аллелей rs12586948-G, rs2018736-A, rs12589592-A, rs2474028-C.

Патентуемый способ позволяет выявить пациенток с высокой степенью риска развития ПТО для проведения своевременных и целенаправленных мероприятий по профилактике развития данной патологии.