СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ УСТОЙЧИВОГО ВИРУСОЛОГИЧЕСКОГО ОТВЕТА ПРИ ПРОТИВОВИРУСНОЙ ТЕРАПИИ ХРОНИЧЕСКОГО ВИРУСНОГО ГЕПАТИТА С НА ФОНЕ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ

Изобретение относится к медицине, разделу инфекционные болезни, ВИЧ-инфекция, хронический вирусный гепатит C

Актуальность проблемы ВИЧ-инфекции и вирусных парентеральных гепатитов во многом определена общностью эпидемиологических, социальных и экономических показателей. По данным различных авторов, распространенность хронического вирусного гепатита C (ХВГС) среди ВИЧ-инфицированных пациентов варьирует от 33 до 59%, а у лиц, употребляющих внутривенно различные психотропные средства, может превышать 80% (Хальфин Р.А., 2007).

Частота развития терминальной стадии ВИЧ-инфекции и смертность у ВИЧ-инфицированных продолжают снижаться в результате эффективной антиретровирусной терапии (АРВТ) и профилактики оппортунистических инфекций. Одновременно в этой популяции отмечается рост частоты ХВГС и смертности от него (Soriano V., 2006). Помимо высокого риска хронизации HCV-инфекции, у ВИЧ-инфицированных пациентов с ХВГС отмечают более быстрое прогрессирование фиброза в печеночной ткани (Martin - Carbonero et al., 2005). В среднем примерно у половины таких пациентов через 25 лет с момента инфицирования HCV развивается цирроз печени. Процессы фиброза у коинфицированных пациентов активируются в еще большей степени при уменьшении количества CD4+ - лимфоцитов, что обуславливает необходимость в проведении АРВТ (Hammer et al., 2008). При этом лечение ХВГС в данных условиях также становится приоритетным по двум причинам. Во-первых, на фоне ВИЧ-инфекции быстрее прогрессируют патологические изменения в печеночной ткани вплоть до развития терминальной печеночной недостаточности (Martin - Carbonero et al., 2004). Во-вторых, при наличии ХВГС существенно снижается переносимость пациентами препаратов АРВТ, причем терапия сопряжена с более высоким риском гепатотоксичности и побочных явлений, особенно при взаимодействии препаратов АРВТ и противовирусной терапии (ПВТ) ХВГС (Nunez et al., 2001). Тем не менее принципиально возможно предотвращение нежелательных исходов путем эффективного лечения ХВГС. Так, элиминация HCV позволяет добиться регрессии фиброза в печени (Barriero et al., 2006; Soriano et al., 2006), а также снизить риск гепатотоксичности при проведении АРВТ (Labarga et al., 2007).

Известно, что принципиальные подходы к лечению ХВГС на фоне ВИЧ-инфекции такие же, как и при моно-ВГС инфекции. Однако необходимость применения АРВТ для лечения ВИЧ-инфекции, а также лечение и профилактика оппортунистических заболеваний определяют особенности комплексного терапевтического подхода к ведению и лечению коинфицированных пациентов.

Вероятность положительного ответа на ПВТ трудно прогнозировать, несмотря на наличие утвержденных стандартами критериев эффективности, таких как вирусологические характеристики (в частности, генотип и вирусная нагрузка), факторы хозяина (пол, возраст, индекс массы тела, степень фиброза и т.д.). Причем это касается как моно-ВГС инфекции, так и в большей степени коинфицированных пациентов, в связи с наличием у них дополнительных факторов риска в связи с сопутствующим заболеванием (Ющук Н.Д. и др., 2012).

Помимо этого существует ряд недостатков, касающихся диагностического контроля ПВТ ХВГС: например, максимальная чувствительность приборов при проведении ПЦР в лучшем случае 50 коп/мл (если лаборатории оснащены соответствующим оборудованием), что не вполне корректно отображает наличие вирусологического ответа в течение терапии. А наличие или отсутствие РНК вируса гепатита C в сыворотке крови при ПЦР, как известно, является одним из ключевых критериев контроля и прогноза эффективности лечения. Согласно рекомендациям пациентам, оставшимся РНК-позитивными через 12 недель лечения, у которых произошло снижение концентрации РНК ВГС на 2log10 и более, необходимо повторить тестирование через 24 недели лечения. В случае сохранения к этому сроку РНК ВГС в сыворотке крови лечение прекращают; если РНК ВГС в сыворотке крови отсутствует, лечение продолжают в общей сложности до 48 недель (Методическое письмо Минздравсоцразвития РФ от 20.01.2006 «Противовирусная терапия хронических вирусных гепатитов B и C у ВИЧ-инфицированных пациентов»). Но в связи с тем, что течение и лечение инфекционных заболеваний у ВИЧ-инфицированных пациентов протекает с поправкой на иммунодефицит, целесообразен поиск новых предикторов эффективной терапии ХВГС среди иммунологических показателей.

Несмотря на многочисленные исследования, механизмы повреждения иммунной системы при ХВГС и ВИЧ-инфекции по-прежнему до конца не ясны. Развитие HCV-инфекции на фоне ВИЧ-инфекции усугубляет иммунологические нарушения. Известно, что ХВГС вызывает иммунные нарушения сам по себе, что подтверждается изменением в иммунном статусе у ВИЧ-негативных лиц, больных ХВГС (Ситдыкова Ю.Р., 2008).

При лечении ХВГС основной составляющей в успехе терапии является реакция иммунной системы. Более сильный иммунный ответ макроорганизма и смещение баланса в сторону Т-хелперного иммунитета 1 типа определяет элиминацию ВГС в крови, о чем свидетельствует усиление продукции Th 1 - медиаторов при отрицательных результатах индикации HCV РНК (Корочкина О.В., 2012).

Иммунный ответ, опосредованный взаимодействием цитокинов - белковых молекул, которые также называют «клеточными гормонами», является сложной многокомпонентной системой. В этой системе все звенья взаимосвязаны, и каждый отдельный цитокин может выполнять различные функции. Определение коэффициента ИФНγ/ИЛ-4, отражающего провоспалительный потенциал и соотношение двух основных субпопуляций Т-хелперов (Th 1/Th 2) в данной ситуации также представляется уместным.

Таким образом, выявление прогностического значения динамики системных уровней отдельных цитокинов и коэффициентов их корреляции при ХВГС на фоне ПВТ у ВИЧ-инфицированных пациентов представляется важной задачей при оценке эффективности ПВТ ХВГС.

Задача заявляемого изобретения - разработка способа прогнозирования эффективности ПВТ ХВГС у ВИЧ-инфицированных на ранних сроках с помощью определения системного уровня цитокинов и расчета коэффициентов их корреляции.

В прототипе у больного с острым гепатитом C определяют содержание в сыворотке крови ИФНγ до начала и через 2 недели после начала лечения. Стабильную ремиссию прогнозируют, если через 2 недели после начала лечения содержание ИФНγ в 1,5-2 раза и более превышает ИФНγ до начала лечения.

Заявляемый способ прогнозирования ПВТ ХВГС на фоне ВИЧ-инфекции имеет следующие общие признаки с его аналогами (прототипами) определения:

1. Аналогичный цитокин ИФНγ в заявке №2007100753 используется при прогнозировании стабильной ремиссии при проведении ПВТ острого гепатита C у пациентов с моно-ХВГС инфекцией.

Отличительными от прототипа признаками заявляемого способа являются:

1. Исследование проводилось у коинфицированных пациентов (ВИЧ/ХВГС). Что значительно отличает проведенное исследование от прототипа.

2. Исследование уровня РНК ВГС в крови через 4 недели после начала лечения гепатита C при чувствительности 50 коп/мл.

3. Исследование цитокинового статуса и уровней содержания цитокинов ИФНα, ИФНγ и ИЛ-4 в сыворотке крови на фоне ПВТ ХВГС и ВИЧ-инфекции и коэффициентов корреляции между ними.

4. Использование коэффициента ИФНγ/ИЛ-4 в прогнозировании эффективности лечения ХВГС на фоне ВИЧ-инфекции на ранних сроках.

5. В отличие от прототипа используются и оцениваются в совокупности три показателя сыворотки крови: ИФНα, ИФНγ и ИЛ-4. Оцениваются до начала лечения и через 4 недели после начала лечения, что позволяет поэтапно, а значит, более точно прогнозировать исход терапии. Цитокины оцениваются на фоне ПВТ хронического вирусного гепатита С, что является более актуальным в свете использования ПВТ преимущественно у лиц с хроническим, а не острым гепатитом, ввиду сложности диагностики гепатита С в острый период.

Таким образом, при проведении анализа имеющейся научной и патентной информации не обнаружено сведений, относящихся к использованию способа прогнозирования устойчивого вирусологического ответа при противовирусной терапии хронического вирусного гепатита С на фоне ВИЧ-инфекции, заключающегося в оценке динамики иммунологических маркеров интерферона α (ИФНα), интерферона γ (ИФНγ) и интерлейкина 4 (ИЛ-4) и их мониторинг до начала терапии и через 4 недели после начала терапии, при этом стабильная ремиссия прогнозируется при начальных уровнях цитокинов более 3,99 пг/мл для ИФНα, от 8,32 до 13,1 пг/мл для ИФНγ, при значении коэффициента ИФНγ/ИЛ-4 более 6,72±0,50, а также при увеличении уровня ИФНα в 100раз и более через 4 недели от начала терапии, уровне ИФНγ от 8,32 до 13,1 пг/мл и увеличении коэффициента ИФНγ/ИЛ-4 в процессе терапии более 6,72±0.50.

Сущность предполагаемого способа прогнозирования ПВТ ХВГС на фоне ВИЧ-инфекции заключается в том, что определяют информативность

уровней сывороточных (системных) цитокинов: ИФНα, ИФНγ и ИЛ-4 в качестве предикторов эффективности ПВТ ХВГС.

Выбор исследуемых цитокинов не случаен и базировался на сопоставлении их биологических эффектов и патоморфофизиологических феноменов (Ярилин А.А., 2010). Оценивались: универсальный эндогенный иммуномодулятор с широким диапазоном биологических свойств и играющий ключевую роль в формировании иммунного ответа и отражающий функцию T-хелперов I типа ИФНγ, мощный ингибитор активной репликации вирусов ИФНα, а также фактор стимуляции В-клеток, продуцируемый T-хелперами II типа.

Объектом исследования были 80 пациентов с коинфекцией (ВИЧ и ХВГС), из них 28 женщин (35%) и 52 мужчин (65%). Средний возраст составил 35±4,7 лет. Репликативная активность ХВГС составляла более 100000 коп/мл, увеличение показателей аминотрансфераз - более двух норм, уровень лимфоцитов CD4+ был выше 300 кл/мкл (441,0±76 кл/мкл).

Диагноз ВИЧ-инфекции устанавливали на основании эпидемиологических данных, клинических проявлений и подтверждали серологическими методами иммуноферментного анализа, иммунного блоттинга. В соответствии с методическим письмом по лечению хронических вирусных гепатитов у ВИЧ-инфицированных все пациенты получали ПВТ ХВГС по стандартной схеме (пегилированный интерферон - альфа 2а 180 мкг/0,5 мл и рибавирин 1000-1200 мг в сутки) в течение 48 недель (Методическое письмо Минздравсоцразвития РФ от 20.01.2006 «Противовирусная терапия хронических вирусных гепатитов B и C у ВИЧ-инфицированных пациентов»).

В зависимости от результата терапии больные были разделены на 2 репрезентативные группы. В первой группе пациентов (50 человек) были зарегистрированы ранний, окончательный и устойчивый вирусологические ответы (РВО, ОВО и УВО) через 12, 48 и 72 недели после начала лечения, во второй группе (30 человек) - РВО, ОВО и УВО достигнуты не были.

Исследуемые группы были однородными по полу и возрасту, клинико-лабораторному и вирусологическому профилю до начала ПВТ. В обеих группах преобладал 1 генотип ВГС.

Контрольную группу составили 20 практически здоровых доноров.

Получение сыворотки для определения концентрации цитокинов: для этого периферическую кровь (5 мл) забирали шприцем из локтевой вены, центрифугировали при 3000 об/мин на холоде в течение 10 мин. Сыворотку разливали по 0,5 мл в эпиндорфы, замораживали и хранили до использования при -76°C. Расчеты количества цитокинов проводили путем построения калибровочной кривой с помощью компьютерной программы и выражали в пг/мл.

Концентрация цитокинов ИФНα, ИФНγ и ИЛ-4 в сыворотке крови определялась методом иммуноферментного анализа с использованием отечественных тест-систем (НПО «Вектор-бест», Новосибирск) по стандартным методикам производителя на сроках: перед началом ПВТ ХВГС и на 4 неделе от начала терапии.

Статистическая обработка данных проводилась с использованием программы Biostat 8.0. Достоверность различий оценивали по критерию Манна-Уитни (Pm-u), полученные данные представлены в виде M±SEM - среднее ± стандартная ошибка среднего. Для определения направленности и силы связи между изучаемыми показателями применяли ранговый непараметрический корреляционный анализ по Спирмену, корреляционные взаимодействия считались достоверными при значении коэффициента ранговой корреляции Спирмена Pr<0,01.

Как показали наши исследования, выявлены значимые отличия цитокинового профиля у больных анализируемых групп друг от друга и от показателей контроля.

Коэффициент ИФНγ/ИЛ-4 в 1 группе до начала лечения был выше контроля в 2 раза, это отражало преобладание иммунного ответа Т-хелперов 1 типа. На 4 неделе лечения коэффициент увеличивался в 1,7 раз - как свидетельство усиления активации Т-хелперов 1 типа, а именно противовирусного ответа, который сопровождался элиминацией вируса в данной группе пациентов. Во 2 группе - коэффициент ИФНγ/ИЛ-4 изначально был ниже контроля в 2 раза и затем снижался к 4 неделе терапии. Данные изменения отражали активацию Т-хелперов 2 типа и гуморального иммунитета, который, как известно, малоэффективен при противовирусном лечении.

Уровень ИФНγ был выше контроля в обеих группах (табл.1, 2). Содержание ИФНα в сыворотке крови у пациентов 1 группы было выше в 2,4 раза по сравнению с контролем (6,85 против 2,82 пг/мл, Pm-u≤0,05), а у пациентов 2 группы - практически не отличались по сравнению с контролем (2,50 против 2,82 пг/мл, Pm-u>0,05). Такое распределение вероятнее всего свидетельствует о хроническом воспалительном процессе в условиях иммуносупрессии.

На 4 неделе в обеих группах отмечалось значительное увеличение уровня ИФНα по сравнению с исходными значениями (Pm-u≤0,05), что обусловлено экзогенным его введением (пегилированный интерферон - альфа 2а). Уровень ИФНγ у пациентов в 1 группе, достигших РВО, практически не изменялся, а у пациентов 2 группы - наоборот, достоверно снижался (до начала терапии - 12,90 пг/мл, на 4 неделе - 4,20 пг/мл, Pm-u≤0,05).

Как известно, ИФНγ является универсальным эндогенным иммуномодулятором с широким диапазоном биологических свойств и относится к провоспалительным цитокинам. Снижению синтеза ИФНγ способствует ряд факторов, в т.ч. истощение цитокинпродуцирующей активности иммунокомпетентных клеток, что способствует хронизации патологического процесса и его прогрессированию (Ершов Ф.И., Наровлянский А.Н., 2011).

Изменение уровня ИФНγ в процессе ПВТ ХВГС, возможно, отражает именно те иммунные процессы, которые служат благоприятным или неблагоприятным фоном для эффективного достижения вирусологического ответа на лечение. Так, у пациентов 1 группы, ответивших на терапию, уровень ИФНγ остается стабильно высоким по сравнению с контролем, достигая максимальных значений на 4 неделе, которая является одним из «опорных пунктов» в ПВТ ХВГС (рис.1. Динамика уровней ИФНα и ИФНγ на фоне эффективной ПВТ ХВГС в зависимости от сроков лечения).

Обратная ситуация наблюдается у пациентов - «неответчиков», у которых на 4 неделе терапии уровень ИФНγ статистически значимо снижается и становится еще ниже через 48 недель, после окончания неэффективной терапии (рис.2. Динамика уровней ИФНα и ИФНγ на фоне неэффективной ПВТ ХВГС в зависимости от сроков лечения).

При анализе корреляционных связей изучаемых цитокинов в 1 группе на фоне эффективной ПВТ ХВГС обращает на себя внимание сильная достоверная прямая корреляционная связь между уровнями ИФНα и ИФНγ на 4 неделе лечения (r_s=0,68). Резкое увеличение уровня ИФНα на фоне его экзогенного введения и подъем на этом фоне уровня ИФНγ к 4 неделе терапии (РВО), тоже может рассматриваться как предиктор успешного РВО, а значит, и большей вероятности эффективности всей ПВТ ХВГС (табл.3).

Во 2 группе, у пациентов-неответчиков до начала лечения наблюдалась несколько иная картина распределения корреляционных взаимодействий (табл.4).

Таким образом, выявлен прогностический потенциал исходного уровня ИФНα, который был достоверно выше по сравнению с контролем в группе пациентов, ответивших на терапию (1 группа), и практически не отличался - в группе неответчиков (2 группа). Во второй группе пациентов данную ситуацию можно расценивать как изначально неблагоприятный фон для начала ПВТ ХВГС, обусловленный низкой противовирусной активностью клеток - продуцентов ИФНα.

В процессе лечения обращает на себя внимание динамика уровней ИФНα и ИФНγ: значительное увеличение уровня ИФНα и стабильно высокий уровень ИФНγ на 4 неделе терапии по сравнению с показателями до лечения и контролем - прогностически благоприятные факторы для эффективной ПВТ ХВГС. В то время как значительное снижение уровня ИФНγ по сравнению с показателями до лечения и контролем на 4 неделе лечения - предиктор неэффективной ПВТ ХВГС. Прогностическими факторами УВО (на 72 неделе от начал терапии) можно считать сохранение стабильно высоких уровней как ИФНα, так и ИФНγ по сравнению с контролем и показателями до лечения.

В данном исследовании было выявлено, что при ПВТ ХВГС наиболее значимые сдвиги и изменения корреляционных взаимодействий происходят уже через 4 недели после ее начала. В связи с этим можно сделать вывод о том, что корреляционные взаимодействия между уровнями цитокинов и вычисление коэффициентов их в корреляции может быть использовано в прогнозировании эффективности ПВТ ХВГС как до ее начала, так и в ранние сроки с момента ее старта, что немаловажно для определения тактики ведения пациентов (рис. 3. Алгоритм определения уровней ИФНα и ИФНγ при ПВТ ХВГС).

Полученные результаты наших исследований позволяют предложить алгоритм диагностики эффективности ПВТ ХВГС на ранних сроках лечения.

Уровень ИФНα более 3,99 пг/мл до начала лечения, увеличение его уровня в 100 раз и более через 4 недель после начала лечения на фоне экзогенного введения ИФНα; значения ИФНγ в интервале от 8,32 до 13,1 пг/мл до начала и через 4 недели после начала лечения; значение коэффициента ИФНγ/ИЛ-4 более 6,72±0,50 до лечения и его увеличение в процессе терапии - предикторы успешной ПВТ ХВГС на фоне ВИЧ-инфекции.

Пример осуществления способа. Клинический случай использования алгоритма обследования:

1. Пример эффективной ПВТ ХВГС

Больной Б., 39 лет, находился на стационарном лечении в ГБУЗ ККБ №2 (Центр СПИД) с 18.06.12 с диагнозом: ВИЧ-инфекция, 4Б стадия, фаза прогрессирования на фоне отсутствия АРВТ. Хронические герпесвирусные инфекции (ВПГ, ЦМВ, ВЭБ), латентная фаза. Хроническая ВЭБ-инфекция, фаза активации. Хронический вирусный гепатит C, фаза репликации, умеренной степени активности. Фиброз F1 по METAVIR. Синдром зависимости от опиоидов и алкоголя, воздержание.

ИБ (+) от 14.08.01, состоит на Д-учете по ВИЧ с 2012 г. CD4+ - лимфоциты - 583 кл/мкл, ВН ВИЧ - 29089 коп/мл (от 03.04.11), АРВТ не получал, гепатит C с 1998 г.

2. Пример неэффективной ПВТ ХВГС

Больная Е., 32 года, находилась на стационарном лечении в ГБУЗ ККБ№2 (Центр СПИД) с 23.01.12 с диагнозом: ВИЧ-инфекция, 4Б стадия, фаза ремиссии на фоне АРВТ. Кандидозе ротовой полости. Хронический вирусный гепатит C, фаза репликации, минимальной степени активности. Хроническая герпесвирусная инфекция (ЦМВ, ВПГ), латентная фаза. Синдром зависимости от опиоидов, воздержание.

Результаты лабораторного обследования до начала лечения:

07.02.12 по показаниям назначена ПВТ ХВГС: пегасис 180 мкг/0.5 мл 1 p/нед п/к, рибавирин 200 мг 3 т утром и 2 т вечером. Переносил хорошо, жалоб не предъявлял.

Список литературы

1. Методическое письмо Минздравсоцразвития РФ от 20.01.2006 N 163 - РХ «Противовирусная терапия хронических вирусных гепатитов B и C у ВИЧ-инфицированных пациентов». - М. - 2007. - 32 с.

2. Soriano V, Puoti М, Sulkowski М, et al. Care of patients coinfected with HIV and hepatitis C virus: 2007 updated recommendations from the HCV-HIV International Panel. AIDS 2007; 21:1073-1089.

3. Martin-Carbonero L, Maida I, Sotgiu G, Vispo E, Barreiro P, Gonzalez-Lahoz J, Soriano V. Differences in liver fibrosis and response to pegylated interferon plus ribavirin in HIV/HCV-coinfected patients with normal vs elevated liver enzymes. J Viral Hepat. 2010 Dec; 17(12):866-71.

4. Hammer SM, Eron JJ Jr, Reiss P, Schooley RT, Thompson MA, Walmsley S, Cahn P, Fischl MA, Gatell JM, Hirsch MS, Jacobsen DM, Montaner JS, Richman DD, Yeni PG, Volberding PA; International AIDS Society-USA. Antiretroviral treatment of adult HIV infection: 2008 recommendations of the International AIDS Society-USA panel. JAMA. 2008 Aug 6; 300(5):555-70.

5. Martin-Carbonero L, de ledinghen V. Moreno A, et al. Liver fibrosis in patients with chronic hepatitis С and persistently normal liver enzymes: influence of HIV infection. J Viral Hepat 2009; 16:790-795.

6. Nuñez М, Miralles C, Berdún MA, et al. Role of weight-based ribavirin dosing and extended duration of therapy in chronic hepatitis С in HIV-infected patients: the PRESCO trial. AIDS Res Hum Retroviruses 2007, 23:972-982.

7. Soriano V. Labarga P. Ruiz-Sancho A. Garcia-Samanicgo J. Barreiro P. Regression of liver fibrosis in hepatitis С vims/HIV-coinfectcd patients after treatment with pegylated interferon plus ribavirin. AIDS 2006; 20:2225-2227.

8. Labarga P. Soriano V, Vispo E. et al. Hepatotoxicity of antiretroviral drugs is reduced after successful treatment of chronic hepatitis С in HIV-infected patients. J Infect Dis 2007; 196:670-676.

9. Ющук И.Д., Климова Е.А., Знойно О.О., Кареткина Г.Н., Максимов СЛ., Маев И.В. Вирусные гепатиты: Клиника, диагностика, лечение. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2012. - 160 с. (Библиотека врача-специалиста).

10. Протоколы лечения больных ВИЧ-инфекцией. Рекомендации федерального научно-методического центра по профилактике и борьбе со СПИДом по применению антиретровирусных препаратов // Эпидемиология и инфекционные болезни. Актуальные вопросы. - 2011. - №3.

11. Ситдыкова Ю.Р. Влияние высокоактивной антиретровирусной терапии на систему иммунитета больных с ВИЧ-инфекцией [Текст]: обзор / Ситдыкова Ю.Р., Серебровская Л.В., Кравченко А.В. // Терапевт. арх. - 2002. - №11. - С.80-82.

12. Корочкина О.В., Рюмин A.M. Оптимизация тактики ведения больных хроническим гепатитом С. - Издание: Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2013. - № 2. - С.24-27.