Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ УРОВНЯ АРТЕРИАЛЬНОГО ДАВЛЕНИЯ У ЖЕНЩИН В КОНЦЕ БЕРЕМЕННОСТИ

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования уровня артериального давления у женщин в конце беременности.

Артериальная гипертензия (АГ) одна из наиболее распространенных форм патологии. Частота гипертензивных состояний у беременных колеблется от 15 до 20%, а в некоторых регионах России до 29% [Вихляева, Е. М. Доклинические проявления системных нарушений, клинические исходы и отдаленные последствия преэклампсии [Текст] /Е. М. Вихляева //Акушерство и гинекология. - 2009. - №1. - С. 3-6]. Гипертензивные расстройства при беременности - одна из важнейших проблем здравоохранения во всем мире. Клиническая значимость повышения артериального давления при беременности объясняется высокой частотой патологических состояний, которые развиваются у беременных при высоком уровне артериального давления [Верткин А.Л., Ткачева О.Н., Мурашко Л.Е. и др. Артериальная гипертония беременных: диагностика, тактика ведения и подходы к лечению [Текст]//Лечащий врач. - 2006. - №3. - С. 22-25.; Гмурман В.Е. Теория вероятности и математическая статистика. - М.: Высшая школа, 2006. - 284 с.; Макаров О.В., Николаев Н.Н., Волкова Е.В. Артериальная гипертензия у беременных. Только ли гестоз? [Текст] //М.: Гэотар-Медиа, 2006. - 176 с.]. Наиболее опасными являются преэклампсия (5,5%), преждевременная отслойка нормально расположенной плаценты (5-10%), внутриутробная гибель плода, связанная с плацентарной недостаточностью (24,5%). Материнская и перинатальная смертность вследствие осложнений, вызванных повышением артериального давления у беременных, составляет по данным ВОЗ от 20 до 40% [Верткин А.Л., Ткачева О.Н., Мурашко Л.Е. и др. Артериальная гипертония беременных: диагностика, тактика ведения и подходы к лечению [Текст] //Лечащий врач. - 2006. - №3. - С. 22-25.; Гмурман В.Е. Теория вероятности и математическая статистика. - М.: Высшая школа, 2006. - 284 с.].

Артериальное давление регулируется различными механизмами. К артериальной гипертензии, наряду с другими факторами, может приводить нарушение его сосудистой регуляции, ассоциированное со сниженным содержанием оксида азота в крови.

Ранним предиктором этих нарушений является эндотелиальная дисфункция, к наиболее важным маркерам которой относят уровни оксида азота и эндотелина-1 [Вихляева, Е. М. Доклинические проявления системных нарушений, клинические исходы и отдаленные последствия преэклампсии [Текст] /Е. М. Вихляева //Акушерство и гинекология. - 2009. - №1. - С. 3-6]. При «нормальной» функции эндотелия баланс всегда сдвинут в сторону поддержания вазодилятации, который обеспечивается, в том числе, и за счет стабильной, достаточной экспрессии эндотелиальной NO-синтазы. Этот фермент участвует в синтезе NO и, следовательно, в регуляции сосудистого тонуса и артериального давления. Изменения экспрессии NO-синтазы ассоциируются с целым рядом сердечно-сосудистых заболеваний, в том числе и артериальной гипертензией [Айламазян Э. К. Неотложная помощь при экстремальных состояниях в акушерской практике. [Текст] //3-е изд. СПб. 2002, с. 426-432.; H. Critchley, А. Poston, J. Walker, Pre-eclampsia, [Text] //RCOG Press, London (2003), рр. 189-207].

Ген eNOS локализован в хромосоме 7q35-36. В экзонах и интронах гена eNOS обнаружено несколько полиморфных участков, среди которых наиболее изучены два, а именно минисателлитный повтор в интроне 4 (eNOS 4a/4b полиморфизм) и мутация в положении 298 белковой последовательности, ведущая к замене остатка глутаминовой кислоты на аспарагиновую (Glu298Asp). В случае полиморфного маркера 4a/4b eNOS обнаружена корреляция между генотипами и уровнем нитратов и нитритов в крови, напрямую связанная со скоростью выработки NO эндотелием сосудов. Носители генотипа 4b/4b имеют уровень нитратов и нитритов в крови на 25% выше, чем носители генотипа 4а/4а. Таким образом, можно говорить о потенциальной генетической роли генотипа 4а/4а как фактора риска развития атеросклероза и заболеваний, приводящих к нарушению нормальной выработки NO [Endothelial nitric oxide synthase Glu298Asp gene polymorphism, blood pressure and hypertension in a general population sample [Text] /B. Wolff, H. J. Grabe, C. Schlüter [et al.] //J. Hypertens. - 2005. - Vol.23, №7. - Р. 1361-1366].

Среди факторов, влияющих на уровень артериального давления, важная роль отводится β₂-адренорецепторам [Widmaier, E. P. Vander's Human Physiology: the mechanisms of body function [Text] /E. P. Widmaier, H. Raff, K. T. Strang. - 11th ed. - Boston, MA: McGraw-Hill Higher Education, 2008. - xxviii, 770 p.]. При возбуждении катехоламинами β₂-адренорецепторов, кодируемых геном ADRB2, обеспечивается «тормозной» эффект, выражающийся в расширении сосудов (коронарных, скелетных мышц), расслаблении гладких мышц, дыхательных путей. В некоторых работах установлена связь аллеля+46G полиморфизма c повышенным уровнем артериального давления и риском развития гипертензии [Beta(2)-adrenergic receptor gene variation and hypertension in subjects with type 2 diabetes [Text] /K. Bengtsson, M. Orho-Melander, O. Melander [et al.] //Hypertension. - 2001. - Vol.37, №5. - Р. 1303-1308], другие авторы не выявили таких ассоциаций [Kato N. et al., 2001; Herrmann S. et al., 2002]. Имеется ряд данных, показывающих, что полиморфизм+46G/A ADRB2 приводит к уменьшению чувствительности рецептора к действию лигандов и может быть связан с развитием артериальной гипертензией [Brodde, O. E. Beta1- and beta2-adrenoceptor polymorphisms and cardiovascular diseases [Text] /O. E. Brodde //Fundam. Clin. Pharmacol. - 2008. - Vol.22, №2. - Р. 107-125].

Для оценки сложившейся патентной ситуации был выполнен поиск по охранным документам за период с 1990 по 2013 гг. Анализ документов производился по направлению: способ прогнозирования уровня артериального давления на основе молекулярно генетических данных в зависимости от полиморфных маркеров генов.

В изученной научно-медицинской и доступной патентной литературе авторами не было обнаружено способа прогнозирования уровня артериального давления у женщин в конце беременности на основе данных о генетических полиморфизмах 4а/4b eNOS и+46G/A ADRB2 в сочетании с другими факторами, влияющими на уровень артериального давления.

За прототип выбран патент РФ №2473912 по заявке РФ №2011139871/15, 30.09.2011 «Способ прогнозирования уровня артериального давления у беременных в зависимости от генетического полиморфизма эндотелина - 1» (Чурносов М.И., Решетников Е.А., Акулова Л.Ю.; Колесников Ю.В., Полоников А.В.). Заявляемый способ, включающий выделение ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови и анализ полиморфизма K198N гена эндотелина 1 (ЕТ-1) методом полимеразной цепной реакции. В случае выявления аллеля 198К полиморфизма K198N ЕТ-1 прогнозируют риск повышения артериального давления у беременных на сроках 37-40 недель, обеспечивает получение эффективного критерия оценки изменения артериального давления у беременных, позволяющего до наступления беременности определить вероятность изменения артериального давления в сторону его повышения и применить определенную тактику ведения женщины во время всего срока гестации.

Недостаток метода в том, что анализируется только один генетический фактор - генетический полиморфизм эндотелина -1, связанный с уровнем артериального давления у беременных и не рассматриваются другие предикторы прогнозирования уровня артериального давления у женщин в конце беременности.

Задачей изобретения является расширение арсенала способов прогнозирования уровня артериального давления у женщин в конце беременности.

Технический результат - получение критериев оценки для прогноза уровня артериального давления у женщин русской национальности, являющихся уроженками Центрально-Черноземного региона России, в конце беременности, позволяющих, в том числе и до наступления беременности, определить вероятность изменения артериального давления у женщин при возникновении беременности в сторону его повышения и в связи с этим реализовать определенную тактику ведения женщин группы риска во время всего срока гестации.

В соответствии с поставленной задачей был разработан способ прогнозирования уровня артериального давления у женщин русской национальности, являющихся уроженками Центрально-Черноземного региона России в конце беременности, включающий:

- выделение ДНК из периферической венозной крови;

- анализ полиморфизмов методом полимеразной цепной реакции;

- прогнозирование уровня артериального давления у женщин в конце беременности в зависимости от выявленных генетических вариантов по локусам 4а/4b eNOS и+46G/A ADRB2 и следующих предикторов:

для САД - вес женщины до беременности, наличие ПЭ у родственников, наличие патологии сердечно-сосудистой системы, уровень САД до беременности, генетический вариант по локусу 4а/4b eNOS;

для ДАД - вес женщины до беременности, наличие ПЭ у родственников, наличие патологии сердечно-сосудистой системы, уровень САД до беременности, генетический вариант по локусу 4а/4b eNOS и генетический вариант по локусу+46G/A ADRB2.

- прогнозирование уровня систолического артериального давления у женщин в конце беременности по результатам уравнения множественной регрессии следующего вида:

Y₁=15,455+2,544x₁+9,946x₂+0,736x₃+4,716x₄+0,185x_5, где x₁ - генетический вариант по локусу - 4а/4b eNOS (4b4b-1; 4a4b-2; 4a4a-3), x₂ - наличие преэклампсии у родственников (да-0; нет-1), x₃ - уровень систолического артериального давления до беременности, мм рт.ст., x₄ - наличие патологии сердечно-сосудистой системы (да-0; нет-1), x₅ - вес женщины до беременности, кг.

- прогнозирование уровня диастолического артериального давления по результатам уравнения множественной регрессии следующего вида:

Y₂=14,200+7,768x₁-2,877x₂+7,500x₃+0,414x₄+3,668x_5,

где x₁ - генетический вариант по локусу - 4а4b eNOS ((4b4b+4a4b)-1; 4а4а-0), x₂ - генетический вариант по локусу+46G/A ADRB2 ((GG+GA)-1; АА-0), x₃ - наличие преэклампсии у родственников (да-0; нет-1), x₄ - систолическое артериальное давление до беременности, мм рт.ст., x₅ - наличие патологии сердечно-сосудистой системы (да-0; нет-1).

Новизна и изобретательский уровень заключается в том, что из уровня техники не известна возможность прогноза уровня артериального давления у женщин русской национальности, являющихся уроженками Центрально-Черноземного региона России в конце беременности по наличию генетических вариантов 4а/4b eNOS и+46G/A ADRB2 в сочетании с другими предикторами.

Способ осуществляют следующим образом:

ДНК выделяют из образцов периферической венозной крови пациентки в 2 этапа. На первом этапе к 4 мл крови добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5 мМ MgCl2, 10 мМ трис-HCl (pH=7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4ºС, 4000 об/мин в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рН=8,0) и 75 мМ NaCl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и инкубируют образец при 37ºС в течение 16 часов.

На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. Сформированную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизованной воде и хранят при -20⁰С.

Выделенную ДНК затем подвергают полимеразной цепной реакции с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров (таблица 1).

Структура праймеров и зондов, используемых для генотипирования исследуемых ДНК-маркеров

Таблица 1

Изобретение характеризуется:

Фиг.1. Дискриминации аллелей по локусу+46G/A ADRB2 методом детекции TaqMan зондов по данным величин УОФ (уровень относительной флуоресценции) каждого зонда на амплификаторе IQ5 c детектирующей системой в режиме реального времени, где - гомозиготы по аллелю+46А, - гомозиготы по аллелю+46G, - гетерозиготы+46GA, - отрицательный контроль

Фиг.2. Электрофоретическое разделение продуктов амплификации VNTR полиморфизма 4a/4b eNOS., где 3, 5, 6 - гомозиготы 4b4b; 2 - гомозиготы 4a4a; 1, 4 - гетерозиготы 4a4b.

Возможность использования предложенного способа для оценки уровня артериального давления у женщин в конце беременности подтверждает анализ результатов обследования 452 женщин: 249 беременных, у которых наблюдалось повышение давления к концу беременности, и 203 женщины контрольной группы с нормальным течением беременности. В исследуемые выборки включались индивидуумы русской национальности, являющиеся уроженками Центрально-Черноземного региона России и не имеющие родства между собой. Средний возраст основной группы 27,11±6,42 лет (варьировал от 18 до 44 лет), в контрольной - 26,5±6,36 года (варьировал от 18 до 42 лет) (р>0,05). Таким образом, группа популяционного контроля не отличалась от основной группы по возрасту, полу, национальности и месту рождения. Все клинические и клинико-лабораторные исследования проводились на базе Перинатального центра Белгородской областной клинической больницы Святителя Иоасафа, с информированного согласия пациенток на использовании материалов лечебно-диагностических мероприятий проводимых, за период госпитализации и после для научно-исследовательских целей и протоколировались по стандартам этического комитета Российской Федерации.

С использованием методов математического моделирования множественная регрессия установлено значимое влияние генетических, медико-биологических и др. факторов на уровень артериального давления у беременных (табл.2).

Коэффициенты множественной регрессии и уровень значимости показателей, используемых для прогнозирования уровня артериального давления у женщин в конце беременности.

Таблица 2

К статистически значимым (р<0,05) факторам, влияющих на уровень артериального давления у женщин в конце беременности относятся: для САД - вес женщины до беременности, наличие ПЭ у родственников, наличие патологии сердечно-сосудистой системы, уровень САД до беременности, генетический вариант по локусу 4а/4b eNOS; для ДАД - вес женщины до беременности, наличие ПЭ у родственников, наличие патологии сердечно-сосудистой системы, уровень САД до беременности, генетический вариант по локусу 4а/4b eNOS и генетический вариант по локусу+46G/A ADRB2. Результатом множественного регрессионного анализа является расчет оценок регрессионных коэффициентов a₁, а₂, …а_i уравнения [Реброва О.Ю., 2006]:

Y=C+a₁х₁+а₂х₂+а₃х₃+…+а_nх_n, где х_i - информативные признаки, значения а_i - коэффициенты для данных признаков, С - константа.

Регрессионная модель для прогнозирования уровня систолического артериального давления включает следующие предикторы: вес женщины до беременности (t=3,03; p=0,002), наличие ПЭ у родственников (t=6,72; p<0,0001), наличие патологии сердечно-сосудистой системы (t=2,50; p=0,012), уровень САД до беременности (t=10,16; p<0,0001), генетический вариант по локусу 4а/4b eNOS (t=2,02; p=0,04). Данные факторы определяют=40,30% изменчивости уровня систолического артериального давления у женщин в конце беременности F(5,340)=45,90; р<0,0001. Следует отметить, что при монофакторных моделях вклад этих предикторов в вариабельность систолического артериального давления у беременных на сроках 37-40 недель, оцененный с помощью простой регрессии существенно ниже и составляет h²=10,27% для веса женщины до беременности (t=6,29; p<0,0001), h²=14,02% для наличия ПЭ у родственников(t=7,52; p<0,0001), h²=26,61% для уровня систолического артериального давления до беременности (t=11,22; p<0,0001).

Уравнение множественной регрессии для прогнозирования уровня систолического артериального давления у женщин в конце беременности имеет следующий вид:

Y₁=15,455+2,544x₁+9,946x₂+0,736x₃+4,716x₄+0,185x_5,

где x₁ - генетический вариант по локусу - 4а/4b eNOS (4b4b-1; 4a4b-2; 4a4a-3), x₂ - наличие преэклампсии у родственников (да-0; нет-1), x₃ - уровень систолического артериального давления до беременности, мм рт.ст., x₄ - наличие патологии сердечно-сосудистой системы (да-0; нет-1), x₅ - вес женщины до беременности, кг.

Полученная регрессионная модель прогнозирования уровня диастолического артериального давления включает пять предикторов: уровень систолического артериального давления до беременности (t=8,63; (p<0,00001), наличие ПЭ у родственников (t=7,47; p<0,00001), наличие патологии сердечно-сосудистой системы (t=2,94; p=0,003), генетический вариант по локусу 4а/4b eNOS (t=3,31; p=0,001), генетический вариант по локусу+46G/A ADRB2 (t=2,06; p=0,03), которые детерминируют 34,68% изменчивости уровня диастолического артериального давления у женщин в конце беременности F(5,335)=35,57; р<0,0001. Монофакторные влияния этих предикторов составляют h²=14,02% для наличия ПЭ у родственников (t=7,94; p=0,0000), h²=19,79% для уровня систолического артериального давления до беременности (t=9,25; p<0,0001).

Уравнение множественной регрессии для прогнозирования уровня диастолического артериального давления у женщин в конце беременности имеет следующий вид:

Y₂=14,200+7,768x₁-2,877x₂+7,500x₃+0,414x₄+3,668x_5,

где x₁ - генетический вариант по локусу - 4а4b eNOS ((4b4b+4a4b)-1; 4а4а-0), x₂ - генетический вариант по локусу+46G/A ADRB2 ((GG+GA)-1; АА-0), x₃ - наличие преэклампсии у родственников (да-0; нет-1), x₄ - систолическое артериальное давление до беременности, мм рт.ст., x₅ - наличие патологии сердечно-сосудистой системы (да-0; нет-1).

С целью оценки работоспособности конкретных регрессионных моделей нами была обследована пациентка в отношении указанных факторов, влияющих на уровень артериального давления.

Так, у беременной Е. русской национальности, являющейся уроженкой Центрально-Черноземного региона России, определены следующие показатели: наличие патологии сердечно-сосудистой системы - (1), наличие ПЭ у родственников - (1), САД до беременности - 90 мм рт.ст, вес женщины до беременности - 71 кг., генетический вариант по локусу - 4а/4b eNOS (4b4b-1), генетический вариант по локусу+46G/A ADRB2 (АА-1). Подставляем эти значения признаков в два вышеуказанных уравнения и находим в каждом уравнении значение y:

Для САД:

Y₁=15,455+2,544*1+9,946*1+0,736*90,0+4,716*1+0,185*71=112,036.

Для ДАД:

Y₂=14,200+7,768*1 - 2,877*0+7,500*1+0,414*90+3,668*1=70,396.

Дальнейшее наблюдение за данной пациенткой показало, что уровень САД и ДАД в конце беременности составил 110,00 мм рт.ст. и 70,00 мм рт.ст. соответственно.

Следовательно, использование предложенного способа позволяет прогнозировать повышение артериального давления у женщин в конце беременности.

Таким образом, разработанные нами модели дают возможность прогнозировать повышенный уровень артериального давления у женщин русской национальности, являющихся уроженками Центрально-Черноземного региона России в конце беременности в зависимости от генетических вариантов локусов 4а/4b eNOS и+46G/A ADRB2 в сочетании с другими предикторами. Раннее прогнозирование повышения уровня артериального давления у женщин в конце беременности позволит формировать среди женщин при прегравидарной подготовке и на ранних сроках беременности группы высокого риска развития гипертензии в конце беременности и своевременно реализовывать в этих группах необходимые лечебно-профилактические мероприятия по предупреждению развития данного осложнения беременности.