Результат интеллектуальной деятельности: ГЕРМАТРАНОЛ-ГИДРАТ, СТИМУЛИРУЮЩИЙ ЭКСПРЕССИЮ МАТРИЧНОЙ РНК ТРИПТОФАНИЛ-ТРНК-СИНТЕТАЗЫ

Изобретение относится к биохимии, фармакологии, биологии, медицине и может быть использовано, в частности, для контроля ангиогенеза, при дислипопротеинозах различного происхождения.

Заявляемое изобретение относится к приоритетному направлению развития науки и технологий «Биомедицинские и ветеринарные технологии жизнеобеспечения и защиты человека и животных» [Алфавитно-предметный указатель к Международной патентной классификации по приоритетным направлениям развития науки и технологий / Ю.Г. Смирнов, Е.В. Скиданова, С.А. Краснов. - М.: ПАТЕНТ, 2008. - с. 15].

Несмотря на активные исследования, в клинической практике до сих пор отсутствуют лекарственные или диагностические препараты, воздействующие на цитокиновую активность аминоацил-тРНК-синтетаз.

Известно, что воспаление действует на обмен липопротеидов в стенках сосудов. При этом в процесс вовлекаются как системы неспецифического (макрофаги моноцитарного происхождения), так и специфического иммунитета (Т-клетки). Моноциты и Т-клетки мигрируют из кровотока в интиму артерий, где они дифференцируются в макрофаги, а затем, поглощая модифицированные липопротеины, трансформируются в тучные клетки (Hansson G.K., Libby P. The immune response in atherosclerosis: a double-edged sword // Nat. Rev. Immunol., 2006, v. 6, p. 508-519) [1].

Макрофаги моноцитарного происхождения широко представлены на всех стадиях развития заболевания (Mangge Н., Hubmann Н., Pilz S., Schauenstein K., Renner W., Marz W. Beyond cholesterol-inflammatory cytokines, the key mediators in Atherosclerosis // Clin. Chem. Lab. Med., 2004, v. 42, p. 467-474) [2]. Последние данные по молекулярному механизму атерогенеза через развитие местного воспалительного процесса и экспрессии цитокинов и белковых факторов в атеросклеротических бляшках свидетельствуют, что существует определенный баланс между провоспалительными и антивоспалительными цитокинами и этот баланс критичен для развития повреждения.

При регулировании цитокиновых функций важнейшую роль играют другие белковые и ферментные системы, действующие по механизму стимуляции и торможения атерогенеза. Это, в частности, аминоацил-тРНК-синтетазы (АРСазы). Установлено мощное про- и антиангиогенное действие пары: тирозил-тРНК-синтетаза и триптофанил-тРНК-синтетаза (ТРСазы) (Wakasugi K., Slike В.М., Hood J., Otani A., Ewalt K.L., Friedlander M., Cheresh D.A., Schimmel P. A human aminoacyl-tRNA synthetase as a regulator of angiogen-esis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002, v. 99(1), p. 173-177) [3]. Причем важной представляется роль ТРСазы не только в связи с ее антиангиогенной, следовательно, и антиатерогенной активностью (через прорастание «сосудов в сосудах») и способностью подавлять так называемый «shia stress» повреждения в местах разветвления сосудов (Tzima E., Reader J.S., Irani-Tehrani M., Ewalt K.L., Schwartz М.А., Schimmel P. Biologically active fragment of a human tRNA synthetase inhibits fluid shear stress-activated responses of endothelial cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003, v. 100(25), p. 14903-14907) [4], но и в связи с участием в синтезе мощных регуляторов функций сердечно-сосудистой системы (ССС) - диаденозинполифосфатов (Kisselev L.L., Justesenc J., Wolfson A.V., Frolova L. Yu. Diadenosine oligophosphates (ApnA), a novel class of signalling molecules? // FEBS Letters, 1998, v. 427, N 2, p. 157-163) [5].

У ферментов класса аминоацил-тРНК-синтетаз (АРСаз) - ключевых для обмена веществ, недавно выявлен ряд дополнительных функций. В частности - тирозил-тРНК-синтетаза (ТирРСаза), будучи расщепленной, обладает цитокинной активностью и стимулирует ангиогенез, способствуя, тем самым, атерогенезу [3, 4]. Гомолог ТирРСазы - триптофанил-тРНК синтетаза (ТРСаза) в клетках существует в двух формах: 1) основной полноразмерной; 2) частично усеченной (миниТРСаза), лишенной N-концевого фрагмента в процессе альтернативного сплайсинга (или эндогенного регулируемого протеолиза) при созревании пре-мРНК (Liu, J., Shue, Е., Ewalt, K.L., Schimmel, P.A. new γ-interferon-inducible promoter and splice variants of an anti-angiogenic human tRNA synthetase // Nucleic Acids Res. V. 32, N 2, p. 19-727, 2004) [7]. Образование обеих форм фермента может быть резко ускорено у всех млекопитающих при воздействии ряда факторов, например, γ-интерферона. При этом ТРСаза, особенно в виде миниТРСазы, в отличие от ТирРСазы, обладает выраженным антиангиогенным и антиатерогенным действием [3, 4].

Известна также взаимосвязь между высокомолекулярными комплексами АРСаз и белокстимулирующим действием этого важного для регуляции обмена веществ (компонента белоксинтезирующего) аппарата клетки (Lee S.W., Cho В.Н., Park S.G., Kim S. Aminoacyl-tRNA synthetase complexes: beyond translation // J. Cell. Sci. 2004; V. 117, N 17, p. 3725-34.) [8].

Комплексы полифенолов растительного происхождения проявляют мощное противовоспалительное, антионкогенное и антиатерогенное действие. Их действие направлено, в том числе, и на поддержание оптимального соотношения цитокинов и белковых факторов, и сопровождается заметным увеличением синтеза АРСаз в соответствующих клетках экспериментальных животных (Gaube F., Wolf S., Pusch L., Kroll T.C. and Hamburger M. Gene expression profiling reveals effects of Cimicifuga racemosa (L.) NUTT. (black cohosh) on the estrogen receptor positive human breast cancer cell line MCF-7 // BMC Pharmacology 2007, v. 7, p. 1471-1478) [6].

В литературе имеются сведения об активации ТРСазы различными соединениями как синтетического, так и природного происхождения (Нурбеков М.К., Фаворова О.О., Дмитренко С.Г., Болотина И.А., Киселев Л.Л. Роль ионов цинка в функционировании бычьей триптофанил-тРНК-синтетазы. // Молекулярная биология, 1981, т. 15, №5, стр. 1000-1010) [9]. Это, в частности, гемин (Wakasugi К. Human tryptophanyl-tRNA synthetase binds with heme to enhance its aminoacylation activity // Biochemistry. 2007, v. 46 (40), p. 11291-11298) [10], форболовые эфиры (Забазарных М.Ю., Литвинов Д.Ю. Форболовые эфиры стимулируют экспрессию гена триптофанил-тРНК-синтетазы человека // Биохимия, 2003, т. 68, №4, с. 592-597) [11] и эритропоэтин (Smith K.J., Bleyer A.J., Little W.C., Sane D.C. The cardiovascular effects of erythropoietin.// Cardiovasc Res. 2003, v. 59 (3), p. 538-548) [12].

Стимулирующее действие на экспрессию мРНК ТРСазы оказывают эритропоэтин или/и форболовые эфиры, имеющие частично общий механизм (протеинкиназу С). Однако их активирующие воздействия имеют свою специфику. В первом случае - общий пролиферативный анаболический эффект, во втором - узкоспецифический эффект по стимуляции возможных защитных реакций организма на действие онкостимулирующего препарата - форболовых эфиров (для создания моделей животных с опухолями).

В качестве ближайшего аналога-прототипа может быть указан комплекс трис-(2-гидроксиэтил)амина с бис-(2-метилфеноксиацетатом) цинка, повышающий цитокинную активность суммарной триптофанил-тРНК-синтетазы [Расулов М.М., Зверева М.В., Нурбеков М.К., Адамович С.Н., Мирскова А.Н., Мирсков Р.Г., Воронков М.Г. Комплекс трис-(2-гидроксиэтил)амина с бис-(2-метилфеноксиацетатом) цинка, повышающий цитокинную активность суммарной триптофанил-тРНК-синтетазы //Патент Ru 2457837 от 10.08.2012. Бюлл. №22, опубликовано 10.08.2012, МПК A61K 31/205 (2006.01), A61K 33/30 (2006.01), A61P 37/00(2006.01), A61P 43/00 (2006.01)] [13].

Признаками прототипа, совпадающими с существенными признаками заявляемого вещества являются повышение цитокинной активности суммарной триптофанил-тРНК-синтетазы.

К недостатку прототипа можно отнести меньший эффект стимулирования цитокинной активности суммарной триптофанил-тРНК-синтетазы. Так, трекрезан (прототип) в дозе, почти вдвое большей (25 мг/кг), чем для герматранол-гидрата (15 мг/кг) повышает активность ТРСазы лишь на 20% относительно контроля (таблица).

Изобретение направлено на обнаружение новых свойств герматранол-гидрата, что позволило бы использовать его по новому назначению. Обнаружение его способности проявлять себя, как биологически активный препарат, воздействующий на цитокинную активность аминоацил-тРНК-синтетазы, послужило поводом к применению моногидрата 1-гидроксигерматрана (герматранол-гидрат), формулы

H₂O·HOGe(OCH₂CH₂)₃N,

для стимуляции экспрессии матричной РНК триптофанил-тРНК-синтетазы.

Технический результат изобретения заключается в обеспечении стимулирующей цитокинной активности в отношении триптофанил-тРНК синтетазы.

В настоящем изобретении с целью расширения арсенала синтетических средств, обладающих стимулирующей цитокинной активностью в отношении триптофанил-тРНК синтетазы, предлагается использовать биологически активное соединение - моногидрат 1-гидроксигерматрана [герматранол-гидрат], формулы

синтезированный нами ранее [14].

Герматранол-гидрат обладает широкой биологической активностью. Он повышает устойчивость растений к низким [15] и повышенным [16] температурам. Известны его антиоксидантные свойства [17], противогипоксическая [18], нейротропная и противоопухолевая активность [19]. В комплексе с рядом лекарственных средств герматранол-гидрат усиливает их лечебный эффект и снижает побочное токсическое действие [20-23]. Герматранол-гидрат стимулирует биосинтез иммуноглобулинов [24], обладая актопротекторным действием,

стимулирует восстановительные процессы в организме вследствие усиления митохондриального (тканевого) дыхания в клетках организма [25].

Биологическая активность заявляемого препарата герматранол-гидрата - увеличение экспрессии мРНК, одного из ключевых ферментов внерибосомного этапа белкового синтеза триптофанил-тРНК синтетазы (ТРСазы), до сих пор не была известна из уровня техники. Следовательно, заявляемое техническое решение соответствует условию патентоспособности «изобретательский уровень».

В таблице представлена экспрессия мРНК ТРСазы и влияние герматранола и трекрезана (прототип) на этот процесс в культуре мононуклеарных клеток периферической крови (МНПК) человека после 1, 3, 6, 12 и 24 часов культивирования.

Значения p<0,5 основаны на 3 независимых опытах. Показаны средние значения и стандартное отклонение.

Возможность осуществления изобретения может быть проиллюстрирована следующими представленными ниже примерами, что подтверждает соответствие технического решения условию патентоспособности «промышленная применимость».

Пример 1

Раствор 14.9 г (0.10 моль) триэтаноламина и 10.5 г (0.10 моль) порошкообразного диоксида германия в 50 мл воды нагревают до кипения в течение 2 ч. Образовавшийся гомогенный раствор охлаждают до 2-5°C. Выпавший белый кристаллический осадок отсасывают, промывают этиловым спиртом, затем эфиром и сушат в вакууме. Маточный раствор упаривают на 2/3 и повторяют процедуры фильтрования, промывки и сушки. Выход моногидрата 1-герматранола с т. пл. 158-159°C 24.1 г (95%).

Найдено, %: C 28.34; H 6.04; N 5.50 Ge 28.36.

C₆H₁₅NO₅Ge. Вычислено, %: C 28.40; H 5.96; N 5.52; Ge 28.60.

Впервые выявленная физиологическая активность герматранол-гидрата - увеличение экспрессии мРНК одного из ключевых ферментов вне-рибосомного этапа белкового синтеза триптофанил-тРНК синтетазы (ТРСазы). ТРСаза запускает каскад последующих регуляторных цитокинных функций, реализуемых в ходе «вызревания» фермента и включения его в контроль ангиогенеза. Сложнейшие процессы в клетке, обеспечивающие регуляции целого спектра дополнительных функций ТРСазы протекают в 2 стадии:

а) посттранскрипционную,

б) пострансляционную.

Активированный фрагмент ТРСазы не только обладает активностью подавляющей патологические процессы аномальной агрессивной пролиферации сосудов, но одновременно способен стимулировать восстанавливающее физиологическое развитие сосудов, благотворно воздействующее на состояние сосудистой системы.

Свойства герматранол-гидрата, повышающего цитокинную активность суммарной триптофанил-тРНК синтетазы (ТРСазы) через стимуляцию синтеза специфической мРНК, в литературе не описаны. Возможность осуществления изобретения может быть проиллюстрирована следующим образом.

Пример 2

Эксперименты in vitro проведены для установления стимулирующего эффекта герматранол-гидрата на белковый синтез и связанных с ним ведущих систем регуляции процессов развития, дифференцировки, регенерации и поддержания как клеточного, так и тканевого гомеостаза.

Эффекты герматранол-гидрата изучали на культуре мононуклеарных клеток периферической крови (МНПК) человека.

Схема опыта включала следующие этапы:

1-ый этап. Получение МНПК.

2-ой этап. Культивирование МНПК в присутствии герматранол-гидрата в различных концентрациях.

3-ий этап. Экспресс-выделение через определенные промежутки времени препаратов суммарной РНК.

4-ый этап. Синтез на матрице РНК кДНК.

5-ый этап. Количественное определение специфической мРНК триптофанил-тРНК-синтетазы методом РТ-ПЦР.

1-ый этап. Получение МНПК.

Периферическую кровь из локтевой вены в объеме 10 мл берут в стерильных условиях в пробирку, содержащую гепарин, в конечной концентрации 25 ед. в 1 мл крови. Затем кровь стерильно переносят в пластиковую пробирку объемом около 50 мл. Туда же добавляют 10 мл стерильного PBS буфера. Разбавленную кровь аккуратно наслаивают на 3-5 мл градиента фиколл-уротраст в центрифужной пробирке. Соотношение объемов градиент-плазмы выдерживают в пределах 1:2-1:4.

Пробирки центрифугируют в течение 40 мин в бакет-роторе с ускорением 200 g (1500-1800 об/мин) при температуре 20°C. В процессе центрифугирования эритроциты и гранулоциты “проваливаются” в градиент и оседают на дно пробирки. На верхней границе градиента при правильном разделении образуется рыхлое кольцо беловатого цвета, состоящее из мононуклеарных клеток. Супернатант представлен плазмой. Последовательность фракций крови в градиенте: плазма - тромбоциты - мононуклеарные клетки - фиколл - эритроциты (на дне). Плазму удаляют. Остаток фикола с эритроцитами удаляют. Осторожно собирают клетки интерфазы (слой между плазмой - вверху и собственно фиколлом и осадком - внизу) пипеткой в пробирку с небольшим объемом среды, ресуспендируют. Заполняют пробирку PBS, центрифугируют при 800 или 1000 об/мин в течение 8-10 мин. Отсасывают и удаляют надосадок, ресуспендируют осадок в среде или PBS, заполняют пробирку PBS, повторно центрифугируют при 800 (1000) об./мин в течение 8-10 мин. Удаляют надосадок, осадок ресуспендируют в среде и приступают к подсчету клеток. После подсчета готовят рабочую концентрацию МК, содержащую 2×10⁶ клеток в 1 мл.

2-ой этап. Культивирование МНПК в присутствии герматранол-гидрата в различных концентрациях. Культивирование проводят в полной культуральной среде: RPMI-1640, 0,01 M HEPES, 10% фетальной бычьей сывороткой (Sigma) 200 мМ L-глутамина, 100 мг/мл гентамицина. Раствор хлоркрезацина фильтруют через фильтры с диаметром пор 0,22 мкМ и вносят культуру мононуклеаров в конечной концентрации 20 мкг/мл (оптимальную дозу определяют предварительно).

Контрольные пробы инкубируют полной культуральной средой без герматранол-гидрата. Оптимальное время подбирают экспериментально, отбирая для анализа из отдельных лунок планшеты аликвотны клеток через 1, 2, 3, 4, 6, 12 и 24 часа. Основные этапы выделения и культивирования МНПК проводят как описано [26, 27]. Концентрации герматранол-гидрата в культуральной среде и время инкубации подбирают в отдельной серии опытов.

3-ий этап. Экспресс-выделение через определенные промежутки времени препаратов суммарной РНК. Для выделения суммарных препаратов РНК из аликвот культуры МНПК используют набор фирмы «Силекс-М» «Yellow Solve» и процедуру выделения осуществляют по рекомендуемому протоколу фирмы с учетом специфики экспериментов и поставленных задач. Для выделения суммарной РНК отбирают приблизительно 10⁶ клеток из 12-луночной культуральной планшеты. Суспензию клеток (1-10 млн) гомогенизируют в 1 мл лизирующего раствора Yellow Solve до полного исчезновения комочков клеточного материала. Объем пробы не превышает 10% от объема лизирующего раствора Yellow Solve (т.е. не более 0,1 мл пробы на 1 мл Yellow Solve). Для удаления возможных примесей внеклеточного материала, полисахаридов и т.д., лизат центрифугируют при 10-15 тыс. об/мин в течение 5 мин. Отбирают прозрачный супернатант в стерильную пробирку. Добавляют к супернатанту 0,1 мл хлороформа, энергично перемешивая смесь на вортексе и оставляют на столе на 20 минут, встряхивая пробирку примерно каждые 5 минут. При стоянии содержимое пробирки расслаивается на две фазы. Если этого не произошло, добавляют еще 0,1 мл хлороформа и повторяют процедуру. Пробирку центрифугируют при 10-15 тыс. об/мин в течение 5 мин. По окончании центрифугирования в пробирке образуются два слоя жидкости. Переносят верхний, содержащий РНК слой жидкости в чистую пробирку, стараясь не захватить белую белковую интерфазу, если таковая присутствует. Нижний слой жидкости, содержащий фенол, удаляют. К отобранному верхнему слою добавляют равный объем депротеинизирующего раствора Green Clean и энергично встряхивают смесь на вортексе 2-3 минуты, после чего центрифугируют, как описано выше. Отбирают верхний, содержащий РНК, слой жидкости в чистую пробирку, замеряют его объем, добавляют к нему 2 объема 96%-ного этанола, хорошо перемешивают содержимое пробирки и помещают на 20-30 мин в морозильную камеру при -20°C для формирования осадка РНК. РНК осаждают центрифугированием при 10-15 тыс. об/мин в течение 10-20 мин. Спиртовой супернатант удаляют. К осадку РНК осторожно, по стенке пробирки, добавляют 0,5 мл 80%-ного этанола и центрифугируют при 10-15 тыс. об/мин в течение 15 мин. Следят, чтобы в процессе промывки осадок РНК не был смыт со дна пробирки и утерян. После удаления этанола, еще раз откручивают (30 сек) пробирку с осадком РНК для полного удаления остатков спирта со стенок пробирки. Растворяют осадок РНК в воде (теперь - все процедуры при 4°C, т.е. во льду!), концентрацию и нативность полученного препарата РНК определяют спектрофотометрически с последующим электрофорезом в 1,2-1,5%-ной агарозе, приготовленной на однократном трис-боратном буфере (ТБЕ) и содержащем 0.3 мкг/мл бромистого этидия. Хранят препарат РНК при -20°C или ниже, либо в виде спиртового осадка при -20°C.

4-ый этап. Синтез на матрице РНК кДНК. Для синтеза кДНК с использованием полученных препаратов суммарной РНК применяют реактивы фирмы Силекс М и прилагающиеся протоколы. Для синтеза кДНК в пробирке, помещенной в лед, смешивают следующие компоненты:

а) РНК матрица - 2 мкл (тотальная РНК 0.1-5 мкг) (поли(А)⁺РНК 10-0,5 нг или специфическая РНК - 0.01 пг и меньше)

б) праймер - 1 мкл (специфический 15-20 пмолей, случайный гексапраймер 0,5 нг),

в) вода, свободная от рНаз - до 18 мкл.

1. Перемешивают, осаждают капли кратковременным центрифугированием. Смесь инкубируют 5 мин при 70°C, переносят пробирку в лед и собирают капли кратковременным центрифугированием.

2. В помещенную в лед пробирку добавляют следующие компоненты:

- x10-кратный ОТ буфер (фирма «Силекс-М» - 2,5 мкл;

- 1,5 мМ смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (dNTP) - 4 мкл;

- обратную транскриптазу вируса лейкемии мышей Молони - M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) - 0,5 мкл.

3. Смесь инкубируют в течение 60 мин при 37°C (при использовании случайных гексапраймеров перед инкубацией при 37°C смесь инкубируют в течение 10 мин при 25°C). Реакцию останавливают прогреванием смеси в течение 10 мин при 70°C.

4. Смесь переносят в лед. Полученную кДНК используют либо сразу же для проведения РТ ПНР, либо для синтеза второй цепи и последующего клонирования. Хранят полученную кДНК при -20°C, либо при -70°C.

5-ый этап. Количественное определение специфической мРНК триптофанил-тРНК-синтетазы методом РТ-ПЦР. Количественный анализ специфической экспрессии гена ТРСазы проводят через оценку уровня специфической мРНК. При этом критерием оценки уровня мРНК служит количественный анализ суммарной кДНК, проводимый методом РТ-ПЦР. Реакцию РТ ПЦР проводят с использованием наборов реактивов фирмы «Синтол» (Комплект реагентов для проведения ПЦР-РВ в присутствии SYBR Green I Кат. номер R-402). Количественное определение уровня специфических кДНК для ТРСазы проводят на РТ-ПЦР приборе. Условия амплификации: денатурация при 95°C в течение 15 с, отжиг при 60°C - 15 с, и полимеризация при 72°C в течение 15 с (сбор данных осуществляют на стадии полимеризации). Затравки сконструированы с использованием программы «Праймер Экспресс Версия 2.0», с применением дополнительной приставки к РТ-ПЦР прибору ABI Prism 7900НТ для β-актина:

- прямая = 5′-CTGGAACGGTGAAGGTGACA-3′

- обратная = 5′-CGGCCACATTGTGAACTTTG-3′;

для кДНК копии мРНК ТРСазы:

- прямая = 5′-GAAAGGCATTTTCGGCTTCA-3′

- обратная = 5′-CAGCCTGGATGGCAGGAA-3″.

Все реакции проводят в сериях по 3 раза. Анализ полученных данных проводят с тем же пакетом программ (SDS2.1), прилагающихся к прибору ABI Prism 7900HT. Уровень отклонений рассчитывают по программе с учетом оптимизации. Стандарты получают путем амплификации контрольных образцов в ПЦР реакции с теми же затравками, реактивами и условиями, оптимизированными для РТ-ПЦР. Измерения проводят относительно стандартных значений, при этом делают 4-кратные последовательные разбавления с целью получения стандартной кривой из 8 точек. Результаты представлены на фиг. 1 в виде соотношения между изучаемым геном мишенью и мРНК β-актина.

Как следует из таблицы, введение герматранол-гидрата значительно увеличивает экспрессию мРНК ТРСазы. В дозе 15 мг/кг герматранол-гидрат повышает активность ТРСазы по сравнению с контролем на 60%.

Таким образом, применение синтетического соединения: 1-гидроксигерматрана - [герматранол-гидрат] достоверно активирует экспрессию мРНК ТРСазы.

Изобретение открывает возможность создания на его основе технически легкодоступных фармакологических препаратов с оригинальным механизмом действия для предотвращения и лечения склеротических поражений кровеносных сосудов.

Источники информации

1. Hansson G.K., Libby P. The immune response in atherosclerosis: a double-edged sword // Nat. Rev. Immunol., 2006, v. 6, p. 508-519.

2. Mangge H., Hubmann H., Pilz S., Schauenstein K., Renner W., Marz W. Beyond cholesterol-inflammatory cytokines, the key mediators in Atherosclerosis // Clin. Chem. Lab. Med., 2004, v. 42, p. 467-474.

3. Wakasugi K., Slike B.M., Hood J., Otani A., Ewalt K.L., Friedlander M., Cheresh D.A., Schimmel P. A human aminoacyl-tRNA synthetase as a regulator of angiogenesis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002, v. 99 (1), p. 173-177.

4. Tzima E., Reader J.S., Irani-Tehrani M., Ewalt K.L., Schwartz M.A., Schimmel P. Biologically active fragment of a human tRNA synthetase inhibits fluid shear stress-activated responses of endothelial cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003, v. 100 (25), p. 14903-14907.

5. Kisselev L.L., Justesenc J., Wolfson A.V., Frolova L.Yu. Diadenosine oligo-phosphates (ApnA), a novel class of signalling molecules? // FEBS Letters, 1998, v. 427, N 2, p. 157-163.

6. Gaube F., Wolf S., Pusch L., Kroll T.C. and Hamburger M. Gene expression profiling reveals effects of Cimicifuga racemosa (L.) NUTT. (black cohosh) on the estrogen receptor positive human breast cancer cell line MCF-7 // BMC Pharmacology 2007, v. 7, p. 1471-1478.

7. Liu, J., Shue, E., Ewalt, K.L., Schimmel, P.A new γ-interferon-inducible promoter and splice variants of an anti-angiogenic human tRNA synthetase // Nucleic Acids Res. V. 32, N 2, p. 719-727, 2004.

8. Lee S.W., Cho B.H., Park S.G., Kim S. Aminoacyl-tRNA synthetase complexes: beyond translation // J. Cell. Sci. 2004; V. 117, N 17, p. 3725-34.

9. Нурбеков M.K., Фаворова О.О., Дмитренко С.Г., Болотина И.А., Киселев Л.Л. Роль ионов цинка в функционировании бычьей триптофанил-тРНК-синтетазы. // Молекулярная биология, 1981, т. 15, №5, стр. 1000-1010.

10. Wakasugi K. Human tryptophanyl-tRNA synthetase binds with heme to enhance its aminoacylation activity // Biochemistry. 2007, v. 46(40), p. 11291-11298.

11. Забазарных М.Ю., Литвинов Д.Ю. Форболовые эфиры стимулируют экспрессию гена триптофанил-тРНК-синтетазы человека // Биохимия, 2003, т. 68, №4, с. 592-597.

12. Smith K.J., Bleyer A.J., Little W.C., Sane D.C. The cardiovascular effects of erythropoietin.// Cardiovasc Res. 2003, v. 59 (3), p. 538-548.

13. Патент RU №2 457 837 [Расулов M.M., Зверева M.B.,Нурбеков M.K., Адамович С.Н., Мирскова А.Н., Мирсков Р.Г., Воронков М.Г.] Комплекс трис-(2-гидроксиэтил)амина с бис-(2-метилфеноксиацетатом) цинка, повышающий цитокинную активность суммарной триптофанил-тРНК-синтетазы // 10.08.2012. A61P 43, A61P 37, A61K 33/30, A61K 31/205, Бюлл. №22.

14. Воронков М.Г., Овчинникова З.А., Барышок В.П. Синтез 1-герматранола и его С-замещенных // Изв. АН. СССР. - серия Химия. - 1987. - т. 4. - С. 880-882.

15. Патент Ru №1323074 [Тома С.И., Воронков М.Г., Барышок В.П., Левит Т.Е., Скуртул A.M. и др.]. Бюлл. №26 (1987).

16. Шигарова A.M., Боровский Г.Б., Ле Ньят Тхюи Занг, Барышок В.П. Влияние герматранола на выживаемость проростков пшеницы в условиях повышенной температуры. Материалы Всероссийской научной конф. «Факторы устойчивости растений в экстремальных природных условиях и техногенной среде. Иркутск, 2013, с. 294-296.

17. Лукевиц Э.Я. и др. Биологическая активность соединений германия. Рига: Зинатне, 1990, стр. 981.

18. Патент SU №1150935 [ГНИИ химии и технологии элементоорганических соединений] 30.01.1983, C07F 7/30, A61K 31/28 (публ. в БИ №39, 1993).

19. Лукевиц Э.Я. и др. Синтез, нейротропная и противоопухолевая активность ряда герматранов, гермсесквиоксанов и их оловоорганических аналогов. Хим. фармац. журн. - 1984, т. 18, №2, стр. 154-159.

20. Патент RU 2233286 [Соловьев Е.В., Щербинин В.В., Чернышев Е.А., Котрелев М.В.] 17.08.1998, C07F 7/30, A61K 31/28.

21. Патент RU 2104032 [ООО «Снежный барс», Щербинин В.В., Чернышев Е.А.], 17.08.1998, C07F 7/30, A61K 31/28.

22. Патент RU 2104033 [ООО «Снежный барс», Щербинин В.В., Чернышев Е.А.], 17.08.1998, C07F 7/30, A61K 31/28.

23. Патент RU 2236196 [Шкуренко С.И., Купленая В.А., Щербинин В.В., Крылов А.Л., Беляков А.В., Галичев К.В., Слюсарь Н.Н.] 20.09.2004. A61C 15/04.

24. Патент RU 2108096 [Миронов Владимир Флорович; Чернышев Евгений Андреевич; Малочкин Виктор Васильевич; Мартынов Александр Игорьевич; Куликов Геннадий Алексеевич] 10.04.1998. A61K 31/28.

25. Патент RU 2272624, 27.03.2006 [Исаев Александр Дмитриевич, Башкирова Светлана Александровна, Павлов Константин Витальевич. Общество с ограниченной ответственностью “Сафрон” (RU) A61K 31/28 (2006.01).

26. Смолина Т.П., Запорожец Т.С., Горшкова Р.П., Назаренко Е.Л. Ранняя активация лимфоцитов и моноцитов периферической крови человека компонентами протеобактерий Pseudoalteromonas nigrifaciens // Тихоокеанский медицинский журнал, 2009, №3, С. 45-48.

27. Nair М.Р., Mahajan S., Reynolds J.L., et al. The Flavonoid Quercetin Inhibits Proinflammatory Cytokine (Tumor Necrosis Factor Alpha) Gene Expression in Normal Peripheral Blood Mononuclear Cells via Modulation of the NF-B System // Clinical and Vaccine Immunology, 2006, Vol. 13, No. 3, p. 319-328.