КОМПЛЕКС НЕОЧИЩЕННОГО КОФЕИНА, УЛУЧШЕННЫЕ ПРОДУКТЫ ПИТАНИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КОМПЛЕКСА НЕОЧИЩЕННОГО КОФЕИНА И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно предварительной заявке на патент США №61/227,216, поданной 21 июля 2009 года, которая включена в данное описание посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к комплексу неочищенного кофеина, улучшенным продуктам питания с использованием комплекса неочищенного кофеина и способам их применения.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Поскольку потребители начинают все более заботиться о своем здоровье, они часто желают включить в свой рацион продукты с функционально оздоровительными преимуществами. В некоторых случаях диета может быть полезна для минимизирования или контроля некоторых проблем со здоровьем.

Например, сахарный диабет возникает, когда тело не вырабатывает достаточное количество инсулина, в результате чего повышен уровень глюкозы в крови. В некоторых случаях содержание глюкозы в крови можно поддерживать в пределах нормы, соблюдая диету и выбирая тип потребляемых продуктов. В других случаях глюкозу в крови можно контролировать, добавляя дополнительный инсулин, который стимулирует усвоение глюкозы клетками. Однако иногда диабетики становятся устойчивыми к инсулину, и их тело больше не реагирует на его присутствие, что приводит к осложнению контроля уровня глюкозы в их крови. В связи с этим появляется желание найти дополнительные способы, чтобы получить функционально оздоровительные преимущества из продуктов и диеты, такие как, например, альтернативные способы контроля глюкозы в крови.

Кофеин или 1,3,7-триметилксантин широко используется в кофе и других напитках. Он встречается в природе в бобах, в листьях и плодах некоторых растений, включая кофейные зерна и листья чая. В некоторых случаях чистый кофеин, который получен путем декофеинизации и очистки, используется как добавка к некоторым напиткам, продуктам питания и лекарствам. Остаток после процесса очистки, как правило, отбрасывается как отход.

Неочищенный кофеин является основным побочным продуктом при декофеинизации зеленых зерен кофе. Кофе без кофеина насчитывает около 10% от общего потребления кофе, и таким образом тысячи тонн неочищенного кофеина производится ежегодно. В дополнение к кофеину, в зеленых зернах кофе содержится широкий спектр биологически активных фитохимических веществ, в том числе хлорогеновые кислоты и кофейные масла. Некоторые из фитохимических веществ, не содержащие кофеин, удаляются в процессе декофеинизации.

Неочищенный кофеин является исходным продуктом для производства чистого кофеина, который используется в напитках, продуктах питания и лекарствах. Остатки без кофеина обычно удаляются, как отходы. В свете многочисленных исследований, которые продемонстрировали преимущества фитохимических веществ кофе для здоровья, авторы предположили, что неочищенный кофеин может тоже обладать положительным эффектом, так как содержит в себе те же бескофеиновые компоненты.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Вкратце, авторы определили множественную биологическую активность в неочищенном кофеине, в том числе сильную антиоксидантную способность, способность стимулировать усвоение глюкозы человеческими жировыми и мышечными клетками, а также ингибиторное действие против воспалительных ферментов ЦОГ-2. Такая активность происходит благодаря биологически активным частицам, выделяющимся во время процесса декофеинизации, вместе с кофеином.

В соответствии с одним из аспектов, улучшенные съестные запасы, такие как продукты питания, продовольственные продукты и напитки включают в себя оптимальное количество функциональных добавок в виде комплекса неочищенного кофеина, состоящего из смеси кофеина и биологически активных соединений, полученных из кофейной основы. Было обнаружено, что этот комплекс неочищенного кофеина эффективно стимулирует усвоение глюкозы клетками и обеспечивает антиоксидантные свойства и/или противовоспалительные преимущества. В то время как чистый кофеин часто используется в ряде продуктов, начиная от лекарств и заканчивая кофеиновыми напитками, он не обладает функциональными свойствами, обнаруженными в комплексе неочищенного кофеина. В самом деле, комплекс неочищенного кофеина демонстрирует более выраженные функциональные эффекты относительно стимуляции потребления глюкозы, обеспечения антиоксидантами и противовоспалительными преимуществами на грамм основы, чем кофеиновые кофе и чай.

Считается, что эти неожиданные преимущества являются результатом достаточного количества биологически активных соединений на кофейной основе и/или синергического эффекта кофеина с биологически активными соединениями на кофейной основе. Эти биологически активные соединения обычно являются остаточным продуктом после декофеинизации и процесса очистки для получения чистого кофеина. Ранее такие биоактивные соединения уничтожались. Не ограничиваясь теорией, считается, что биологически активные соединения на основе кофе получены из исходных кофейных зерен и/или потенциально из необжаренных зеленых кофейных зерен. Таким образом, не ожидается, что неочищенный кофеин, полученный из других источников кофеина, таких как чай, шоколад и им подобные, продемонстрирует те же функциональные преимущества, что и у комплексов неочищенного кофеина, описанных здесь, потому что чай или шоколад и ему подобные источники кофеина не имеют биологически активных соединений на основе кофе. Опять же, не ограничиваясь теорией, считается, что функциональные преимущества комплекса неочищенного кофеина могут появляться из-за их уровня концентрации и/или определенных биологически активных соединений в комплексе схожих с кофеином и/или уровня концентрации биологически активных соединений в отсутствии различных липидов, сахаридов и других групповых компонентов, представленных в исходных кофейных зернах перед декофеинизацией.

В одном случае было обнаружено, что эффективные дозы комплекса неочищенного кофеина и биологически активных соединений на основе кофе, как правило, обладают способностью контролировать уровень глюкозы в крови так же или даже лучше, чем искусственное использование инсулина, стимулирующего усвоение глюкозы клетками скелетных мышц и жировыми клетками. Такой уровень усвоения глюкозы клетками не проявляется при использовании только чистого кофеина. В результате ожидается, что способы и продукты с комплексами неочищенного кофеина могут быть использованы в качестве замены инсулина для контроля уровня глюкозы в крови, особенно для тех диабетиков, которые стали устойчивыми к инсулину. В других случаях было обнаружено, что эффективные дозы комплекса неочищенного кофеина и биологически активные соединения могут иметь способность быть более эффективными, чем аспирин в противовоспалительном действии и обладают свойствами антиоксидантов.

Здесь используется комплекс неочищенного кофеина, который состоит в основном из неочищенного кофеина, полученного в качестве побочного сырьевого продукта во время типичного процесса декофеинизации, который превращает обычный кофе в кофе без кофеина. В соответствии с одним из аспектов данного изобретения, комплекс неочищенного кофеина состоит из большого количества кофеина и маленького количества биологически активных соединений на основе кофе. В соответствии с другим аспектом, комплекс неочищенного кофеина состоит из от 90% до 95% неочищенного кофеина и от 5% до 10% биологически активных соединений, полученных из обычного кофе или из зеленых зерен кофе. Кроме того, комплекс неочищенного кофеина может практически не содержать кислот, сахара, белков и других исходных компонентов кофе. В соответствии с еще одним из аспектов данного изобретения, комплекс неочищенного кофеина состоит из менее чем 0,01 процента хлорогеновых кислот и их лактоновых производных, менее чем 0,1 процента сахара и менее чем 0,01 процента белков, что в данном случае означает, что практически не содержит примесей для целей данного раскрытия.

В соответствии с одним из аспектов данного изобретения, улучшенная пища, продукты питания или напитки могут содержать от 0,05 процента до 25 процентов комплекса неочищенного кофеина, но его количество может варьироваться в зависимости от конкретной пищи, от желаемого функционального преимущества и других факторов. В частности, от 0,1 до примерно 15 процентов комплекса неочищенного кофеина может быть добавлено в безалкогольные напитки, печенье, сыр, крекеры, порошковые напитки, обжаренный и молотый кофе, растворимый кофе и тому подобное. Конечно, это всего несколько примеров продуктов и напитков, с которыми комплекс неочищенного кофеина может быть использован. В одном конкретном случае комплекс неочищенного кофеина хорошо подходит для применений с бескофеиновой основой. В другом случае комплекс неочищенного кофеина может приниматься отдельно от продуктов питания, например, в виде уколов, заглатывания или с помощью трансдермального пластыря. Комплекс неочищенного кофеина может быть представлен в виде таблеток, капсул, жевательных резинок, пленок и тому подобное.

Кроме того, биологически активные соединения на основе кофе могут быть очищены и отделены от кофеина и использованы отдельно от кофеина. Если биологически активные соединения используются отдельно от кофеина, то можно ожидать, что от 0,1 до 15 процентов будут смешаны с различными продуктами питания и напитками, такими как безалкогольные напитки, печенье, сыр, крекеры, и/или обжаренным и молотым кофе или растворимым кофе и им подобными.

В следующем случае представлены способы применения комплекса неочищенного кофеина. Например, описываются способы стимулирования усвоения глюкозы клетками, обеспечения антиоксидантными или противовоспалительными свойствами на пациентах или организмах, нуждающихся в этом, путем применения достаточного количества комплекса неочищенного кофеина или употребления продуктов питания и напитков, содержащих его. В соответствии с одним из аспектов данного изобретения, комплекс неочищенного кофеина может быть смешан с продуктами питания или напитками или с исходными веществами продуктов питания или напитков таким образом, чтобы комплекс потреблялся и, как ожидается, обеспечивал функциональную пользу. С другой стороны, существует мнение, что комплекс неочищенного кофеина можно употреблять напрямую, чтобы достичь усвоения глюкозы. Еще в одном случае способы стимулирования усвоения глюкозы клетками скелетной мышцы или жировыми клетками осуществляются при получении такими клетками достаточного количества комплекса неочищенного кофеина.

В соответствии с одним из аспектов данного изобретения предложены способы получения комплекса неочищенного кофеина и продукты питания, полученные такими способами. Один из способов, например, состоит в том, что улучшенные продукты питания могут быть получены сначала декофеинизацией кофе до продукта декофеинизации и побочного продукта неочищенного кофеина, имеющего биологически активные соединения на основе кофе, как результат коэлюции кофеина во время процесса декофеинизации. Побочный продукт неочищенного кофеина затем преобразуется в комплекс неочищенного кофеина, содержащий от 90 до 95 процентов кофеина и от 5 до 10 процентов биологически активных соединений, который может быть смешан с продовольствием, продуктами питания и напитками для получения улучшенного продовольствия, продуктов питания и напитков. Один из способов получения комплекса неочищенного кофеина - декофеинизация двуокисью углерода в жидкой фазе.

Комплекс неочищенного кофеина может быть напрямую добавлен, впрыснут, введен, подмешан или иным образом добавлен в продукты питания или напитки, или добавлен, впрыснут, введен, подмешан в исходные продукты или ингредиенты продовольствия, продуктов питания или напитков. Желательно, чтобы до того как комплекс неочищенного кофеина будет добавлен в продукты питания и напитки, его хранили при комнатной температуре и в защищенном от дневного света месте. Как было упомянуто выше, от 0,5 до примерно 25 процентов комплекса неочищенного кофеина может быть смешано с продуктами питания или напитками или с исходными продуктами продуктов питания или напитков, что считается эффективным для получения функциональных преимуществ, описанных выше.

В соответствии с одним из аспектов данного изобретения, комплекс неочищенного кофеина может быть далее очищен или рафинирован, чтобы извлечь или сконцентрировать некоторые биологически активные соединения на основе кофе. Если продолжать очистку, то биологически активные соединения могут быть сконцентрированы до определенного уровня или даже выделены из кофеина, для получения биологического экстракта (который состоит из биологически активных соединений на основе кофе и, желательно, менее чем на 1% из кофеина). Этот биологический экстракт теперь может быть добавлен в продукты питания, напитки или фармацевтическую продукцию, чтобы увеличить поглощение глюкозы, а также антиоксидантные и противовоспалительные способности.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

ФИГ. 1 - схематический способ выделения неочищенного кофеина, имеющего пищу в качестве конечного продукта;

ФИГ. 2 - схематический способ выделения неочищенного кофеина, имеющего медицинские препараты в качестве конечного продукта;

ФИГ. 3 - схематический способ выделения неочищенного кофеина, имеющего косметические средства в качестве конечного продукта;

ФИГ. 4 - схематический способ выделения неочищенного кофеина, имеющего пищевую добавку в качестве конечного продукта;

ФИГ. 5 - схематический способ выделения неочищенного кофеина, имеющего биологический препарат в качестве конечного продукта;

ФИГ. 6 - график усвоения глюкозы человеческими жировыми клетками и клетками скелетных мышц;

ФИГ. 7 - график противовоспалительного процесса;

ФИГ. 8А и 8В - хроматограммы комплекса неочищенного кофеина;

ФИГ.9 - диаграмма выделения кофеина сверхкритическим СО₂ из кофе.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Понятие «пищевые продукты», согласно «Федеральному акту о пищевых продуктах, медицинских препаратах и косметических средствах» - это (1) продукты и напитки, используемые человеком в пищу, (2) жевательная резинка и (3) продукт, используемый как компонент какого-либо из этих продуктов.

Понятие «медицинские препараты», согласно «Федеральному акту о пищевых продуктах, медицинских препаратах и косметических средствах» - препараты, признанные Фармакопеей США, Гомеопатической Фармакопеей США или Национальным Формуляром или каким-либо дополнением к одному из них, и предназначенные для применения при диагностике, лечении, смягчении последствий, терапии или профилактики заболеваний у человека или других живых существ, препараты (кроме продуктов питания), предназначенные для влияния на структуру и функции человеческого тела или каких-либо других живых существ, а также препараты, используемые как компонент какого-либо из указанных здесь препаратов.

Понятие «косметические средства», согласно «Федеральному акту о пищевых продуктах, медицинских препаратах и косметических средствах» - средства, предназначенные для протирания, опрыскивания, посыпания или распыления, введенные внутрь или нанесенные другим способом на человеческое тело или его части с целью очистить, сделать более привлекательным, подчеркнуть красоту или изменить внешний вид, а также средства, используемые как компонент какого-либо из этих средств.

Понятие «биологически активные добавки», согласно «Федеральному акту о пищевых продуктах, медицинских препаратах и косметических средствах» - это продукты, предназначенные: для дополнения пищи путем увеличения потребления пищевых веществ и содержащие хотя бы один из таких ингредиентов, как витамины, минералы, лекарственные травы или другие растения, аминокислоты, субстанции, предназначенные для дополнения пищи путем увеличения потребления пищевых веществ или концентратов, метаболитов и экстрактов, или комбинации любых ингредиентов, описанных выше.

Понятие «биологический препарат», согласно Федеральному агентству по контролю пищевых продуктов и лекарственных средств - это любой вирус, лечебная сыворотка, токсин, антитоксин или аналоговый продукт, применяемый для предотвращения или лечения болезней или травм человека.

Пищевые продукты, согласно Федеральному агентству по контролю пищевых продуктов и лекарственных средств, делятся на следующие основные категории: хлебобулочные изделия и смеси для выпечки, включающие в себя готовые к употреблению и готовые к выпеканию продукты, муку и смеси, которые требуют приготовления перед подачей на стол; алкогольные напитки, включающие в себя солодовый напиток, вина, ликеры и коктейли; безалкогольные напитки и полуфабрикаты для напитков, включающие в себя особые и пряные чаи, газированные напитки, заменители кофе, желатиновые напитки с фруктовым и овощным вкусами; каши на завтрак, включающие в себя готовые к употреблению, моментальные и обычные горячие каши; сыры, включающие в себя творожный сыр и сывороточно-альбуминный сыр, сливочный сыр, натуральный сыр, тертый сыр, плавленый сыр, мягкий плавленый сыр и другие сыры; жевательная резинка, включающая в себя все формы; кофе и чай, включающие в себя обычные, бескофеиновые и растворимые; приправы и специи, включающие в себя обычные приправочные соусы, оливки, маринованные огурцы и специи, но не пряности или травы; кондитерские изделия и глазурь, включающие в себя конфеты и ароматизированную глазурь, зефир, тертое какао, коричневый, кусковой сахар, сахар-кандис, кленовый сахар, сахарную пудру, нерафинированный сахар; аналоги молочной продукции, включающие в себя искусственное молоко, замороженные или жидкие сливки, забеливатель для кофе (заменитель молока), глазурь и другие продукты, не содержащие молоко; яичные продукты, включающие в себя жидкие, замороженные или засушенные яйца и блюда, приготовленные из яиц, например, яичный рулет, омлет "фу-юнг", яичный салат, и другие блюда из замороженных яиц, но не свежие яйца; жиры и масла, включающие в себя маргарин, заправки для салатов, сливочное масло, растительные масла для салатов, шортенинги и растительные масла для приготовления блюд; рыбные продукты, включающие в себя готовые основные блюда, салаты, закуски, замороженные блюда и паштеты, содержащие рыбу, моллюсков и других водных животных, но не свежую рыбу; свежие яйца, включающие приготовленные яйца и блюда из яиц, сделанные только из свежих натуральных яиц; свежая рыба, включающая в себя свежую и замороженную рыбу, моллюсков и других водных животных; свежие фрукты и фруктовые соки, включающие в себя только сырые фрукты, цитрусовые, дыни, арбузы и ягоды, а также изготовленные в домашних условиях фруктовые напитки и пунш, сделанный из них; свежее мясо, включающее в себя свежую или замороженную в домашних условиях говядину, телятину, свинину, ягнятину или баранину и блюда, приготовленные из мяса в домашних условиях, такие как салаты, закуски или паштеты для бутербродов; свежая птица, включающая в себя только свежую домашнюю птицу или дичь и приготовленные в домашних условиях из нее блюда, такие как салаты, закуски или паштеты для бутербродов; свежие овощи, помидоры и картофель, включающие в себя свежие и приготовленные в домашних условиях овощи; замороженные молочные десерты и смеси, включающие в себя мороженное, молочное мороженное, шербеты и другие замороженные молочные десерты, и деликатесы; фруктовый лед и фруктовое мороженое, включающие в себя все замороженные фрукты и фруктовое мороженое; муссы, пудинги и начинки, включающие в себя ароматизированные муссы, пудинги, заварной крем, парфэ, начинки для пирогов, салаты на основе желе; зерновые продукты и макаронные изделия, включающие в себя макароны и лапшу, блюда из риса, и замороженные блюда без мяса или овощей; подливки и соусы, включающие в себя все мясные соусы и подливки, а также молочные, томатные, сливочные и особенные соусы; карамели и леденцы от кашля, включающие в себя все виды карамелей; травы, семена, пряности, приправы, смеси, экстракты и ароматизаторы, включающие в себя, все натуральные и искусственные пряности, смеси и ароматизаторы; джемы и желе, включающие в себя приготовленные в домашних условиях джемы, желе, повидло, варенье и сладкие пасты; магазинные джемы и желе, включающие в себя изготовленные на продажу джемы, желе, повидло, варенье и сладкие пасты; мясные продукты, включающие в себя мясо и все блюда, содержащие в себе мясо, салаты, закуски, замороженные мясные блюда, начинки для бутербродов, изготовленные на продажу; молоко, цельное и обезжиренное, включающее в себя цельное, низкой жирности и обезжиренное молоко; молочные продукты, включающие в себя молоко с вкусовым наполнителем и молочные напитки, сухое молоко, взбитые сливки, легкие закуски, пасты, молочные напитки для контроля веса и другие продукты молочного происхождения; орехи и ореховые продукты, включающие в себя цельные или очищенные лесные орехи, арахис, кокосы, а также ореховые и арахисовые пасты; продукты, содержащие белки растительного происхождения, включающие в себя категорию «восстановленных белков растительного происхождения» Национальной академией наук / Национальным научным советом, а также заменители, аналоги мяса, птицы и рыбы, полученные из белков растительного происхождения; продукция из мяса птицы, включающая в себя мясо птицы и блюда, содержащие мясо птицы, а также салаты, закуски и замороженные блюда из мяса птицы и ингредиенты для бутербродов, приготовленные на продажу не в домашних условиях; консервированные фрукты и фруктовые соки, включающие в себя изготовленные на продажу консервированные фрукты, цитрусы, ягоды и смеси; салаты, соки, и фруктовые пунши, концентраты, разведенные напитки, фруктовые напитки и заменители напитков, сделанные из них; консервированные овощи и овощные соки, включающие в себя изготовленные на продажу овощи, овощные блюда, замороженные блюда из овощей, а также овощные соки и смеси; закуски, включающие в себя чипсы, соленые крендельки и другие небольшие закуски; конфеты, включающие в себя конфеты, шоколадные конфеты, помадки, мятные леденцовые конфеты и другие жевательные и с нугой конфеты; супы домашнего приготовления, включающие в себя мясные, рыбные, из мяса птицы, овощей и комбинированные супы; супы и суповые смеси, включающие в себя приготовленные на продажу супы и суповые смеси из мяса, рыбы, мяса птицы, овощей и комбинированные; белый и гранулированный сахар, включающий в себя только белый и гранулированный сахар; заменители сахара, включающие в себя гранулированные, жидкие и таблетированные заменители сахара; сладкие соусы, глазурь и сиропы, включающие в себя шоколадный, ягодный, фруктовый, кукурузный сироп, а также кленовый сладкий соус и глазурь.

В соответствии с одним из аспектов данного изобретения, комплексы неочищенного кофеина с эффективным количеством определенных биологически активных соединений на основе кофе представлены так же, как и съестные припасы, такие как продукты питания и напитки, включающие в себя, комплексы неочищенного кофеина. Было обнаружено, что эти комплексы обеспечивают уникальные функциональные преимущества, которые не были найдены в чистом кофеине. Например, было обнаружено, что комплексы неочищенного кофеина проявляют способность стимулировать усвоение глюкозы клетками, обеспечивают антиоксидантными свойствами и/или противовоспалительными преимуществами. С другой стороны, чистый кофеин, который практически на 99 процентов состоит из чистого кофеина и практически не содержит биологически активных соединений, не проявляет таких функциональных свойств. Комплексы неочищенного кофеина особенно подходят в качестве добавки для продуктов не на основе кофе, как их ингредиент, но эти комплексы могут быть соединены с жареными, молотыми и растворимыми кофейными продуктами.

В дальнейшем, представлены способы применения комплекса неочищенного кофеина. В соответствии с одним из аспектов, способы стимулирования усвоения клетками глюкозы, такими как человеческие клетки скелетных мышц или жировые клетки, представлены посредством контакта клеток с комплексом неочищенного кофеина. В соответствии с одним из аспектов, способы снижения глюкозы в крови у пациента или организма, у которых повышен уровень глюкозы в крови, осуществляются, когда пациент или организм контактирует или употребляет комплекс неочищенного кофеина.

Для целей настоящего изобретения предпочтительно, чтобы комплекс неочищенного кофеина состоял из кофеина, полученного в качестве сырого и неочищенного побочного продукта типичного процесса декофеинизации, во время которого кофе превращается в бескофеиновое кофе. Неочищенный кофеин выделяется до того, как кофеин начинают очищать для получения чистого кофеина. Комплекс неочищенного кофеина содержит в себе эффективное количество определенных биологически активных соединений на основе кофе, которые элюируются вместе с кофеином во время процесса декофеинизации. В соответствии с одним из аспектов данного изобретения, комплекс неочищенного кофеина содержит большое количество кофеина и маленькое количество биологически активных соединений на основе кофе. Например, комплекс неочищенного кофеина может содержать от 90 до 95 процентов кофеина и от 5 до 10 процентов биологически активных соединений, полученных из кофейной основы и/или из необжаренных или зеленых кофейных зерен. Кроме того, комплекс неочищенного кофеина может практически не содержать кислот, таких как хлорогеновые кислоты, сахара, белков и катехинов. Практически не содержит кислот в данном случае означает, менее чем 0,1% и предпочтительнее менее чем 0,01%. В одном из подходов, например, комплекс неочищенного кофеина состоит из менее чем 0,01 процента хлорогеновых кислот и их лактоновых производных, менее чем 0,1 процента сахара и менее чем 0,01 процента белков. Эти биологически активные соединения обычно являются побочными продуктами процессов декофеинизации и очищения для получения чистого кофеина. До этого биологически активные соединения выбрасывались. Таким образом, здесь комплексы демонстрируют новое применение до этого выбрасываемых и побочных продуктов.

Считается, что комплекс неочищенного кофеина особенно эффективен в качестве функциональных добавок, используемых в различных продуктах питания, например в бескофеиновых продуктах, таких как напитки, газированные напитки, печенье, сыр, крекеры, порошковые напитки и им подобные. Также комплексы могут быть рекомбинированы с обжаренным или молотым кофе, растворимым кофе и жидкими кофейными напитками. С одной стороны, здесь могут быть представлены продукты питания и напитки, которые включают в себя эффективное количество комплекса неочищенного кофеина, как дополнительного ингредиента, способного предоставить функциональные преимущества, описанные здесь. Комплекс неочищенного кофеина может быть смешан с продуктами питания, как их ингредиент, или он может быть смешан с различными исходными веществами или ингредиентами продуктов питания.

Точнее говоря, было обнаружено, что усвоение глюкозы клетками, антиоксидантные свойства и противовоспалительные способности, проявившиеся в лабораторных исследованиях комплексом неочищенного кофеина, описанного здесь, который включает в себя уникальный комплекс или смесь неочищенного кофеина вместе с эффективным количеством определенных биологически активных соединений на основе кофе. Чистый кофеин не демонстрирует таких свойств. Не ограничиваясь теорией, считается, что эти неожиданные преимущества являются результатом биологически активных соединений на основе кофе и/или объединенного синергетического преимущества неочищенного кофеина вместе с биологически активными соединениями на основе кофе. Как используется здесь, биологически активные соединения относятся к соединениям, которые элюируются вместе с кофеином во время процесса декофеинизации и эффективно проявляют функциональные преимущества, описанные здесь, либо сами по себе, либо во взаимодействии. Не ограничиваясь теорией, считается, что различные сочетания этих биологически активных соединений могут отвечать за каждое функциональное преимущество, описанное выше.

Более детально, было обнаружено, что в некоторых случаях комплекс неочищенного кофеина и биологически активные соединения на основе кофе демонстрируют способность контролировать уровень глюкозы в крови так же или даже лучше, чем искусственное использование инсулина, стимулируя усвоение глюкозы клетками. Например, лабораторные исследования показали, что доза около 0,01 мг/мл комплексов неочищенного кофеина продемонстрировала способность стимулировать усвоение глюкозы человеческими клетками скелетной мышцы, а также повышенную способность стимулировать усвоение глюкозы жировыми клетками, что было определено во время тестирования усвоения глюкозы эмбриональными клетками. В соответствии с одним из аспектов данного изобретения, ожидается, что примерно от 0,001 до 0,1 мг/мл комплекса неочищенного кофеина будет также эффективно, как 100 нМ инсулина для стимуляции усвоения глюкозы клетками. В результате, ожидается, что способы и продукты питания с комплексами неочищенного кофеина могут заменить инсулин для контроля уровня глюкозы в крови, особенно у тех диабетиков, которые стали невосприимчивы к инсулину.

Такой уровень усвоения глюкозы клетками не наблюдается при использовании чистого кофеина. Этот результат был неожиданным, так как предполагалось, что неочищенный кофеин будет демонстрировать пониженный результат (по сравнению с чистым кофеином) из-за сниженного уровня кофеина. Так как неочищенный кофеин содержит от 90 до 95 процентов кофеина, а чистый кофеин около 99 процентов кофеина, то ожидалось, что комплекс неочищенного кофеина продемонстрирует функциональные преимущества от 9 до 4 процента ниже, чем чистый кофеин. Ниже будет описано более подробно, однако исследования продемонстрировали, что комплекс неочищенного кофеина с низким содержанием кофеина (но значительно более высоким уровнем биологически активных соединений) демонстрирует повышенное поглощение глюкозы по сравнению с чистым кофеином.

В соответствии с одним из аспектов данного изобретения, лабораторные исследования показали, что комплекс неочищенного кофеина и биологически активные соединения на основе кофе могут быть более эффективными противовоспалительными средствами, чем аспирин. Принято считать, что фермент циклооксигеназа-2 ("ЦОГ-2") синтезирует простагландин, который вызывает воспаление. Обычно воспаление можно контролировать, используя либо стероидные препараты, или нестероидные противовоспалительные препараты ("НПВП"). Действительно известно несколько НПВП ингибиторов ЦОГ-2. Чаще всего НПВП ингибиторов ЦОГ-2 включают в себя аспирин и ибупрофен. Лабораторные исследования показали, что комплексы неочищенного кофеина, описанные здесь, демонстрируют более сильную способность подавлять активность ЦОГ-2, чем аспирин. Минимальная доза неочищенного кофеина, около 0,02 мг/мл также эффективна, как 0,19 мг/мл аспирина для подавления около 50 процентов тестируемой ферментативной активности ЦОГ-2.

В соответствии с одним из аспектов данного изобретения лабораторные исследования показали, что комплексы неочищенного кофеина продемонстрировали гидрофильные и гидрофобные свойства антиоксидантов. Чистый кофеин демонстрирует мало таких свойств.

Как описано выше, ожидается, что комплекс неочищенного кофеина хорошо подходит в качестве добавки в продукты питания. Таким образом, в соответствии с одним из аспектов данного изобретения, улучшенные продукты питания и напитки, представленные здесь, могут содержать от 0,05 процента до 25 процентов комплекса неочищенного кофеина, как эффективного количества для достижения функциональных преимуществ, описанных выше, но его количество может варьироваться в зависимости от конкретных продуктов питания, желаемого уровня функциональных преимуществ и других факторов. В одном конкретном примере ожидалось, что от 0,1 до 15 процентов комплекса неочищенного кофеина может быть добавлено в напитки, газированные напитки, снеки, конфеты, жевательные резинки, печенье, сыры, крекеры, порошковые напитки и им подобные. Конечно, этот список продуктов питания, взятых для образца, это всего лишь несколько примеров того, где комплекс неочищенного кофеина может быть использован в качестве добавки к еде. Комплекс неочищенного кофеина может быть также добавлен в обжаренный или молотый кофе, растворимый кофе и им подобные. В других случаях комплекс неочищенного кофеина может использоваться отдельно от продуктов питания, например в виде уколов, приема внутрь в виде таблеток, капсул, использоваться в трансдермальном пластыре и тому подобное. В связи с этим комплекс неочищенного кофеина может быть в форме таблеток, капсул, пилюль, пленок, эмульсий и в других пригодных для употребления формах.

Комплекс неочищенного кофеина может быть получен в процессе декофеинизации необжаренных зеленых кофейных зерен. В соответствии с одним из аспектов данного изобретения, зеленые кофейные зерна могут быть декофеинизированы для получения бескофеинового кофейного и неочищенного кофеина в качестве побочного продукта. Нежелательные составляющие, такие как активированный уголь и ему подобные могут быть при желании удалены из продукта и неочищенный кофеин при желании может быть обогащен так, как нужно, чтобы выделить или сконцентрировать определенные биологически активные добавки, чтобы сформировать конечный комплекс неочищенного кофеина, подходящий для добавки в продукты питания. В соответствии с одним из аспектов данного изобретения, побочный продукт неочищенного кофеина затем формирует комплекс неочищенного кофеина, состоящий из 90-95 процентов кофеина и 5-10 процентов биологически активных соединений. Комплекс неочищенного кофеина может быть напрямую введен в продукты питания или напитки или, как уже упоминалось выше, быть смешан с исходным веществом или добавкой продуктов питания или напитков. Как было отмечено, от 0,05 до 25 процентов комплекса неочищенного кофеина может быть смешано с продуктами питания или напитками или исходными веществами продуктов питания или напитков для получения функциональных преимуществ, описанных выше.

В соответствии с одним из аспектов данного изобретения, комплекс неочищенного кофеина может быть далее очищен, чтобы выделить биологически активные соединения на основе кофе, или обогащен, чтобы сконцентрировать определенные биологически активные соединения, которые отвечают за функциональные преимущества, описанные выше. Если продолжать очищать или обогащать, то биологически активные соединения могут быть отделены от кофеина, чтобы получить экстракт чистого кофеина и биологически активный экстракт (который состоит из биологически активных соединений) и маленькое количество или отсутствие кофеина. При желании очищенные биологически активные соединения на основе кофе могут быть сконцентрированы. Этот биологически активный экстракт может быть затем добавлен в продукты питания, напитки или фармацевтическую продукцию для увеличения поглощения глюкозы, так же как и для антиоксидантных и противовоспалительных свойств. Если очищенные биологически активные соединения используются отдельно от неочищенного кофеина, то ожидается, что от 0,1 до 15 процентов может быть смешано с различными продуктами питания или напитками, такими как напитки, газированные напитки, снеки, конфеты, жевательные резинки, печенье, сыры, крекеры, порошковые напитки, обжаренный и молотый кофе, растворимый кофе и так далее. Опять же, это только примерный список продуктов, которые считаются подходящими для комплекса неочищенного кофеина.

Рассмотрим фигуру 1, на которой схематически показан способ извлечения и формирования комплекса неочищенного кофеина. Например, исходным материалом могут быть необжаренные зеленые кофейные зерна 10, которые подвергаются процессу декофеинизации 11, чтобы получить декофеинизированные кофейные зерна 12 и экстракт неочищенного кофеина 13 в качестве побочного продукта. В соответствии с одним из аспектов данного изобретения, сырые зеленые кофейные зерна декофеинизированы во время процесса декофеинизации диоксидом углерода в сверхкритическом состоянии, в котором использован диоксид в жидкой форме для извлечения кофеина из кофе. Диоксид углерода затем можно выпарить из комплекса неочищенного кофеина. Часто экстракт неочищенного кофеина 13 либо утилизируется, как отход, или очищается дальше 15, чтобы получить экстракт чистого кофеина 16. В некоторых случаях экстракт неочищенного кофеина 13 может быть далее очищен, чтобы сформировать практически чистые биологически активные соединения 17 из остатков на этапе очистки 15. Комплекс неочищенного кофеина может быть получен из побочного продукта 13 прямо во время процесса декофеинизации или комплекс неочищенного кофеина может быть сформирован при концентрации, обогащении, очистке или даже смешивании нужного количества остатков 17 (которыми являются изолированные биологически активные соединения на основе кофе) вместе с кофеином в нужных пропорциях. Комплекс неочищенного кофеина 18 может быть добавлен в различные продукты питания, напитки, лекарственные препараты и другую продовольственную продукцию. При другом подходе, комплекс неочищенного кофеина может быть также смешан с различными исходными веществами продуктов питания, как описано ниже. Как далее показано на фигуре 1, улучшенные продукты питания или продовольственные товары 20 могут быть также получены при смешивании комплекса неочищенного кофеина 18 либо напрямую с продовольственными продуктами 20, или при смешивании комплекса неочищенного кофеина 18 с ингредиентами или исходными веществами 22 продовольственных продуктов.

Аналогичной фигуре 1, на которой схематически показан способ извлечения неочищенного кофеина, в котором конечным продуктом являются продовольственные продукты, является фигура 2, на которой схематически показан способ извлечения неочищенного кофеина, в котором конечным продуктом являются лекарственные препараты, фигура 3, на которой схематически показан способ извлечения неочищенного кофеина, в котором конечным продуктом являются косметические средства, фигура 4, на которой схематически показан способ извлечения неочищенного кофеина, в котором конечным продуктом являются пищевые добавки, фигура 5, на которой схематически показан способ извлечения неочищенного кофеина, в котором конечным продуктом являются биологические препараты.

Как на фигуре 1, также и на фигурах 2-5, исходным материалом могут быть необжаренные зеленые кофейные зерна 10, которые подвергаются процессу декофеинизации 11, чтобы получить безкофеиновые кофейные зерна 12 и экстракт неочищенного кофеина 13 в качестве побочного продукта. В соответствии с одним из аспектов данного изобретения, сырые зеленые кофейные зерна декофеинизированы во время процесса декофеинизации диоксидом углерода в сверхкритическом состоянии, в котором использован диоксид в жидкой форме для извлечения кофеина из кофе. Диоксид углерода затем можно выпарить из комплекса неочищенного кофеина. Часто экстракт неочищенного кофеина 13 либо утилизируется, как отход, или очищается далее 15, чтобы получить экстракт чистого кофеина 16. В некоторых случаях экстракт неочищенного кофеина 13 может быть далее очищен, чтобы сформировать практически чистые биологически активные соединения 17 из остатков на этапе очистки 15. Комплекс неочищенного кофеина 18 может быть получен из побочного продукта 13 прямо во время процесса декофеинизации, или комплекс неочищенного кофеина может быть сформирован при концентрации, обогащении, очистки или даже смешивании нужного количества остатков 17 (которыми являются изолированные биологически активные соединения на основе кофе) вместе с кофеином в нужных пропорциях. Комплекс неочищенного кофеина может быть добавлен в различные лекарственные препараты (ФИГ.2), косметические средства (ФИГ.3), пищевые добавки (ФИГ.4) и биологические препараты (ФИГ.5) в нужном количестве. В некоторых случаях, комплекс неочищенного кофеина может быть смешан с различными исходными веществами лекарственных препаратов (ФИГ.2), косметических средств (ФИГ.З), пищевых добавок (ФИГ.4) и биологических препаратов (ФИГ.5). А именно, как далее показано на фигурах, улучшенные лекарственные препараты 220 (ФИГ.2), косметические средства 320 (ФИГ.3), пищевые добавки 420 (ФИГ.4) и биологические препараты 520 (ФИГ.5) могут быть получены при смешивании комплекса неочищенного кофеина 18 либо напрямую с лекарственными препаратами 220 (ФИГ.2), косметическими средствами 320 (ФИГ.3), пищевыми добавками 420 (ФИГ.4) и биологическими препаратами 520 (ФИГ.5), или при смешивании комплекса неочищенного кофеина 18 с ингредиентами или исходными веществами лекарственных препаратов 222 (ФИГ.2), ингредиентами или исходными веществами косметических средств 322 (ФИГ. 3), ингредиентами или исходными веществами пищевых добавок 422 (ФИГ.4), ингредиентами или исходными веществами биологических препаратов 522 (ФИГ.5), соответствующих лекарственных препаратов (ФИГ.2), косметических средств (ФИГ.3), пищевых добавок (ФИГ.4) и биологических препаратов (ФИГ.5).

В некоторых случаях химические соединения, будь то продукты питания, лекарственные препараты, косметические средства или биологические препараты, не воспроизводят бескофеиновые кофейные зерна или кофе или производят обычный кофе.

ПРИМЕРЫ

Все процентные количества представлены процентами по весу, если не указано иное.

ПРИМЕР 1

Экстракт неочищенного кофеина был получен при декофеинизации необжаренных зеленых кофейных зерен при закритических условиях (Maximus Coffee Group, Хьюстон, штат Техас). Экстракт неочищенного кофеина был затем проанализирован, чтобы определить состав неочищенного кофеина (Silliker, Inc., Южная Голландия, штат Иллинойс). Результаты анализа показывают, что концентрация кофеина составляет около 94.8%. Таким образом, экстракт содержит не более 5,2 процентов биологически активных соединений на основе кофе.

Был оценен другой экстракт неочищенного кофеина, полученный во время процесса декофеинизации диоксидом углерода в сверхкритическом состоянии (sc СО₂). В таблице 1 приведен приблизительный состав неочищенного кофеина. Основные компоненты: кофеин (95,95%), влага (1,10%) и жир (1,04%); количество неорганических остатков, клетчатки, белков и сахара было незначительно.

Фенольные соединения являются большой группой фитохимических веществ, обнаруженных в зеленом кофе, составляющих около 10% от массы. Некоторые из фенольных соединений образуют комплексы с кофеином и, следовательно, могут быть удалены в процессе декофеинизации. авторы установили присутствие фенольных соединений в неочищенном кофеине, используя метод Фолин-Чокальтеу, и обнаружили, что общий уровень фенольных соединений составляет 10 мг СЕ/г или примерно 1% от массы неочищенного кофеина.

ПРИМЕР 2

Влияние экстракта неочищенного кофеина из примера 1 на поглощение глюкозы, как в жировых человеческих клетках (жир), так и в клетках скелетной мышцы (SMC) было протестировано (Zen Bio Research, Triangle Park, Северная Каролина). Тот же тест был проведен, чтобы оценить влияние чистого кофеина (BASF, Florham Park, штат Нью-Джерси) на поглощение глюкозы. Изначально считалось, что раз компоненты кофеина влияли на состояние здоровья, то и экстракт неочищенного кофеина будет влиять, например, считалось, что поглощение глюкозы будет на 10-5 процентов меньше, чем чистым кофеином, потому что неочищенный кофеин состоит из 90-95 процентов чистого кофеина (соответственно, в неочищенном кофеине на 5-10 процентов меньше кофеина). Однако было неожиданно обнаружено, что комплекс неочищенного кофеина (с меньшим содержанием кофеина) на самом деле показал лучшее поглощение глюкозы, чем то же количество чистого кофеина. В частности, на ФИГ.6 доза неочищенного кофеина около 0,01 мг/мл увеличила поглощение глюкозы в жировых клетках на 120% (р<0.05), по сравнению с контрольной группой, в то время как 0,01 мг/мл чистого кофеина статистически не показали такого воздействия. Эти результаты графически показаны на ФИГ.6, и проведено сравнение с инсулином. В соответствии с одним из аспектов данного изобретения, неочищенный кофеин увеличил усвоение глюкозы жировыми клетками, как минимум на 90% по сравнению с чистым кофеином, как показано на ФИГ.6.

В человеческих клетках скелетной мышцы доза около 0,01 мг/мл экстракта неочищенного кофеина увеличила поглощение глюкозы на 45% (р<0.05), по сравнению с контрольной группой, в то время как чистый кофеин статистически не показал такого воздействия. Эти результаты также графически показаны на ФИГ.6, и проведено сравнение с инсулином, как показано на ФИГ.6.

Считается, что доза неочищенного кофеина от 0,001 до 0,1 мг/мл более эффективна или как минимум не менее эффективна, чем инсулин для стимуляции усвоения глюкозы клетками. Инсулин тестировался при дозе 100 нМ (наномоль), которая считается стандартной дозировкой для усвоения глюкозы клетками и моделях клеточных культур.

В целом, ФИГ.6 иллюстрирует стимуляцию усвоения глюкозы клетками и человеческих клетках скелетной мышцы и жировых клетках инсулином (100 нМ), неочищенный кофеин (0,01 мг/мл) и чистого кофеина (0,01 мг/мл). Данные были проанализированы однофакторным дисперсионным анализом (ANOVA), а затем апостериорным тестом Тьюки для множественных сравнений. На ФИГ. 6 результаты выражены как среднее±SD. Звездочка * обозначает Р<0,05 в сравнении с человеческими клетками скелетной мышцы; знак" означает Р<0,05 по сравнению с интактными жировыми клетками.

Вкратце, было установлено воздействие неочищенного кофеина на усвоение глюкозы человеческими клетками скелетной мышцы и жировыми клетками, используя инсулин в качестве положительного контроля. В человеческих клетках скелетной мышцы 100 нМ инсулина стимулировало 2,06-кратное увеличение усвоения глюкозы, и хотя менее эффективный, чем инсулин, 0,01 мг/мл неочищенного кофеина увеличили усвоение глюкозы в 1, 45 раза. Для сравнения, 0,01 мг/мл чистого кофеина не показали значительного эффекта. Удивительно, но в человеческих жировых клетках неочищенный кофеин стимулировал усвоение глюкозы эффективнее, чем инсулин - 0,01 мг/мл неочищенного кофеина вызвали 2,20-кратное увеличение усвоения глюкозы, в то время как 100 нМ инсулина вызвали 1,6-кратное увеличение. Чистый кофеин (0,01 мг/мл) не показал значительного воздействия на усваиваемость глюкозы.

ПРИМЕР 3

Комплекс неочищенного кофеина из примера 1 был также протестирован на антиоксидантные свойства и сравнен с антиоксидантными свойствами чистого кофеина. Антиоксиданты могут быть, согласно их физическим свойствам, классифицированы на гидрофильные (растворяемые в воде) или липофильные (растворяемые в жире). Каждый вид антиоксидантов предотвращает окислительное повреждение в различных частях организма. Таким образом, чтобы предотвратить как можно больше окислительных повреждений, желательно иметь оба вида антиоксидантов. авторы обнаружили, что индекс ORAChydro составляет 329 мкмоль ТЕ/г и ORACupo составляет 129 мкмоль ТЕ/г, в то время как чистый кофеин соответствует крайне низкому ORAChydro (5 мкмоль ТЕ/г) и ORACupo (0 мкмоль ТЕ/г). Таким образом, было обнаружено, что неочищенный кофеин обладает высокими свойствами, как гидрофильных антиоксидантов, так и липофильных. С другой стороны, чистый кофеин обладает низкими свойствами гидрофильных антиоксидантов и не имеет никаких свойств липофильных антиоксидантов.

Несколько других экстрактов неочищенного кофеина, полученных в процессе декофеинизации диоксидом углерода в сверхкритическом состоянии (sc CO2) были оценены. В одном, ORAChydro составил 145 мкмоль ТЕ/г и ORACupo 66 мкмоль ТЕ/г. В другом, ORAChydro 288 мкмоль ТЕ/г и ORACupo 115 мкмоль ТЕ/г.

В соответствии с одним из аспектов данного изобретения, в котором неочищенный кофеин используется в качестве добавки, активность гидрофильных антиоксидантов может иметь уровень адсорбционной емкости по отношению к кислородным радикалам, как минимум от 150 до 300 мкмоль ТЕ/г (микромоль за Тролокс-эквивалент). В соответствии с другим аспектом данного изобретения, в котором неочищенный кофеин используется в качестве добавки, активность липофильных антиоксидантов может иметь уровень ORAC, как минимум от 50 до 100 мкмоль ТЕ/г.

Используя ORAC анализ, адаптированный для системы микроэмульсии линолеата (Sim, W.L.S. et al, Journal of Agricultural and Food Chemistry 57:3409-3414 (2009)), авторы выявили активность антиоксиданта токоферола (форма витамина Е) в сочетании с неочищенным кофеином, аскорбиновой кислотой и хлорогеновой кислотой. Данные были представлены, как относительная ORAC: 100% относительная ORAC означает, что антиоскидантная активность смеси равняется сумме каждого компонента антиоксидантной активности (аддитивный эффект), если же относительная ORAC больше чем 100% это означает, что смесь антиоксидантной активности была больше, чем сумма каждого компонента антиоксидантной активности (синергический эффект).

Авторы обнаружили, что неочищенный кофеин и аскорбиновая кислота вызывают дополнительный антиоксидантный эффект вместе с α-токоферолом (100% относительной ORAC). Для сравнения, хлорогеновая кислота вызывает синергетический эффект вместе с α-токоферолом (168% относительной ORAC).

Авторы выявили, что неочищенный кофеин, действуя совместно с α-токоферолом выявляет предполагаемое применение неочищенного кофеина, чтобы заменить для улучшения пищевые биологически активные антиоксидантные добавки на основе отокоферола.

ПРИМЕР 4

Способность экстракта неочищенного кофеина из примера 1 действовать как ингибитор ЦОГ-2 была также протестирована, и проведено сравнение с чистым кофеином и аспирином, обычным НПВП противовоспалительным средством. Было обнаружено, что комплекс неочищенного кофеина продемонстрировал способность ингибировать активность ЦОГ-2 лучше, чем аспирин, в то время как, чистый кофеин не продемонстрировал такой способности. Как было описано выше, возможность ингибировать ферменты ЦОГ-2 воспринимается как проявление противовоспалительных свойств. Эти результаты показаны графически на ФИГ.7. В таблице показано значение IC50 в мг/мл. IC₅₀ показывает эффективную дозу, которая требуется, чтобы достичь около 50 процентов ингибирования ферментов ЦОГ-2. Меньшее число означает, что меньше соединений необходимо, чтобы достичь 50 процентного уровня ингибирования. Как показано на графике, значение для аспирина составляет 0,19 мг/мл, в то время как значение для неочищенного кофеина составляет 0,02 мг/мл. Таким образом, значительно меньше неочищенного кофеина, чем аспирина, потребовалось в этом тесте для достижения 50% ингибирования. С другой стороны, значение для обычного кофе составляет 2,01 мг/мл, демонстрируя, что гораздо большее количество чистого кофеина нужно, чтобы достичь того же эффекта.

В целом, ФИГ. 7 демонстрирует ингибирование ЦОГ-2 аспиринов, обычным кофе, кофеином и неочищенным кофеином. Данные были проанализированы однофакторным дисперсионным анализом (ANOVA), а затем апостериорным тестом Тьюки для множественных сравнений. На ФИГ.7 результаты выражены как среднее ±SD. Звездочка * обозначает Р<0,05 в сравнение с аспирином.

Вкратце, авторы оценили противовоспалительную активность неочищенного кофеина, определив его влияние на воспалительные ферменты ЦОГ-2, используя аспирин в качестве положительного контроля. Неочищенный кофеин ингибировал активность ЦОГ-2, значение IC₅₀ составляло 20 мкг/мл, которое было в 9,5 раз меньше, чем у аспирина (IC₅₀, 190 мкг/мл), что указывает на то, что неочищенный кофеин является более сильным ингибитором ЦОГ-2, чем аспирин. В отличие от активности обычного кофе (IC₅₀, 2010 мкг/мл), которая в 10 раз меньше, чем у аспирина. Чистый кофеин не ингибирует активность ЦОГ-2.

ПРИМЕР 5

Комплекс неочищенного кофеина из примера 1 был далее проанализирован, чтобы частично определить некоторые компоненты биологически активных соединений на основе кофе в количестве от 5 до 10 процентов второстепенных компонентов комплекса (Brunswick Labs, Norton, Mass.). Кофеин был отделен от биологически активного экстракта в следующем порядке: (1) растворяют 48,90 мг неочищенного кофеина в 15 мл деионизированной воды (DI) и разрушают ультразвуком до полного распада экстракта неочищенного кофеина; (2) добавляют 30 мл дихлорметана (CH₂Cl₂), встряхивают, центрифугируют и собирают слой CH₂Cl₂ (нижний слой); (3) повторяют шаг 2 3-4 раза; (4) добавляют около 15 мл ацетона в слой воды (биологически активный экстракт), смешивают и разрушают ультразвуком для анализа.

Затем был проведен анализ неочищенного кофеина и изолированного биологически активного экстракта, используя тонкослойную жидкостную хроматографию, высокоэффективную жидкостную хроматографию, и масс спектрометр для подготовки хроматограммы биологически активного экстракта. График анализа экстракта представлен на ФИГ.8А и 8 В. Основываясь на ФИГ.8А и фенольном реагенте Фолина-Чокаптеу, считается, что как минимум один компонент биологически активных соединений может быть соединением фенолокислоты.

График на фигуре 8 В демонстрирует график масс-спектрометрии компонентов неочищенного кофеина и показывает присутствие бескофеиновых биологически активных соединений, показывая их масс спектральную хроматограмму. Как видно, пик кофеина приходится на молекулярную массу 195,3, как отмечено на графике ФИГ.8В. В частности, молекулярная масса как минимум трех потенциально биологически активных соединений в комплексе составляет 197,4, 187,3 и 177,5. Считается, что эти три соединения либо отдельно, либо их смеси могут быть основными компонентами биологически активных соединений неочищенного комплекса. Не ограничиваясь теорией, считается, что содержание в комплексе неочищенного кофеина этих трех основных соединений в отдельности может варьировать от 0 до 20 процентов каждого биологически активного компонента. Без кофеина чистый биологически активный экстракт может содержать от 0 до 100 процентов этих трех основных соединений очищенного экстракта, отдельно или в смеси. Другие пики на ФИГ. 8 В показывают другие незначительные соединения, также найденные в неочищенном кофеине.

Суммируя, тонкослойная жидкостная хроматография (ФИГ.8А) показывает содержание в неочищенном кофеине бескофеиновых фенольных антиоксидантов, определенных с помощью особых красителей. Третья окрашенная полоса снизу в третьей левой полосе геля была снята с хроматографа и проанализирована далее с помощью ЖХ-МС (жидкостная хроматография - масс).

В продолжение, ЖХ-МС (ФИГ.8В) демонстрирует молекулярную массу соединений мазка-отпечатка, содержащихся в снятой полосе. Молекулярная масса большинства соединений мазка-отпечатка составляет 197,4, 187,3 и 177,5 соответственно.

ПРИМЕР 6

Неочищенный кофеин. Неочищенный кофеин имеется в продаже. Он является побочным продуктом процесса декофеинизации. В целом, процесс декофеинизации включает в себя извлечение сырых зеленых кофейных зерен с растворителем. ФИГ. 9 демонстрирует подготовку неочищенного кофеина в качестве побочного продукта двуокиси углерода в жидкой фазе (scC0₂) в процессе декофеинизации. Во время этого процесса зеленые кофейные зерна замачивают в воде, до тех пора пока они не станут содержать до 50% влаги. Кофеин удаляют в экстракторе при помощи сжиженного углекислого газа при высокой температуре (90-100°С) и высоком давлении (300 атм). Сжиженный углекислый газ рециркулируется между экстрактором и скруббером, где кофеин удаляют из сжиженного углекислого газа водой. Полученный кофеин, обогащенный водным раствором, концентрируют с помощью обратного осмоса и вакуумной сушки. Приблизительный состав неочищенного кофеина был проанализирован Silliker, Inc. (South Holland, IL).

Общее содержание фенольных смол. Общее содержание полифенолов в неочищенном кофеине было установлено по методу Singleton, V.L. & J.A. Rossi, Jr., Am. J. Enol. Vitic. 16: 144-158 (1965). Один миллилитр стандартного раствора хлорогеновой кислоты или раствора неочищенного кофеина были смешаны с 15 мл воды и 1.0 мл реагента Фолин-Чокалтеу, а затем инкубированы при комнатной температуре в течение 10 минут. После добавления 20% карбоната натрия (3.0 мл) и инкубирования при температуре 40°С в течение 20 минут, уровень абсорбции был измерен при 755 нм с помощью абсорбционного спектрофотометра Agilent (Waldbronn, Germany) УФ- и видимой области. Общее содержание полифенолов было выражено в миллиграммах эквивалентов хлорогеновой кислоты на грамм неочищенного кофеина (СЕ/г).

Адсорбционная емкость по отношению к кислородным радикалам. Чтобы определить антиоксидантные значения гидрофильной фракции (ORAChydro), 5 г неочищенного кофеина выделяли вместе с 20 мл ацетона/воды (50:50 v/v) на орбитальный встряхиватель при комнатной температуре на 1 час. Смеси центрифугировали при 1972×g в центрифуге Rotanta 460R (GMI, Ramsey, MN). Уровень ORAChydro в надосадочной жидкости был определен по методу Ou (Ou, В. et al, Journal of Agricultural and Food Chemistry 49:4619-4626 (2001)) с помощью FL600 плоского флуоресцентного считывателя (Bio-Тек Instruments, Inc., Winooski, VT), контролируемого программным обеспечением KC4 3.0. Длина волны возбуждения была установлена на уровне 485 (±20) нм, и длина волны излучения на уровне 530 (±25) нм. Для определения антиоксидантных значений жировой фракции (ORACUpo) 5 г неочищенного кофеина экстрагировали дважды 10 мл гексана/дихлорметана (50:50 об/об). Значения ORAC_lipo связанной органической фазы были определены в соответствии с ранее опубликованным методом (Wu, X. et al, Journal of Agricultural and Food Chemistry 52 4026-4037 (2004); Huang, D. et al, Journal of Agricultural and Food Chemistry 50:1815-1821(2002)).

Усвоение глюкозы. Эффект in vitro неочищенного кофеина на усвоение глюкозы был определен с помощью человеческих адипоцитов и клеток скелетных мышц (Zen-Bio, Research Triangle Park, NC). Вкратце, основные человеческие подкожные адипоциты и основные человеческие миобласты были дифференцированы с помощью 96-луночных планшетов. Полученные адипоциты (2 недели после дифференцирования) или клетки скелетных мышц (10 дней после дифференцирования) обрабатывали неочищенным кофеином (0.0001-0.5 мг/мл, конечная концентрация) в присутствии ³Н-2-дезоксиглюкозы, клетки, обработанные инсулином (100 нМ) использовали в качестве положительного контроля, а необработанные клетки в качестве отрицательного. Все образцы, включая положительный и отрицательный контроли, были протестированы трижды. После двух часов инкубации при температуре 37°С и 5% СО₂, клетки были отмыты фосфатно-солевым буферным раствором и лизированы. Клеточный лизат был смешан со сцинтилляционной жидкостью и радиоактивность каждой лунки была измерена числом импульсов в минуту (СРМ).

Ингибирование ЦОГ-2. Потребление кислорода измерялось в камере сгорания Oxytherm (Hansatech Instrumental, Norfolk, England) при температуре 37°С. Реакционная смесь, состоящая из 0.5 мл буфера Tris (0.1 м, рН 8.0), 5 ед./л гема [100 мкМ диметилсульфоксида (ДМСО)] и 10 мкЛ фермента ЦОГ-2 были инкубированы в течение 1 минуты. Пять мкл каждого образца (в ДМСО или этаноле) были добавлены, и смесь была инкубирована еще в течение 1 минуты. Анализ был инициирован добавлением 5 мкл арахидоновой кислоты, и концентрация кислорода контролировалась. Первоначальный уровень потребления кислорода был получен при помощи кинетической кривой. Ингибирование ЦОГ-2 представлено в виде концентрации ингибитора, при которой первоначальный уровень потребления кислорода упал до 50% (IC₅₀).

Аддитивный эффект биологически активных соединений неочищенного кофеина в соединении с альфа-токоферолом. В 15-мл пробирках метиллинолеат (1.2 г), твин-20 (2.9 г), н-бутанол (1.5 г) и фосфатно-калиевый буфер (4.4 г) встряхивались до тех пор, пока не был получен четкий результат.OBS планшет был подготовлен с повторяющимися лунками, с Trolox в качестве эталона стандарта (20 мкл, 500, 250,125, 62.5 или 31.25 мкМ) и три набора лунок с образцами, растворенными в фосфатном буфере (20 мкл). Периметр лунок не использовался для кинетических исследований, чтобы избежать потенциального краевого эффекта. Окислительный субстрат - микроэмульсия метиллинолеата (200 мкл) - была затем добавлена. Планшет был инкубирован при температуре 37°С в течение 10 минут перед добавлением 20 мкл 2,2′-азобис(2-амидинопропан) гидрохлорида (ААРН 0.20 г/мл в фосфатном буфере) в каждую лунку, конечный объем в каждой лунке составил 240 мкл. Контрольная лунка содержала 200 мкл микроэмульсии и 4 мкл фосфатного буфера были использованы для нормализации флуоресцентного считывателя (Biotek Instruments Inc.). Кинетика реакций отслеживалась при температуре 37°С в течение 2 часов с показаниями каждые 2 минуты при помощи Synergy HT флуоресцентного считывателя микропланшета (Biotek Instruments Inc.). Считыватель микропланшета был оснащен фильтром возбуждения на 485 нм, эмиссионным фильтром на 590 нм и датчиком кислорода биосистемы, платы встряхивали каждые 20 сек с низкой интенсивностью перед каждым снятием показаний, чтобы убедиться в качестве смеси. После нормализации флуоресцентные показатели были преобразованы в концентрацию кислорода в каждой точке реакции. Значения ORAC образцов были определены, как описано ранее (Sim, W.L.S. et al., Journal of Agricultural and Food Chemistry 57:3409-3414 (2009)).

Статистический анализ. Данные были проанализированы при помощи однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA), а затем апостериорным критерием Тьюки, используя PASW Statistics 18 (Chicago, IL). Результаты представлены, как среднее ± стандартное отклонение (SD). Р<0.05 рассматривалось как статистически значимое.

Эти примеры и варианты наглядны, но не должны рассматриваться как ограничивающие область изобретения, как оно определено в данном описании и формуле изобретения.

Все ссылки в данном описании включены посредством ссылок.