СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗНОЙ ИНФЕКЦИИ

Изобретение относится к медицине, а именно к фтизиатрии и лабораторной диагностике, и может быть использовано для диагностики туберкулезной инфекции при сложно интерпретируемых результатах кожных проб in vivo путем определения иммунного ответа in vitro на антигены (гаптены), используемые для кожных проб.

Известен способ диагностики туберкулезной инфекции по внутрикожной пробе Манту 2ТЕ, суть которого заключается в том, что положительная проба Манту является фактом наличия в организме микобактерий туберкулеза (1).

Недостатком данного способа является наличие положительного результата у людей как вакцинированных вакциной BCG, так и инфицированных микобактериями человеческого типа, что осложняет дифференциальную диагностику послевакцинной и инфекционной аллергии. При получении пробы инфекционного характера, пациент направляется в диспансер, где ему проводятся дополнительные обследования.

Известен способ диагностики туберкулезной инфекции с помощью внутрикожной пробы Диаскинтест. Проба Диаскинтест положительна только в случае активно размножающихся микобактерий человеческого типа (2, 3).

Недостаток этого способа в том, что он идентифицирует микобактерии человеческого вида в фазе активного размножения. Однако результат может быть сомнительным или отрицательным при доказанных случаях туберкулеза с бактериовыделением и при внелегочном туберкулезе, также может быть отрицательным в начальной стадии заболевания (4).

Известны диагностические тест-системы на основе аналогов микобактериальных антигенов синтетических пептидов белка ESAT-6 (IGRA, ELISPOT, CLINISPOT-TB) для диагностики туберкулеза, отличающиеся только фирмами-производителями. В основе таковых лежит определение количества высвобождающегося ИФН-γ при контакте эффекторных Т-лимфоцитов со специфическими антигенами ESAT-6 в тест-системе in vitro. Увеличение продукции ИФН-γ свидетельствует об инфицировании МБТ, а ее отсутствие - о вакцинации или ревакцинации вакциной БЦЖ (5, 6).

Недостатками данного метода является сложность лабораторного исследования и наличие высококвалифицированного персонала, дороговизна. Основными недостатками этого теста является то, что результат может быть положительным только при инфицировании и активном размножении в организме микобактерий, содержащих ESAT-6 и CFP-10, и отрицательный - при их отсутствии. Кроме того, здесь используются антигены, не идентичные по изготовлению антигенам, находящимся в препарате Диаскинтест для кожных проб.

Известен способ диагностики туберкулезного инфицирования, суть которого состоит в том, что цельную гепаринизированную кровь инкубируют в пробирках с микобактериальными антигенами (смесью белков ESAT-6, CFP-10 и ТВ 7.7) (антиген-индуцированная продукция) и без антигенов (спонтанная продукция), определяют содержание интерлейкина - 2 в обеих пробах, разность между антигениндуцированной и спонтанной продукцией, сопоставляют с пороговым значением интерлейкина - 2 и при его достижении или превышении диагностируют наличие туберкулезного инфицирования, а при значении ниже порогового - его отсутствие. В качестве порогового значения интерлейкина - 2, при котором достигается чувствительность выявления инфицированных лиц 86%-95%, была определена величина 36 пг/мл (7).

Недостаток данного способа связан с тем, что имеются высокие требования к оснащению лаборатории и квалификации медицинского персонала, возможны технические ошибки и неоднозначность результатов при пограничных значениях. В качестве стимулирующего агента здесь используется смесь антигенов, не идентичных по изготовлению и составу антигенам, находящимся в препарате Диаскинтест, используемым для постановки кожных проб.

Известен in vitro способ QuantiFERON-TB Gold in Tube, где для стимуляции клеток гепаринизированной цельной крови используется коктейль пептидов ESAT-6, CFP-10, ТВ 7.7(р4).

Основой заявляемого способа является стимуляция клеток крови пептидными антигенами и последующее количественное определение выброса гамма-интерферона (ИФН-γ). Данные пептидные антигены стимулируют продукцию ИФН-γ Т-клетками пациентов, инфицированных микобактериями туберкулеза, и не вызывают никакой реакции у неинфицированных людей (8).

Недостатком данного способа является высокая стоимость, невозможность с его помощью выявить микобактерии бычьего типа, вакцинного штамма и эффективность вакцинации. Результаты могут быть как отрицательными, так и сомнительными у лиц с активным туберкулезом. В качестве стимулирующего агента здесь используется смесь антигенов, не идентичных по изготовлению и составу антигенам, находящимся в препарате Диаскинтест, используемым для постановки кожных проб.

Данный способ и был использован как прототип.

Целью изобретения является разработка способа диагностики туберкулезной инфекции у пациентов с отрицательными кожными пробами на препарат Диаскинтест. Эта цель достигается тем, что диагностику туберкулезной инфекции выполняют у людей с отрицательными кожными пробами на препарат Диаскинтест; для стимуляции клеток гепаринизированной цельной крови применяют препарат Диаскинтест, использующийся для постановки кожных проб; дополнительно в гепаринизированной цельной крови определяют уровень CD4+CD27^- -лимфоцитов методом лазерной проточной цитофлюориметрии и при совокупном повышении уровня стимулированного ИФН-γ более 18,0 пг/мл и CD4+CD27^- - лимфоцитов более 15,0% подтверждают наличие туберкулезной инфекции.

Заявляемый в способе ИФН-γ среди множества направлений своей биологической активности, в том числе является показателем состояния функциональной активности лимфоцитов и отражает направленность реализации иммунного ответа по клеточному типу активности иммунной системы.

ИФН-γ представляет собой гликопротеин с M=21 кDa и относится к интерферонам II типа. Ключевыми продуцентами являются макрофаги, натуральные киллеры (NK) и Th1 - лимфоциты непосредственно после их активации вирусными, бактериальными, паразитарными и другими вызывающими воспаление агентами. ИФН-γ играет важную роль в формировании и развитии Th1-клеточного иммунного ответа и осуществляет регуляторные функции в развитии гуморального Th2-иммунного ответа, в связи с чем он осуществляет центральную роль в развитии многих иммунопатологических состояний. Сниженная способность клеток продуцировать ИФН-γ в ответ на внедрение в организм Mycobacterium tuberculosis препятствует элиминации возбудителя и, в конечном счете, приводит к развитию хронической инфекции.

При туберкулезе основную роль в протективном иммунитете играют T-хелперы I типа (Th1-лимфоциты), которые продуцируют ИФН-γ и активируют макрофаги (9, 10).

Рецепторы CD27 относятся к семейству фактора некроза опухоли. Они экспрессируются на В-лимфоцитах, T-лимфоцитах и NK-клетках (11). Рецепторы CD27 играют большую роль в образовании эффекторных Τ-хелперов. Процессы естественной дифференцировки T-хелперов сопровождаются снижением экспрессии CD27, в результате чего зрелые T-хелперы становятся высокодифференцированными и приобретают фенотип CD4+CD27^- (12). По литературным данным, доля CD4+CD27^- - лимфоцитов у здоровых лиц не превышает 12,0% (13). При длительной антигенной стимуляции Mycobacterium tuberculosis дифференцировка эффекторных CD4+CD27+ - лимфоцитов в CD4+CD27^- - клетки повышается, в связи с чем происходит накопление пула CD4+CD27" - клеток. Доказано, что CD4+CD27^- - лимфоциты обладают более выраженной способностью к продукции ИФН-γ, чем клетки с фенотипом CD4+CD27+ (14).

Заявляемый способ включает стандартизованные лабораторные методы, что позволяет использовать его в клинической практике.

Заявляемый способ осуществляется следующим образом.

У пациента в положении сидя забирают периферическую венозную кровь, помещают ее в пробирку с антикоагулянтом гепарином. В части этой гепаринизированной крови выполняют стимулирование клеток крови препаратом Диаскинтест, использующимся для постановки кожных проб, и определяют уровень ИФН-γ иммуноферментным методом. Дополнительно в другой части гепаринизированной периферической венозной крови определяют уровни CD4+CD27^- - клеток методом лазерной проточной цитофлюориметрии.

Стимулирование клеток гепаринизированной крови препаратом Диаскинтест проводится следующим образом. Гепаринизированная кровь разливается по 800 мкл в две пробирки. Пробирка №1, контрольная - содержит 200 мкл физиологического раствора + 800 мкл гепаринизированной венозной крови.

Пробирка опытная №2 - содержит 200 мкл препарата Диаскинтест, содержащего антигены микобактерий человеческого вида + 800 мкл гепаринизированной венозной крови. Содержимое каждой пробирки тщательно перемешивают, пробирки инкубируют в термостате при 37C° в течение 24 часов.

После инкубации в контрольной и опытной пробирках определяют уровень ИФН-γ иммуноферментным методом с использованием коммерческих иммуноферментных тест-систем в соответствии с методическими рекомендациями фирмы - производителя ("Вектор-Бест", г. Новосибирск).

Уровень стимулированного ИФН-γ у здоровых людей не превышает 18,0 пг/мл и в среднем составляет 4,14 пг/мл.

Исследование уровня CD4+CD27^- - клеток в цельной гепаринизированный крови осуществляли в соответствии с инструкциями фирмы-производителя МКАТ ООО «Сорбент» (Москва) и методическими рекомендациями (15).

Определение содержания CD4+CD27^- - клеток в пробах проводили с использованием цитометра Calibur (USA) в режиме CellQest при установленных рабочих параметрах, относительно CD4+гейта.

Уровень CD4+CD27^- - клеток в периферической крови здоровых детей составляет в среднем 4,15%. По нашим данным, доля CD4+CD27^- - клеток у детей с туберкулезом составляет в среднем 56,5%, с виражом туберкулиновых проб 14,8%.

Интерпретация результатов комплекса проведенных исследований проводится следующим образом. Если у ребенка с отрицательным результатом Диаскинтеста in vivo в периферической крови регистрируется совокупно уровень ИФН-γ в тест-системе с Диаскинтестом in vitro более 18,0 пг/мл и уровень CD4+CD27^- - лимфоцитов в негепаринизированной цельной периферической венозной крови более 15,0%, то диагносцируют инфицирование МБТ.

Пример 1. Девочка В., 5 лет, вакцинирована БЦЖ в роддоме. Пробы Манту 2ТЕ по годам: 1 год - 7 мм, 2 год - 5 мм, 3 год - 5 мм, 4 год - 4 мм, 5 год - 7 мм. В 5 лет поставлена проба Диаскинтеста для дифференциальной диагностики поствакцинальной и инфекционной аллергии. Результат кожной пробы Диаскинтест отрицательный.

Заключение врача фтизиатра: поствакцинальная аллергия, не инфицирована микобактериями человеческого вида.

Ребенок направлен на диагностику инфицирования МБТ по предлагаемой методике с определением в периферической крови уровня ИФН-γ в тест-системе с Диаскинтестом in vitro, уровня CD4+CD27^- - лимфоцитов.

В результате проведенных лабораторных тестов получены следующие результаты:

- уровень ИФН-γ в тест-системе с Диаскинтестом in vitro 24,0 пг/мл,

- уровень CD4+CD27^- - лимфоцитов 21,0%.

Полученные показатели позволяют сделать вывод об инфицировании МБТ.

Заключение: ребенок инфицирован МБТ и подлежит наблюдению у фтизиатра.

Пример 2. Мальчик Д., 2 года, вакцинирован БЦЖ в роддоме. Пробы Манту 2ТЕ: 1 год - 9 мм, 2 год - 7 мм. В 2 года поставлена проба Диаскинтеста для дифференциальной диагностики поствакцинальной и инфекционной аллергии. Результат кожной пробы Диаскинтеста отрицательный.

Заключение врача фтизиатра: поствакцинальная аллергия, не инфицирован микобактериями человеческого вида.

Ребенок направлен на диагностику инфицирования МБТ по предлагаемой методике с определением в периферической крови уровня ИФН-γ в тест-системе с Диаскинтестом in vitro, уровня CD4+CD27^- - лимфоцитов.

В результате проведенных лабораторных тестов получены следующие результаты:

- уровень ИФН-γ в тест-системе с Диаскинтестом in vitro 10,0 пг/мл,

- уровень CD4+CD27^- - лимфоцитов 19,0%.

Полученные показатели позволяют сделать вывод о неинфекционном характере кожной пробы. Заключение: у ребенка поствакцинальная аллергия, не инфицирован МБТ и не подлежит наблюдению у фтизиатра.

Пример 3. Пациент M., 6 лет, м. пола. Вакцинирован БЦЖ. Пробы Манту 2ТЕ: 1 год - 6 мм, 2 год - 4 мм, 3 год - 3 мм, 4 год - 4 мм, 5 год - 6 мм, 6 лет - 10 мм. Поставлена ребенку проба Диаскинтест - результат отрицательный. Через месяц выявлен контакт с больным туберкулезом отцом (диагноз: Инфильтративный туберкулез легких в фазе распада МБТ+). При рентгенологическом обследовании ребенка выявлен туберкулез внутригрудных лимфатических узлов справа (туморозный вариант) МБТ-.

Ребенок направлен на диагностику инфицирования МБТ по предлагаемой методике с определением в периферической крови уровня ИФН-γ в тест-системе с Диаскинтестом in vitro, уровня CD4+CD27^- - лимфоцитов.

В результате проведенных лабораторных тестов получены следующие результаты:

- уровень ИФН-γ в тест-системе с Диаскинтестом in vitro 26,5 пг/мл,

- уровень CD4+CD27^- - лимфоцитов 24,0%.

Полученные показатели позволяют сделать вывод об инфицировании МБТ.

Заключение: ребенок инфицирован МБТ, локальная форма туберкулеза (ТВГЛУ) и подлежит лечению у фтизиатра.

Пример 4. Пациент С., 8 лет, м. пола. Вакцинирован БЦЖ в роддоме. Пробы Манту 2ТЕ: 1 год - 8 мм, 2 год - 4 мм, 3 год - 3 мм, 4 год - отр., 5 год - отр., 6 лет - отр., 7 лет - отр., 8 лет - 14 мм. Ребенку поставлена проба с Диаскинтестом - результат 12 мм. При рентгенологическом обследовании ребенка данных за туберкулез нет.

Ребенок направлен на диагностику инфицирования МБТ по предлагаемой методике с определением в периферической крови уровня ИФН-γ в тест-системе с Диаскинтестом in vitro, уровня CD4+CD27^- - лимфоцитов.

В результате проведенных лабораторных тестов получены следующие результаты:

- уровень ИФН-γ в тест-системе с Диаскинтестом in vitro 29,4 пг/мл,

- уровень CD4+CD27^- - лимфоцитов - 25,0%.

Полученные показатели позволяют сделать вывод об инфицировании МБТ.

Заключение: ребенок инфицирован МБТ и подлежит наблюдению у фтизиатра.

Источники

1. Приказ от 21 марта 2003 г. №109 «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской федерации». - М., 2003. - С. 49-55.

2. Кожная проба с препаратом "ДИАСКИНТЕСТ" - новые возможности идентификации туберкулезной инфекции./Под ред. акад. РАН и РАМН М.А. Пальцева. Изд. 2-е, перераб. и доп. - М.: Издательство "Шико", 2011. 256 с.

3. Слогоцкая Л.В. Кожные иммунологические методы при туберкулезе - история и современность // Туберкулез и болезни легких, 2013, №5, с. 39-46.

4. Владимирский М.А. О неправильных выводах в статье Слогоцкая Л.В. Кожные иммунологические методы при туберкулезе - история и современность // Туберкулез и болезни легких, 2014, №1, с. 53.

5. Туберкулинодиагностика: учебное пособие. - М.: ГЕОТАР-Медиа. 2013. - С. 87.

6. Oxford Immunotec, USPTO Applicaton №20070196878.

7. Способ диагностики туберкулезного инфицирования. - Патент №2503006.

8. CDC. Guidelines for using the QuantiFERON- ТВ test for diagnosing latent mycobacterium tuberculosis infection. MMWR 2003: 52 (No RR-2): 15-8.

9. Ярилин А.А. Основы иммунологии. - M., 1999.

10. Janeway С.A., Travers P., Walport M., Capra J.D. Immunobiology: the immune system in health and disease. - Elsevier Scince Ltd, 1999.

11. Watts Т.Н. TNFR family members in costimulation of Tcell responses // Annu. Rev. Immunol. - 2005. - Vol. 23. P. 23-68.

12. Karin M., Lin A. NF - kB at the cross roads of life and death // Nat. Immunol. - 2002. - Vol. 173. - P. 7292-7298.

13. Лядова, Никитина, Кондратюк, Васильева. «Способ оценки эффективности лечения и динамики деструктивных изменений в легочной ткани при туберкулезе легких». - Заявка на патент №2010150484/15(072863).

14. Lyadova I.V., Oberdorf S., Kaprina М.А. et al. CD4 T cells producing IFN - gamma in the lung of mice challenged with mycobacteria express a CD27 - negative phenotype // Clin. Exp. Immunol. - 2004. - Vol. 138. - P. 21-29.

15. Методические рекомендации «Стандартизация методов иммунофенотипирования клеток крови и костного мозга человека» // Медицинская иммунология. - 1999. - Т. 1. - №5. - С. 21-43.