Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ОЧИСТКИ ГИДРОЛИЗАТОВ ЛИГНОЦЕЛЛЮЛОЗНОГО СЫРЬЯ ОТ ИНГИБИТОРОВ АЦЕТОНОБУТИЛОВОГО БРОЖЕНИЯ

Способ очистки гидролизатов лигноцеллюлозного сырья от ингибиторов ацетонобутилового брожения

Изобретение относится к гидролизной промышленности, в частности к способам очистки гидролизатов лигноцеллюлозного сырья от ингибиторов ацетонобутилового брожения, и может быть использовано при подготовке питательных сред для получения биоэтанола, биобутанола, ацетона. Способ включает обработку гидролизатов активным илом канализационных очистных сооружений, адаптированным к питательным средам на основе веществ, ингибирующих брожение. Гидролизаты лигноцеллюлозного сырья, получаемые путем кислотного или ферментативного гидролиза, представляют собой растворы сахаров в виде смеси гексоз и пентоз и являются перспективным источником редуцирующих веществ в технологиях ацетонобутилового производства. Использование лигноцеллюлозной биомассы значительно снижает себестоимость целевых продуктов, а также решает вопрос эффективной утилизации отходов растениеводства и лесной промышленности.

Однако готовый гидролизат не может быть непосредственно использован для биохимической переработки, поскольку при проведении кислотного гидролиза или при осуществлении предварительной обработки растительного сырья перед ферментативным гидролизом образуются соединения, которые являются ингибиторами ацетонобутилового брожения. К таким веществам относятся продукты деградации сахаров, продукты деградации лигнина и продукты, полученные из лигноцеллюлозных структур.

К продуктам деградации лигнина относится фурфурол, гидроксиметилфурфурол, уксусная кислота, гидроксибензойная кислота, фенолы и др. При воздействии на сахара высокой температуры и давления глюкоза и ксилоза также могут конвертироваться в фурфурол и гидроксиметилфурфурол соответственно. Данные соединения ингибируют клеточный рост и влияют на способность культуры утилизировать углеводы. При разложении лигноцеллюлозы в среде могут образовываться уксусная и терпеновая кислоты. Разработанные на сегодняшний день методы детоксикации гидролизатов включают в себя физико-химические и биологические подходы.

Общим недостатком известных способов физико-химической детоксикации является их дороговизна и/или образование большого количества отходов, что увеличивает нагрузку на окружающую среду. Более перспективными методами, в сравнении с физико-химической очисткой гидролизатов, являются биологические способы детоксикации с использованием микроорганизмов.

Известен метод выборочной очистки от ингибиторов при помощи S. Cerevisiae. При использовании данного биоагента концентрация уксусной кислоты в среде снижается с 6,8 до 0,4 г/л за счет специфической ее утилизации дрожжами S. cerevisiae (1) Schneider Н. Selective removal of acetic acid from hardwood-spent sulfite liquor using a mutant yeast / H. Schneider // Enzyme and Microbial Technology. - 1996. - V. 19. - P. 94-98].

Известен метод детоксикации гидролизатов, основанный на использовании дрожжей Candida guilliermondii или Issatchenkia occidentalis CCTCC М 206097, способных утилизировать фурфурол и гидроксиметилфурфурол [Fonseca В. G. Biological detoxification of different hemicellulosic hydrolysates using Issatchenkia occidentalis CCTCC M 206097 yeast / B. G. Fonseca [et. al.] // J Ind Microbiol Biotechnol. - 26 July 2010. - P. 1-9].

Известен метод биологической детоксикации гидролизатов линоцеллюлозного сырья, основанный на использовании двух изолятов Issatchenkia occidentalis CCTCC М 2006097 и Issatchenkia orienalis CCTCC M 2006098, выделенных из осадка сточных вод целлюлозно-бумажного предприятия. Метод основывается на способности данных изолятов в процессе культивирования утилизировать токсичные соединения в гидролизатах, такие как фурфурол и фенольные соединения (3) [Hou-Rui, Z.; Xiang-Xiang, Q.; Silva, S. S.; Sarrouh, B. F.; Ai-Hua, C: Yu-Heng, Z.; Ke, J.; Qiu, X. Novel isolates for biological detoxification of lignocellulosic hydrolysate / H. Zhang, [et. al] // APPLIED BIOCHEMISTRY AND BIOTECHNOLOGY; 152, 2; 199-212].

Известен метод биологической очистки гидролизатов от фенолов, основанный на использовании термофильных бактерий Ureibacillus thermosphaericus. Гидролизат очищают путем выдерживания в нем данных биоагентов при температуре 50°C в течение 24 часов. Недостатком метода является отсутствие активности биоагентов в отношении фурфурола и гидроксиметилфурфурола. (4) (Okuda N. Biological detoxification of waste house wood hydrolysate / N. Okuda [et. al.] // Journal of Bioscience and Bioengineering. - 2008. -V. 106, No. 2. - P. 128-133).

Недостатком указанных способов биологической очистки является выборочная утилизация токсичных компонентов и недостаточная или низкая активность в отношении других токсикантов.

Наиболее близким к заявленному изобретению, взятым за прототип, является способ очистки гидролизатов группой микроорганизмов, выделенных из почвы. Метод основан на утилизации токсичных компонентов группой изолятов: пятью бактериями Methylobacterium extorquens, Pseudomonas sp, Flavobacterium indologenes, Acinetobacter sp., Arthrobacter aurescens и одним грибом Coniochaeta ligniaria. Указанные бактерии способны активно утилизировать токсичные компоненты гидролизата, такие как органические кислоты (уксусная, муравьиная, левулиновая), фураны и фенольные компоненты, а гриб Coniochaeta ligniaria наиболее активно потребляет фурфурол и 5-гидроксиметилфурфурол. Эффективность очистки данным методом выше, чем при использовании одной чистой культуры микроорганизмов. (5) [Lopez М. J. Isolation of microorganisms for biological detoxification of lignocellulosic hydrolysates / M. J. Lopez [et. al.] //Appl Microbiol Biotechnol. - 2004. - V. 64. - P. 125-131.

Недостатком всех известных биологических способов детоксикации, включая прототип, является необходимость проведения трудоемких процедур выделения биологического агента или консорциума микроорганизмов, поддержания их функциональных свойств и наращивания необходимого объема биомассы.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа детоксикации гидролизатов лигноцеллюлозного сырья с целью снижения трудоемкости и повышения эффективности очистки гидролизатов от токсичных компонентов.

Поставленная задача решается тем, что в способе детоксикации гидролизатов лигноцеллюлозного сырья очистка от токсичных компонентов, в отличие от прототипа, проводится активным илом канализационных очистных сооружений, адаптированным к питанию токсичными компонентами гидролизатов - фурфуролов, фенолов, уксусной и муравьиной кислот. Адаптация микрофлоры активных илов к новым субстратам и их концентрациям заключается в формировании новых (индуцибельных) ферментов в клетках микроорганизмов, а также оптимального пула конститутивных и индуцибельных ферментов, необходимых для использования указанных субстратов в качестве пищи. Используется активный ил городских канализационных очистных сооружений, бактериальная компонента которого представлена бактериями родов Pseudomonas, (64%) Bacillus (18%), Zooglea (7%) Micrococcus (5%), Chromobacterium (3%), Acinetobacter (2%), Citrobacter (1%).

Также используется активный ил канализационных очистных сооружений свиноводческих предприятий, бактериальная компонента которого представлена бактериями родов Nocardia (35%), Rhodococcus (28%), Micrococcus (18%), Pseudomonas (13%), Bacillus (6%).

Предлагаемый способ детоксикации гидролизатов лигноцеллюлозного сырья может быть осуществлен следующим образом.

Адаптация активного ила к токсичным соединениям проводится путем аэрации иловой жидкости в течение 2-3 недель с периодическим добавлением в среду фенола, ацетата натрия, формиата натрия и фурфурола и постепенным увеличением концентраций указанных веществ в среде от 5 мг/л до максимальных их концентраций в реальных гидролизатах. При этом проводится непрерывная оценка дыхательной активности микробоценоза путем измерения концентрации растворенного кислорода в иловой жидкости, что позволяет оценивать интенсивность утилизации субстратов, определять момент окончания процесса утилизации и не допустить передозировки. Адаптированный активный ил эффективно утилизирует токсичные компоненты гидролизата, не используя при этом в качестве источника углерода редуцирующие вещества.

Для детоксикации гидролизата его вносят в емкость с адаптированным активным илом. Объемная доза активного ила при этом составляет 25-30 об.%. Далее проводится аэрация гидролизата совместно с активным илом в течение 0,5-15 часов. Ход процесса детоксикации гидролизатов оценивается путем измерения концентрации растворенного кислорода в иловой жидкости. Очищенный гидролизат отделяют от биомассы путем отстаивания или отстаивания и фильтрации.

Ниже приведены примеры конкретного применения заявленного изобретения.

Пример 1. Опыты проведены с кислотным гидролизатом ели, имеющим следующую характеристику: концентрация редуцирующих веществ (РВ) 51,1 г/л, в том числе глюкозы 22,3 г/л, маннозы 15,6 г/л, ксилозы 7,9 г/л, галактозы 5,3 г/л, содержание 5-гидроксиметилфурфурола (5-ГМФ) 3,06 г/л, фурфурола 1,3 г/л, муравьиной кислоты 0,47 г/л, фенолов 2,9 г/л, уксусной кислоты 4,53 г/л. Очистка гидролизата проводилась адаптированным активным илом городских канализационных очистных сооружений, бактериальная компонента которого представлена бактериями родов Pseudomonas, (64%) Bacillus (18%), Zooglea (7%) Micrococcus (5%), Chromobacterium (3%), Acinetobacter (2%), Citrobacter (1%) в течение 15 часов при комнатной температуре в нестерильных условиях. Объемная доза ила в среде составляла 30 об.%. После детоксикации активный ил отделяли путем отстаивания и фильтрации. В результате очистки гидролизата концентрация 5-ГМФ снизилась до 0,05 г/л, фурфурола - до 0,01 г/л, муравьиной кислоты - до 0,003 г/л, фенолов - до 0,001 мг/л, уксусной кислоты - до 0,001 мг/л.

Сбраживание гидролизата проводилось штаммом бактерий Clostridium acetobutylicum АТСС 824. Начало брожения отмечено через 8-10 часов, завершение - через 72-80 часов. После сбраживания среды на основе очищенного гидролизата концентрация целевых продуктов в среде составила: бутанола 8,71 г/л, ацетона 4,16 г/л, этанола 1,01 г/л.

Контрольные опыты по сбраживанию неочищенного гидролизата показали полное отсутствие брожения.

Пример 2. Опыты проведены с кислотным гидролизатом ели, имеющим следующую характеристику: концентрация редуцирующих веществ (РВ) 51,1 г/л, в том числе глюкозы 22,3 г/л, маннозы 15,6 г/л, ксилозы 7,9 г/л, галактозы 5,3 г/л, содержание 5-гидроксиметилфурфурола (5-ГМФ) 3,06 г/л, фурфурола 1,3 г/л, муравьиной кислоты 0,47 г/л, фенолов 2,9 г/л, уксусной кислоты 4,53 г/л. Очистка гидролизата проводилась адаптированным активным илом канализационных очистных сооружений свиноводческих предприятий, бактериальная компонента которого представлена бактериями родов Nocardia (35%), Rhodococcus (28%), Micrococcus (18%), Pseudomonas (13%), Bacillus (6%). Время, требуемое для очистки, составило 13 часов. В результате очистки гидролизата концентрация 5-ГМФ снизилась до 0,03 г/л, фурфурола - до 0,01 г/л, муравьиной кислоты - до 0,002 г/л, фенолов - до 0,001 мг/л, уксусной кислоты - до 0,001 мг/л.

Сбраживание гидролизата проводилось штаммом бактерий Clostridium acetobutylicum АТСС 824. Начало брожения отмечено через 8-10 часов, завершение - через 72-80 часов. После сбраживания среды на основе очищенного гидролизата концентрация целевых продуктов в среде составила: бутанола 8,34 г/л, ацетона 4,1 г/л, этанола 1,08 г/л.

Контрольные опыты по сбраживанию неочищенного гидролизата показали полное отсутствие брожения.

Пример 3. Опыты проводились с ферментативным гидролизатом целлюлозы мискантуса неопределенного состава. Очистка гидролизата проводилась адаптированным активным илом городских канализационных очистных сооружений, бактериальная компонента которого представлена бактериями родов Pseudomonas (64%), Bacillus (18%), Zooglea (7%), Micrococcus (5%), Chromobacterium (3%), Acinetobacter (2%), Citrobacter (1%) в течение 30 минут при комнатной температуре в нестерильных условиях. Доза активного ила в среде составляла 25 об.%. Сбраживание среды на основе гидролизата проводилось штаммом бактерий Clostridium acetobutylicum АТСС 824. После сбраживания среды на основе очищенного гидролизата концентрация целевых продуктов в среде составила: бутанола 8,63 г/л, ацетона 2,16 г/л, этанола 1,02 г/л. Среда на основе неочищенного гидролизата не забродила.

Пример 4. Опыт отличается от примера 3 тем, что для детоксикации гидролизата использовался активный ил канализационных очистных сооружений свиноводческих предприятий, бактериальная компонента которого представлена бактериями родов Nocardia (35%), Rhodococcus (28%), Micrococcus (18%), Pseudomonas (13%), Bacillus (6%). После сбраживания среды на основе очищенного гидролизата концентрация целевых продуктов в среде составила: бутанола 8,43 г/л, ацетона 3,12 г/л, этанола 1,1 г/л. Среда на основе неочищенного гидролизата не забродила.

Источники информации

1. Schneider Н. Selective removal of acetic acid from hardwood-spent sulfite liquor using a mutant yeast / H. Schneider // Enzyme and Microbial Technology. - 1996. - V. 19. - P. 94-98.

2. Fonseca B. G. Biological detoxification of different hemicellulosic hydrolysates using Issatchenkia occidentalis CCTCC M 206097 yeast / B. G. Fonseca [et. al.] // J Ind Microbiol Biotechnol. - 26 July 2010. - P. 1-9.

3. Hou-Rui, Z.; Xiang-Xiang, P.; Silva, S. S.; Sarrouh, B. F.; Ai-Hua, C; Yu-Heng, Z.; Ke, I; Qiu, X. Novel isolates for biological detoxification of lignocellulosic hydrolysate / H. Zhang, [et. al.] // APPLIED BIOCHEMISTRY AND BIOTECHNOLOGY; 152, 2; 199-212.

4. Okuda N. Biological detoxification of waste house wood hydrolysate / N. Okuda [et. al.] // Journal of Bioscience and Bioengineering. - 2008. - V. 106, No. 2. - P. 128-133.

5. Lopez M. J. Isolation of microorganisms for biological detoxification of lignocellulosic hydrolysates / M. J. Lopez [et. al.] // Appl Microbiol Biotechnol. - 2004. - V. 64. - P. 125-131.