СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ АНТИГРИБКОВЫМ ДЕЙСТВИЕМ

Изобретение относится к медицине, конкретно к клинической фармакологии, и может быть использовано для фармакологической коррекции грибковых заболеваний, и касается лекарственных средств, обладающих антигрибковым действием, получаемых из растительного сырья.

Грибковые заболевания относятся к числу широко распространенных (по данным ВОЗ ими страдает каждый четвертый житель Земли), причем 95% данной патологии составляют микозы стоп, а 5% - поражения слизистых. Исследования [I] показали, что основным возбудителем микозов стоп является Trichophyton rubrum (60-90%) и значительно реже Trichophyton interdigitalе (10-20%). Увеличение частоты встречаемости системных грибковых инфекций в последние годы обусловлено рядом факторов, прежде всего возрастанием иммунокомпрометированной популяции пациентов, что связано с широким применением современной высокодозной химиотерапии онкологических заболеваний, развитием и внедрением в практическую медицину трансплантологии, пандемией ВИЧ-инфекции. Сопутствующими факторами являются: применение инвазивных устройств и инородных материалов, обширные хирургические вмешательства, массивная антибактериальная терапия и др. [2]. Кроме того, повышению заболеваемости дерматомикозами, вызываемыми патогенными и условно-патогенными грибами, способствует снижение иммунитета, неполноценное питание, изменение реактивности организма человека. Применение современных антигрибковых средств, к тому же, сопровождается рядом побочных эффектов и недостатков: амфотерицин В и его липидные формы - нефротоксическими проявлениями и инфузионными реакциями; у каспофунгина отсутствует пероральная форма, он не обладает активностью в отношении криптококка; мало данных о безопасности парентерального введения интраконазола; ограничен спектр активности флуконазола, несмотря на его высокую эффективность при лечении дрожжевых форм грибковых инфекций [3]. Увеличение распространенности тяжелых грибковых поражений и рост их рефрактерности к традиционно применяемым антимикотикам, индивидуальная непереносимость, побочные эффекты, высокая токсичность и стоимость обусловливают необходимость разработки новых лекарственных средств [4], актуальность которой усиливается дополнительно наличием лишь единичных отечественных препаратов данной группы. В данном случае большой интерес представляют растительные объекты.

Наиболее близким к предлагаемому решению является водный экстракт хвоща полевого Eqisetum arvense L., обладающий антигрибковым действием (препарат сравнения) [1].

Задачей данного изобретения является расширение арсенала средств, обладающих антигрибковым действием, получаемых из растительного сырья.

Поставленную задачу решают применением в качестве средства, обладающего антигрибковым действием, водного экстракта надземной части альфредии поникшей (Alfredia cernua (L.) Cass.).

Новым является то, что впервые в качестве средства, обладающего антигрибковым действием, используют водный экстракт надземной части альфредии поникшей (Alfredia cernua (L.) Cass.).

В народной медицине альфредию поникшую (Alfredia cernua (L.) Cass.) используют при нервных заболеваниях, в качестве тонизирующего и болеутоляющего средства [5]. Ранее нами обнаружена антиоксидантная [6], ноотропная [7], анксиолитическая [8] и нормотимическая [9] активность экстрактов надземной и подземной частей альфредии поникшей (Alfredia cernua (L.) Cass.). В литературе отсутствуют данные о применении альфредии поникшей (Alfredia cernua (L.) Cass.) в качестве средства, обладающего антигрибковым действием.

Использование водного экстракта надземной части альфредии поникшей (Alfredia cernua (L.) Cass.), по предлагаемому назначению стало возможным благодаря выявлению экспериментально его новых свойств, а именно способности ингибировать рост возбудителей дерматофитии за счет антигрибкового действия.

Новое свойство обнаружено в результате проведенного экспериментального изучения антигрибкового действия водного экстракта надземной части альфредии поникшей (Alfredia cernua (L.) Cass.).

В качестве тест-культур использовали штаммы возбудителей, наиболее часто встречающихся грибковых заболеваний (дерматофитии). Их выбор определяли методом экспертных оценок специалистов-микологов, а также на основании данных литературного анализа. Штаммы Trichophyton rubrum-248/700, Trichophyton menlagrophytes var. inlerdigitale ВКПГ-268, Microsporum canis ВКПГ-326/316 получены в отделе микологии Центрального кожно-венерологического института МЗ РФ (г. Москва) и во Всероссийской коллекции патогенных грибов при Всероссийском центре по глубоким микозам и микогенной аллергии (г. Санкт-Петербург).

Исследование антигрибковой активности проводили in vitro методом двукратных серийных разведений в жидкой питательной среде Сабуро. За критерий антифунгальной активности принимали фунгистатический титр, который оценивали в весовых единицах (мкг/мл питательной среды).

Отличительные признаки проявили в заявляемой совокупности новые свойства, явным образом не вытекающие из уровня техники в данной области и неочевидные для специалиста. Впервые установлено, что в качестве средства, обладающего антигрибковым действием, можно использовать водный экстракт надземной части альфредии поникшей (Alfredia cernua (L.) Cass.).

Идентичной совокупности признаков не обнаружено в патентной и научно-медицинской литературе.

Предлагаемое средство с успехом может быть использовано в практическом здравоохранении для терапии и профилактики микозов.

Исходя из вышеизложенного, следует считать предлагаемое изобретение соответствующим условиям патентоспособности «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Изобретение будет понятно из следующего описания.

Исследование антигрибковой активности. Эксперименты проводили in vitro методом двукратных серийных разведений в жидкой питательной среде Сабуро по методике С.А. Вичкановой [10].

В качестве тест-культур использовали штаммы возбудителей, наиболее часто встречающихся грибковых заболеваний (дерматофитий). Штаммы Trichophyton rubrum-248/700, Trichophyton mentagrophytes var. interdigitale ВКПГ-268. Microsporum canis ВКПГ-326/316 получены в отделе микологии Центрального кожно-венерологического института МЗ РФ (г. Москва) и во Всероссийской коллекции патогенных грибов при Всероссийском центре по глубоким микозам и микогенной аллергии (г. Санкт-Петербург). Для посева использовали 7-10-суточные суспензии дерматофитов. Взвеси грибов готовили в физиологическом растворе по оптическому стандарту мутности.

10 мг (т. н.) водного экстракта помещали в стерильную пробирку и заливали 0,2 мл 96 % этанола для стерилизации. После полного растворения экстракта прибавляли 4,8 мл стерильной питательной среды, получая, таким образом, исходное разведение (1000 мкг/мл). Путем последовательных разведений получали ряд убывающих концентраций [11]. После этого в каждую пробирку засевали по 0,2 мл культуры патогенных грибов (мутность 1 млрд клеток бактериального стандарта), разведенной в 10 раз.

Каждый опыт повторяли 4-6 раз. В качестве контроля служили пробирки с питательной средой, засеянные аналогичным количеством тест-культуры, а также пробирки со средой и экстрактами без культуры (для проверки мутности и осаждения экстракта). Посевы инкубировали в термостате при температуре 33°C. Учет культуры проводили на 7-10 сутки исследования. За критерий антифунгальной активности принимали фунгистатический титр, который оценивали в весовых единицах (мкг/мл питательной среды). Фунгистатическим титром считали предельную концентрацию экстракта в среде, при которой отсутствовал видимый рост культуры в условиях оптимальной температуры и заданной микробной нагрузки [1].

Полученные экспериментальные данные обрабатывали статистически.

При проведении экспериментальных исследований использовали водный экстракт надземной части альфредии поникшей (Alfredia cernua (L.) Cass.), полученный следующими способами:

Пример 1: надземную часть альфредии поникшей (Alfredia cernua (L.) Cass.), высушенную воздушным способом, измельчают и просеивают через сито с диаметром отверстий 2 мм (влажность 9,3 %). 50 г измельченного сырья помещают в стеклянную колбу, заливают 700 мл воды очищенной и настаивают при комнатной температуре в течение 5 ч. Полученное извлечение фильтруют, сырье отжимают. Экстракт подвергают лиофильной сушке, высушивая досуха (Э-1).

Пример 2: надземную часть альфредии поникшей (Alfredia cernua (L.) Cass.), высушенную воздушным способом, измельчают и просеивают через сито с диаметром отверстий 2 мм (влажность 9,3%). 50 г измельченного сырья помещают в стеклянную колбу, заливают 700 мл воды очищенной и нагревают при температуре 50°C на водяной бане с обратным холодильником в течение 90 мин. Полученное извлечение фильтруют, сырье отжимают. Экстракт упаривают в вакууме при температуре не выше 60°C досуха (Э-2).

Пример 3: надземную часть альфредии поникшей (Alfredia cernua (L.) Cass.), высушенную воздушным способом, измельчают и просеивают через сито с диаметром отверстий 2 мм (влажность 9,3%). 50 г измельченного сырья помещают в стеклянную колбу, заливают 500 мл воды очищенной и нагревают при температуре 85°С на водяной бане с обратным холодильником в течение 90 мин. Полученное извлечение фильтруют, сырье отжимают. Экстракт упаривают под вакуумом при температуре не выше 60°С досуха (Э-3).

Пример 4: надземную часть альфредии поникшей (Alfredia cernua (L.) Cass.), высушенную воздушным способом, измельчают и просеивают через сито с диаметром отверстий 2 мм (влажность 9,3%). 50 г измельченного сырья помещают в стеклянную колбу, заливают 750 мл воды очищенной и нагревают при температуре 85°C на водяной бане с обратным холодильником в течение 40 мин. Полученное извлечение фильтруют, сырье отжимают. Экстракт упаривают в вакууме при температуре не выше 60°C досуха (Э-4).

Пример 5: надземную часть альфредии поникшей (Alfredia cernua (L.) Cass.), высушенную воздушным способом, измельчают и просеивают через сито с диаметром отверстий 2 мм (влажность 9,3%). 50 г измельченного сырья помещают в стеклянную колбу, заливают 750 мл воды очищенной и нагревают при температуре 85°C на водяной бане с обратным холодильником в течение 60 мин. Полученное извлечение фильтруют, сырье отжимают. Экстракт упаривают в вакууме при температуре не выше 60°С досуха (Э-5).

Пример 6: надземную часть альфредии поникшей (Alfredia cernua (L.) Cass.), высушенную воздушным способом, измельчают и просеивают через сито с диаметром отверстий 2 мм (влажность 9,3%). 50 г измельченного сырья помещают в стеклянную колбу, заливают 750 мл воды очищенной и нагревают при температуре 85°C на водяной бане с обратным холодильником в течение 90 мин. Полученное извлечение фильтруют, сырье отжимают. Экстракт упаривают в вакууме при температуре не выше 60°C досуха (Э-6).

Пример 7: надземную часть альфредии поникшей (Alfredia cernua (L.) Cass.), высушенную воздушным способом, измельчают и просеивают через сито с диаметром отверстий 2 мм (влажность 9,3%). 50 г измельченного сырья помещают в стеклянную колбу, заливают 1000 мл воды очищенной и нагревают при температуре 85°C на водяной бане с обратным холодильником в течение 90 мин. Полученное извлечение фильтруют, сырье отжимают. Экстракт упаривают в вакууме при температуре не выше 60°C досуха (Э-7).

В результате исследования (табл.1) обнаружено, что исследуемые экстракты надземной части альфредии поникшей (Alfredia cernua (L.) Cass.), полученные разными способами, проявляют антигрибковые свойства, ингибируя рост возбудителей трихофитии и микроспории. Экстракты альфредии поникшей задерживают рост поверхностных дерматофитов в перспективной концентрации (фунгистатический титр составляет 15,6-31,2 мкг/мл), что сопоставимо с аналогичными показателями препаратов сравнения (нитрофунгин, нистатин). При этом водный экстракт хвоща полевого Eqisetum arvense L. проявляет меньшую активность, а значения фунгистатического титра в данном случае имеют высокие значения (табл.1). Полученные данные указывают на большую эффективность подавления роста возбудителей трихофитии и микроспории при применении водного экстракта надземной части альфредии поникшей (Alfredia cernua (L.) Cass.).

Как показывают экспериментальные исследования, водный экстракт надземной части альфредии поникшей (Alfredia cernua (L.) Cass.) обладает более выраженным антигрибковым действием по сравнению с водным экстрактом хвоща полевого Eqisetum arvense L., что приведет к более высокому эффекту в клинической практике.

Положительный эффект достигнут благодаря использованию водного экстракта надземной части альфредии поникшей (Alfredia cernua (L.) Cass.) в качестве антигрибкового средства, что позволило расширить арсенал средств растительного происхождения, обладающих антигрибковым эффектом, с повышенным специфическим действием.

Литература

1. Дмитрук С.Е., Коломиец Н.Э., Дмитрук В.С. и др. Грибковые заболевания и альтернативные возможности фитотерапии // Бюлл. СО РАМН. - 2001. - Т.101, №3. - С.9-14.

2. Richardson М.D. Changing patterns and trends in systemic fungal infections // J. Antimicrob. Chemother. - 2005. - Vol.56, suppl. 1. - P.5-11.

3. Patterson T.F. Advances and challenges in management of invasive mycoses // Lancet. - 2005. - Vol.366. - P.1013-1025.

4. Шилова И.Б., Гуськова Т.А., Волчкова Н.В. Сравнительная эффективность некоторых современных противогрибковых средств // Хим.-фарм. журнал. - 2005. - Т.39, №5. - С.3-5.

5. Растительные ресурсы СССР: Цветковые растения, их химический состав, использование; Семейство Asteraceae (Compositae). - СПб.: Наука, 1993. - С. 19-20.

6. Патент РФ на изобретение №2292214 «Средство, обладающее антиоксидантной активностью» от 27.01.2007 г. / Шилова И.В., Краснов Е.А., Кувачева Н.В., Новожеева Т.П.

7. Патент РФ на изобретение №2347580 «Средство, обладающее ноотропным действием» от 27 февраля 2009 г. / Шилова И.В., Суслов Н.И., Мустафин Р.Н., Хазанов В.А., Кувачева Н.В.

8. Патент РФ на изобретение №2354397 «Средство, обладающее анксиолитическим действием» от 10 мая 2009 г. / Шилова И.В., Суслов Н.И., Мустафин Р.Н., Хазанов В.А., Кувачева Н.В.

9. Патент РФ на изобретение №2416421 «Средство, обладающее нормотимическим действием» от 20 апреля 2011 г. / Мустафин Р.Н., Шилова И.В., Суслов Н.И.

10. Вичканова С.А. Ингибиторы микроорганизмов среди природных веществ растительного происхождения : автореф. дис. … канд. биол. наук. - М., 1981. - 37 с.

11. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / под ред. Р.У. Хабриева. - 2-изд., перераб. и доп. - М. : Медицина, 2005. - С.582-588.