Результат интеллектуальной деятельности: ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПРАЙМЕРЫ И СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК Mycobacterium avium МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к идентификации микобактерий с помощью полимеразной цепной реакции, и может использоваться в ветеринарных диагностических и научно-практических лабораториях для выявления генетического материала Mycobacterium avium в пробах.

Быстрое и надежное выявление клинически значимых микобактерий и установление их молекулярно-генетических особенностей является чрезвычайно актуальной задачей для диагностических медицинских и ветеринарных лабораторий.

Известны синтетические олигонуклеотидные праймеры, использующиеся для выявления ДНК Mycobacterium avium (Johansen T.B., В. Djonne, M.R. Jensen, I. Olsen, 2005. Distribution of IS1311 and IS1245 in Mycobacterium avium subspecies revisited. J. Clin. Microbiol. 43: 2500-2502; G.P.S. Jadaun, P. Upadhyay, Z. Ahmed, R. Das, D. Parashar et al. Utility of IS1245 - IS1311 based PCR typing system for Mycobacterium avium isolates obtained from clinical and environmental sources // Journal of Bacteriology Research. - 2010. - V.2(1), pp.005-008).

Однако данные тест-системы, как правило, анализируют образец в режиме реального времени (Real-Time PCR), что делает дороже проведение анализа, и направлены на обнаружение фрагментов генов, свойственных не только для M.avium, но и других представителей семейства MAC.

Прототипом данного изобретения являются праймеры и способ выявления ДНК M.avium, основанный на полимеразной цепной реакции (ПЦР), включающий выделение ДНК M.avium, синтез олигонуклеотидных праймеров на фрагмент mig-гена и инсерционную последовательность IS1245, амплификацию ДНК и идентификацию продуктов ПНР с помощью электрофореза в 1,5% агарозном геле (Beggs M.L., Stevanova R., Eisenach K.D. Species identification of Mycobacterium avium complex isolates by a variety of molecular techniques. - J. Clin. Microbiol. - 2000. - p.508-512. - Vol.38, - №2).

Однако инсерционная последовательность IS 1245 не является высокоспецифичной для изолятов M.avium и обнаруживается не во всех образцах. При этом IS1245 часто идентифицируют в изолятах M.intracellulare, что затрудняет дифференциацию этих двух представителей M.avium complex. Также недостатком данных наборов праймеров является то, что они разработаны на основе структуры ДНК изолятов Mycobacterium avium, циркулирующих за пределами России и отличающихся по строению генома от российских изолятов, что может снижать их эффективность при выявлении генетического материала Mycobacterium avium на указанной территории.

Задача изобретения заключается в расширении способов выявления Mycobacterium avium в исследуемом материале с использованием олигонуклеотидных праймеров, созданных на основе микобактерий, циркулирующих на территории России с учетом строения специфических фрагментов генома российских изолятов.

Поставленная задача решается тем, что синтезируются олигонуклеотидные праймеры с высокой степенью специфичности, комплементарные характерной для M.avium области mig-гена и использующиеся для выявления ДНК М. avium, имеющие следующий нуклеотидный состав: 5'-CGT CAA AAG CGA ACT GCA-3' и 5'-ТАА ТТС GTT GCC CGA CTC-3'.

Задача решается также тем, что в способе выявления ДНК Mycobacterium avium методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), включающем выделение ДНК, амплификацию ДНК на олигонуклеотидных праймерах, перенос продукта амплификации на гель и оценку проведения реакции, согласно изобретению праймеры имеют нуклеотидные последовательности (MAVaF: 5'-CGT CAA AAG CGA ACT GCA-3') и (MAVaR: 5'-TAA ТТС GTT GCC CGA CTC-3'), в случае положительной реакции синтезируется фрагмент, соответствующий размеру 157 п.н.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами:

Пример 1. Получение олигонуклеоидных праймеров. Получение праймеров осуществляют на основе известных последовательностей штаммов Mycobacterium avium, полученных при секвенировании сибирских штаммов и представленных в базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/GenbankOverview.html), при помощи программного обеспечения «Lasergen». Полученные последовательности нескольких пар праймеров тестируют на специфичность с помощью моделирования ПЦР в программе «Vector NTI Suit».

В результате выбраны олигонуклеотидные праймеры (MAVaF: 5'-CGT САА AAG CGA ACT GCA-3') и (MAVaR: 5'-TAA TTC GTT GCC CGA CTC-3'), специфичные для M.avium.

Химический синтез праймеров осуществляется по нашему заказу в ООО «Лаборатория Медиген», там же определяется концентрация олигонуклеотидов в маточном растворе.

Пример 2. Выделение ДНК и постановка ПЦР. ДНК M.avium выделяют с использованием набора ДНК-сорб-В (ЦНИИЭ) согласно прилагаемой инструкции. Отработку условий амплификации для данной пары праймеров проводят с использованием музейных штаммов М. avium, задепонированных в Коллекции культур бактерий, бактериофагов и грибов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», выбирая режим, наиболее полно отвечающий требованиям эксперимента. Режим амплификации включает в себя: отработку времени денатурации при 95°C - 30 сек - 1 мин, температуру отжига праймеров 54°C, 58°C, 59°C, 60°C, 61°C, концентрацию ионов Mg²⁺ - от 0,8 до 2,5 mM, время циклов каждой стадии амплификации от 30 сек до 1 мин и количество циклов от 30 до 40. Критерием правильности выбранного режима для каждого этапа проводимой реакции служит показательность результата - наличие или отсутствие искомого фрагмента ДНК определенного размера на электрофореграмме.

Для ПЦР применяют готовую ПЦР-смесь GenPack PCR Universal, a также готовят инкубационную смесь конечным объемом 50 мкл, которая содержит 10 мМ Mg-буфер, 10 мМ dNTP, 2 мкл праймеров, 5 мкл ДНК-матрицы, 1 ед. ДНК-полимеразы, оставшийся объем воды. Поверх смеси наслаивают 25 мкл минерального масла. В качестве матрицы используют ДИК штаммов M.avium, выделенную из биоматериала зараженных животных и из музейных культур, задепонированных в Коллекции культур бактерий, бактериофагов и грибов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» под регистрационными номерами В-1254, В-1255, В-1256, В-1257, В-1258, В-1259. Для определения специфичности выбранной пары праймеров используют ДНК родственных видов микобактерий и микроорганизмов других родов. Для идентификации ДНК M.avium используют праймеры (MAVaF) и (MAVaR), гомологичные участку mig-гена M.avium. Выбран следующий режим амплификации с использованием отечественного амплификатора «Терцик»: денатурация при 95°C - 30 секунд, затем 40 циклов, каждый из которых состоял из денатурации при 94°C - 30 секунд, отжига при 54°C - 30 секунд, синтеза при 72°C - 30 секунд и 1 цикл досинтеза при 72°C в течение 10 минут. Продукты ПЦР анализируют в 2% агарозном геле, с нанесением в лунки 6 мкл амплификата. Электрофорез проводят в течение 1 часа 15 минут при напряжении 220 В.

Пример 3. Специфичность пары праймеров. Для оценки специфичности предложенных праймеров используют штаммы Staphylocococcus albus, Citrobacter frendii, Escherichia coli, Mycobacterium terrae, Mycobacterium arupense, Mycobacterium avium. Проводят ПЦР с пробами указанных штаммов. При анализе продуктов амплификации с помощью электрофореза в агарозном геле определяют наличие ампликонов размером 157 п.н. или их отсутствие (фиг.1). Устанавливают, что праймеры MAVaF и MAVaR амплифицируют фрагменты генома искомого размера только при работе с Mycobacterium avium и не дают положительной или неспецифической реакции при анализе ДНК бактерий других родов и с родственными видами микроорганизмов. ПНР проводили в условиях, описанных в 2 примере.

Пример 4. Определение размера продуктов ПЦР. Для электрофореза использовали 6 мкл амплификата. Маркер молекулярной массы состоит из продуктов расщепления ДИК плазмиды pBluescript II SK рестриктазой Mspl. Анализ считают положительным, если продукт ПЦР соответствует ожидаемому размеру фрагмента в 157 п.н.

Результаты проведенных экспериментов показывают, что положительные анализы продуктов ПЦР получают только тогда, когда в качестве матрицы используют ДНК M.avium.