Результат интеллектуальной деятельности: БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНАЯ ДОБАВКА К ПИЩЕ

Изобретение относится к пищевой промышленности, оно позволяет получить диетический продукт, являющийся источником нуклеиновых и других органических кислот, который имеет направленное действие на синтез нуклеиновых кислот и белков, улучшение регенерации тканей, восстановление иммунитета, способствует увеличению физической активности и выносливости.

Известна биологически активная добавка (БАД) к пище «Биостим». БАД получена из семенников крупного рогатого скота, содержит нуклеиновые кислоты (из них около 98% составляет ДНК, 2% - РНК), выпускается в виде таблеток по 0,2 г. «Биостим» стимулирует функцию кроветворных органов, повышает до нормы показатели периферической крови (гемоглобин, эритроциты, лейкоциты), сниженные в силу различных причин (кровопотеря, неблагоприятные факторы окружающей среды, в т.ч. ионизирующая радиация), стимулирует неспецифические факторы защиты организма, в частности, фагоцитарную активность нейтрофилов. «Биостим» применяют для профилактики и в комплексном лечении анемий, для реабилитации после перенесенных заболеваний, травм, хирургических операций и т.п. (Л.Н. Федянина, Н.Н. Беседнова, Л.М. Эпштейн, Т.К. Каленик, Ю.Г. Блинов // Тихоокеанский медицинский журнал, 2007, №4, стр. 9-12).

Известно, что при растворении в воде нуклеиновые кислоты набухают и образуют вязкие растворы коллоидного типа. Недостатком данного препарата является низкая эффективность, связанная с низкой растворимостью олигонуклеотидов в воде, и низкой биодоступностью препарата. Как следствие, эффективные дозы энтеральных препаратов на основе нуклеиновых кислот составляют около 500 мг/сутки.

Известен препарат «Деринат», представляющий собой высокоочищенный натрия дезоксирибонуклеат (Sodium deoxyribonucleate). Препарат обладает широким спектром действия, рекомендован при следующих заболеваниях: миелодепрессия и резистентность к цитостатикам у онкологических больных, острый фарингеальный синдром, язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки, гастродуодениты, ИБС, сердечно-сосудистая недостаточность, хроническая ишемическая болезнь нижних конечностей II и III стадии, простатит, вагинит, эндометрит, бесплодие и импотенция, вызванные хроническими инфекциями, хронический обструктивный бронхит (Чернов В.Н., Шарковская Т.Е. Применение отечественного препарата деринат в лечении больных с трофическими язвами нижних конечностей // Биомедицина, 2006, №3, т. 1, стр. 87-88).

Недостатком препарата является то, что он используется в виде инъекционной формы. В курсе лечения предусмотрено от 5 до 10 внутримышечных инъекций. Возможна гиперчувствительность, гипертермия, аллергические реакции.

Раскрытие изобретения

Задачей данного изобретения являлось создание композиции на основе нуклеиновых кислот, обладающей высокой эффективностью, однако лишенной побочных действий. Чтобы удовлетворять этим требованиям, композиция должна обладать высокой растворимостью, а также в композицию необходимо ввести новые компоненты, улучшающие усвоение олигонуклеотидов и усиливающие действие нуклеиновых кислот.

Предлагаемая биологически активная добавка к пище представляет собой композицию, содержащую ДНК, глютамин, фолиевую кислоту, янтарную кислоту и арабиногалактан при следующем соотношении компонентов: низкомолекулярная ДНК лососевых рыб - 1-10%, аминокислота глютамин - 40-60%, фолиевая кислота - 0,01-0,05%, янтарная кислота - 10-25%, комплексообразователь арабиногалактан - 20-30%.

Все компоненты смеси используются в виде сухого порошка.

С целью создания водорастворимых комплексов проводят механохимическую обработку смеси в следующем режиме:

загрузка обрабатываемого материала по отношению к загрузке мелющих тел - 1:10 (1 массовая часть обрабатываемой смеси и 10 массовых частей мелющих шаров);

- скорость вращения привода - 300-500 об/мин;

- время механической обработки - 5-15 мин.

Полученная смесь имеет вид мелкодисперсного порошка серого цвета с размером частиц 0,01-0,001 мм, хорошо растворима в воде, стабильна при хранении.

Сравнение показателей качества композиций, полученных при различной длительности механохимической обработки (оптимизируемый параметр), показало, что при длительности процесса более 15 минут происходит химическое разложение нуклеиновых кислот и арабиногалактана, в результате чего их содержание снижается на величину менее 80% от теоретической. При длительности механохимического процесса менее 5 минут растворимость обработанной смеси достоверно не отличается от растворимости в воде простой смеси арабиногалактана и ДНК.

Предложенная нами композиция отличается от вышеуказанных аналогов тем, что в ее состав, кроме нуклеиновых кислот, входят глютамин, фолиевая и янтарная кислоты, оказывающие синергичное действие на синтез нуклеиновых кислот и белка, а также тканевое дыхание и энергетический обмен, что отражается в ускоренной регенерации и восстановлении клеточного состава (пример 5).

Предложенная композиция отличается от аналогов также тем, что имеет в своем составе арабиногалактан, который в результате механохимической активации образует водорастворимые комплексы с гидрофобными соединениями общей формулы R2-R1-R2, где:

R1 - гидрофобные соединения (нуклеиновые кислоты, глютамин, фолиевая кислота),

R2 - комплексующийся за счет Ван-дер-Ваальсовых сил с гидрофобными соединениями арабиногалактан.

Предложенная композиция по сравнению с энтеральными аналогами обладает более высокой растворимостью (пример 1) и эффективностью (примеры 3, 4, 5), а по сравнению с инъекционными аналогами - высокой безопасностью. Она оказывает направленное действие на синтез нуклеиновых кислот и белков, улучшает регенерацию тканей, восстановливает иммунитет, способствует увеличению физической активности и выносливости.

Примеры

Пример 1. Смесь компонентов (низкомолекулярной ДНК лососевых рыб, глютамина, фолиевой кислоты, янтарной кислоты, арабиногалактана) подвергается механохимической обработке в следующем режиме:

- загрузка обрабатываемого материала - 0,2 кг;

- загрузка мелющих тел - стальных шаров диаметром 12 мм - 2 кг;

- скорость вращения привода - 500 об/мин;

- время механической обработки - 7 мин.

После проведения обработки в данном режиме конечный размер полученной фракции составил 0,01-0,001 мм, растворимость в воде полученной композиции при комнатной температуре составила 96%.

Пример 2. Для получения заявляемой композиции ингредиенты смешивают в следующем соотношении, мас. %: низкомолекулярная ДНК лососевых рыб (5%), аминокислота глютамин (50%), фолиевая кислота (0,05%), янтарная кислота (20%), комплексообразователь арабиногалактан (до 100%), после чего смесь подвергают механохимическому воздействию.

Пример 3. Проведено исследование влияния предлагаемой композиции на восстановление синтеза белка и обмена нуклеиновых кислот у больных с алиментарным дефицитом.

Критерии включения пациентов в исследование: пациенты обоих полов с рубцовым сужением пищевода или ахалазией пищевода, нуждающиеся в коррекции диеты в связи со снижением массы тела; возраст от 18 до 45 лет.

Для оценки нутритивного статуса (НС) использовали клинические и лабораторные методы: анамнестические данные, рост, массу тела, скорость потери массы тела (чем быстрее пациент теряет массу тела, тем выраженнее степень нутритивной недостаточности), расчет идеальной массы тела (ИдМТ) по формуле Лоренца (X-100-(X-150)/2, где X - взятое в сантиметрах числовое значение роста), расчет индекса Кетле (индекс Кетле (масса/рост) = масса тела (кг) / возведенный в квадрат рост пациента в м), дефицит массы тела (ДМТ) от ИдМТ. Учитывались данные определения абсолютного числа лимфоцитов (АЧЛ), содержания в плазме крови общего белка (ОБ), альбумина (Алб), трансферрина (Тр). Обмен нуклеиновых кислот (НК) оценивали по уровню ДНК в сыворотке.

У всех пациентов изменения нутритивного статуса были очевидны вследствие дефицита массы тела - 9,6%±1,4.

Исходные концентрации трансферина и ДНК в сыворотке крови были низкими у всех пациентов. В частности, средние уровни Тр и ДНК были в диапазоне 1,3-1,7 г/л±0,1-0,07 г/л и 0,8-0,9 нг/мл±0,06-0,1 нг/мл соответственно.

Были сформированы две группы пациентов. Распределение по группам было осуществлено слепым случайным способом.

Первую группу составили пациенты (n=11) с традиционной методикой ведения: пациенты питались обычной пищей через гастростому или разбужированный пищевод. Во второй выборке (n=12) пациенты питались также через гастростому или через разбужированный пищевод, причем в обычное питание включалась заявленная композиция в течение 7-10 суток. Доза ДНК составила 50 мг/сутки, общая масса композиции 2 г/сутки.

Таким образом, индекс Кетле, общий белок крови и концетрация альбумина в сыворотке крови оказались малоинформативны у данных больных. Согласно современным установкам уровни ОБ и Алб действительно не являются абсолютным ориентиром при оценке нутритивного статуса, прежде всего вследствие лабильности концентрации в сыворотке крови и зависимости от водного баланса. Более информативны концентрация Трансферрина и ДНК сыворотки крови. У пациентов обеих групп имел место дефицит Трансферрина, указывающий на тяжелую нутритивную недостаточность (НН) (1,37±0,06-1,4±0,15). Через 7 дней после начала питания уровень Трансферина увеличился в первой группе до 1.81±0.15, однако это увеличение является статистически недостоверным. При этом в 2-й группе на фоне введения заявляемой композиции концентрация Трансферрина была достоверно выше к 7-му дню как по сравнению с исходными цифрами, так и по сравнению с аналогичными значениями в 1-й группе и составила 2.6±0.1 (р<0,05).

Для оценки обмена нуклеиновых кислот у пациентов первой и второй групп (всего 23 пациента от 20 до 65 лет мужского и женского пола с диагнозом ахалазия пищевода или рубцовое сужение пищевода) определили концентрацию ДНК сыворотки крови на всех этапах исследования (табл. 2).

При анализе результатов у пациентов первой группы зарегистрирован глубокий дефицит содержания ДНК (для сравнения, у здоровых доноров нормальные значения ДНК сыворотки крови составляют 10-60 нг/мл) в сыворотке крови на протяжении всех 7 дней наблюдения. Вместе с тем во второй группе после назначения в стандартной схеме нутритивной поддержки в виде заявляемой композиции содержание ДНК в сыворотке крови возросло в десятки раз (табл. 2). Это объясняется зависимостью синтеза нуклеиновых кислот от потребления глутамина, фолиевой кислоты и низкомолекулярных олигонуклеотидов.

Таким образом, при включении заявляемой композиции в нутритивную поддержку пациентов с алиментарным дефицитом отмечено быстрое достоверное восстановление уровней Трансферрина и ДНК сыворотки крови, являющихся основным критерием эффективности белкового обмена и обмена нуклеиновых кислот. Заявленная композиция обладает достоверным анаболическим эффектом даже у пациентов с исходными нарушениями обмена нуклеиновых кислот.

Пример 4. Оценка физической работоспособности с помощью гарвардского степ-теста.

После окончания дозированной физической нагрузки испытуемый отдыхает сидя. Начиная со 2-й минуты у него 3 раза по 30-секундным отрезкам времени подсчитывается ЧСС: с 60-й до 90-й, со 120-й до 150-й и со 180-й до 210-й секунды восстановительного периода. Значения этих трех подсчетов суммируются и умножаются на 2 (перевод из уд/30 с в уд/мин). Результаты тестирования выражаются в условных единицах в виде индекса гарвардского степ-теста (ИГСТ), величина которого рассчитывается из уравнения:

ИГСТ=Т(100/(f2+f3+f4)×2,

где Τ - фактическое время выполнения физической нагрузки в секундах; f2, f3, f4 - сумма ЧСС за первые 30 с каждой (начиная со 2-й) минуты восстановительного периода.

Оценка результатов тестирования. Величина ИГСТ характеризует скорость восстановительных процессов после напряженной физической нагрузки и оценивается по шкале. Чем быстрее восстанавливается ЧСС после степ-теста, тем меньше величина f2+f3+f4 и, следовательно, выше ИГСТ. Оценка физической работоспособности по результатам гарвардского степ-теста (Карпман В.Л. и др. // Тестирование в спортивной медицине. М.: ФиС, 1988. 120 с.) в ИГСТ, ед.:

меньше 55 - плохой результат,

55-64 - ниже среднего,

65-79 - средний результат,

80-89 - хороший,

90 и больше - отличный результат.

В опытную группу входило 9 человек мужского пола в возрасте 25-40 лет. Заявленная композиция принималась в дозе 2000 мг (в пересчете на ДНК - 50 мг) утром, за 15 мин до еды 1 раз в сутки ежедневно на протяжении всего периода исследования.

В группу сравнения входило 10 человек мужского пола в возрасте 25-40 лет. Композиция ДНК + глютамин + фолиевая кислота + янтарная кислота + арабиногалактан в аналогичных весовых соотношениях, но не подвергнутая механохимическому воздействию принималась также в дозе 2000 мг (в пересчете на ДНК - 50 мг) утром, за 15 мин до еды 1 раз в сутки.

Результаты приведены в табл. 3.

Таким образом, простая смесь компонентов не приводила к достоверному увеличению выносливости/работоспособности. Использование заявленной композиции в указанной дозе достоверно увеличивало работоспособность/выносливость уже через 30 дней после начала приема.

Пример 5. Эффект заявленной композиции на восстановление костного мозга и уровень лимфоцитов у мышей после воздействия цитостатиком.

Миелосупрессия у самцов мышей CBA/CaLac (масса тела 20-25 г) осуществлялась однократным введением фторурацила (5-ftoruracil) в дозе 150 мг/кг массы тела.

Были сформированы следующие группы исследования:

- интактные животные (7 особей),

- контрольная группа животных (7 особей). После воздействия фторурацилом вводили физиологический раствор,

- опытная группа 1 (7 особей): животных после однократного воздействия фторурацилом каждый день однократно поили раствором, содержащим 30 мг/кг низкомолекулярной ДНК лососевых рыб,

- опытная группа 2 (7 особей): животных после однократного воздействия фторурацилом ежедневно, на протяжении всего периода наблюдения, поили один раз в день раствором, содержащим смесь нижеуказанных компонентов без механохимической обработки смеси: низкомолекулярная ДНК лососевых рыб - 2,5%, аминокислота глютамин 57,97%, фолиевая кислота 0,03%, янтарная кислота 14%, арабиногалактан 25,5%. Общая доза ДНК - 30 мг/кг,

- опытная группа 3 (7 особей): животных после однократного воздействия фторурацилом ежедневно поили раствором, содержащим прошедшую механохимическую обработку согласно примеру 1 смесь: низкомолекулярная ДНК лососевых рыб - 2,5%, аминокислота глютамин 57,97%, фолиевая кислота 0.03%, янтарная кислота 14%, арабиногалактан 25,5%. Общая доза ДНК 30 мг/кг.

Оценивалось содержание лимфоцитов в периферической крови и костном мозге. Результаты приведены в табл. 4 и табл. 5.

Из табл. 4 и 5 видно, что низкомолекулярная ДНК обладает положительным эффектом на скорость восстановления костного мозга и уровня лимфоцитов периферической крови у мышей. Добавление органических кислот глютамина, фолиевой кислоты и янтарной кислоты потенцирует данное действие ДНК. Наиболее выраженным действием обладал комплекс, подвергнутый механохимической обработке. Достоверный миелостимулирующий эффект в этой группе отмечен уже на 3 сутки после введения 5-фторурацила. На 14 сутки отмечена гиперкоррекция с лимфоцитозом, тогда как в контрольной группе уровень лимфоцитов достиг только 52% от исходных значений. К 14 суткам в группе 5 достигнута достоверная разница по сравнению со всеми другими опытными группами. Таким образом, доказано, что низкомолекулярная ДНК наиболее эффективна в комплексе с арабиногалактаном, а также обладающими синнергичным действием глютамином, фолиевой кислотой и янтарной кислотой после механохимической обработки смеси.