Результат интеллектуальной деятельности: ЛИОФИЛИЗИРОВАННАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВИЗУАЛЬНОГО ВЫЯВЛЕНИЯ MYCOPLASMA HOMINIS

Изобретение относится к медицинской микробиологии, может быть использовано для культивирования и идентификации урогенитальных микоплазм, в частности Mycoplasma hominis, для диагностики урогенитальных микоплазмозов путем выявления Mycoplasma hominis в клиническом материале, а также для полуколичественного определения титра возбудителя.

В последние годы отмечается рост урогенитальных инфекций. Наряду с возбудителями «классических» инфекций, передаваемых половым путем (ИППП), таких как гонорея, сифилис, трихомониаз, урогенитальный хламидиоз, возрастает удельный вес заболеваний, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, в том числе урогенитальными микоплазмами.

Согласно данным современных исследователей, более чем у 40% больных с воспалительными заболеваниями органов малого таза выявляются урогенитальные микоплазмы, при этом наибольшее клиническое значение имеют три вида микоплазм: Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum.

Mycoplasma hominis могут являться причиной ряда заболеваний урогенитального тракта: негонококковых уретритов, неспецифических вагинитов, простатитов и эпидермитов, развитием цервицитов и кольпитов, в том числе эндометритов и сальпингитов. Mycoplasma hominis могут являться этиологическим фактором невынашивания беременности, преждевременных родов, нарушения репродуктивной функции, случаев мертворождения. Частота колонизации урогенитальными микоплазмами нижних отделов мочеполовой системы у детей, по данным различных исследований, варьирует от 2,9 до 22% для Mycoplasma hominis. Таким образом, очевидна необходимость специального обследования всех беременных женщин для выявления случаев урогенитального микоплазмоза и последующей санации.

Для выявления Mycoplasma hominis пользуются различными лабораторными диагностическими методами. Наиболее надежным и простым является культуральный метод диагностики урогенитальных инфекций, в том числе для выявления Mycoplasma hominis на селективной жидкой питательной среде. Использование этого метода позволяет осуществлять выявление и идентификацию Mycoplasma hominis, а также проводить полуколичественную оценку титра. Последнее особенно важно для клинической оценки этиологии воспалительных процессов, так как для микоплазменной инфекции этиологическим значением считается концентрация Mycoplasma hominis в исследуемом материале не менее 10000 КОЕ/мл. Культуральным методом можно определять чувствительность выделенных культур к антибиотикам, что выгодно отличает культуральный метод от других методов диагностики урогенитальных микоплазмозов (полимеразной цепной реакции (ПЦР) и реакции иммунофлюоресценции (РИФ)). Культуральный метод диагностики урогенитальных микоплазмозов является более достоверным в сравнении с РИФ, более низкая чувствительность и специфичность которой определяется малыми линейными размерами этих микроорганизмов, выраженной их гетерогенностью и изменчивостью, часто встречающейся низкой концентрацией микоплазм в первичном материале и, соответственно, необходимости их накопления для выявления, сложностью взятия качественного соскоба для этой реакции.

Из патентной литературы известна "ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ МИКОПЛАЗМ" (см. патент РФ №1397481, 1988). Для приготовления среды в объем дистиллированной воды добавляют, г: питательный бульон 19,21, эритрит 0,01, тиамин-бромид 0,004, аргинин 0,08, цистин 0,4, глюкоза 0,8, ЭКД 4,0, агар 8,96, Na₂CO₃ 0,64. Среду тщательно перемешивают и доводят до кипения, затем автоклавируют. После остывания в среду добавляют 200 мл лошадиной сыворотки и пенициллин. При посевной дозе 10 млн/кл./мл вырастает 120 колоний.

Однако данная питательная среда не лиофилизирована, что сокращает ее срок годности, а также связано со строгим соблюдением принципов холодовой цепи, что затрудняет ее длительное хранение, транспортировку и широкое применение. В среде не содержится антимикотиков, подавляющих рост грибов, также в составе среды нет антимикробного препарата, подавляющего рост других микоплазм, а к пенициллину некоторые представители бактериальной флоры приобрели устойчивость, что в полной мере не обеспечивает селективность среды.

Также известна ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКОПЛАЗМ. Для приготовления среды используют перевар сгустков крови человека (триптический перевар) в качестве питательной основы. В качестве стимулятора роста используют сыворотку крови человека 0(1) группы, истощенную механизмами 10-20 мас.%. В состав среды входят, мас.%: 50%-ный дрожжевой экстракт 8-15; глюкоза 0,5-1; хлористый натрий 0,5-1. Все компоненты перемешивают и объем среды доводят до 100 мл переваром сгустков крови. pH среды 7,4-7,8. Рост микоплазм на 3-4-е сутки (См. патент РФ №1527256, C12N 1/20, 1989).

Данная питательная среда имеет аналогичные недостатки, что и в среде, описанной выше (см. патент РФ №1397481, 1988).

Наиболее близкой к заявленной является "ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ MYCOPLASMA HOMINIS И СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ УРОГЕНИТАЛЬНЫХ МИКОПЛАЗМОЗОВ". Питательная среда для выявления Mycoplasma hominis, в качестве питательной основы она содержит сердечно-мозговую вытяжку 18-22 и триптозу 8-12 г/л, в качестве стимуляторов роста - дрожжевой экстракт 3-4 и среду 199 4,7-5,2 г/л, также содержит аргинин 5-10 г/л, феноловый красный 0,04-0,07 г/л, лошадиную сыворотку 0,25-0,30 г/л и дистиллированную воду. В качестве селективных добавок - антибиотики 0,64-1,27 г/л, при следующем соотношении ингредиентов: ампициллина натриевая соль 0,50-1,00 г/л, ванкомицина гидрохлорид 0,10-0,20 г/л, полимиксин В сульфат 0,01-0,02 г/л, амфотерицин В 0,01-0,02 г/л, эритромицин 0,02-0,03 г/л (См. патент RU №2261903, 2005).

Данная питательная среда не лиофилизирована, что сокращает ее срок годности, а также связано со строгим соблюдением принципов холодовой цепи, что затрудняет ее длительное хранение, транспортировку и широкое применение.

Разработана лиофилизированная селективная питательная среда для визуального выявления Mycoplasma hominis, которая обладает необходимой чувствительностью и специфичностью. Данная питательная среда дает возможность проведения идентификации выделенных культур микоплазм и оценки их количества (титра) в образцах. Были получены оптимальные соотношения компонентов селективной питательной среды для выявления Mycoplasma hominis.

Селективная питательная среда для выявления Mycoplasma hominis обеспечивает оптимальные условия для роста данного возбудителя при подавлении роста других микоплазм, дрожжеподобных грибов и большинства представителей бактериальной флоры, потенциально содержащихся в исследуемом образце. Наличие в среде pH-индикатора позволяет проводить визуальную оценку результатов исследования по изменению цвета питательной среды в процессе культивирования Mycoplasma hominis за счет проявления ферментативной активности.

Питательная среда для визуального выявления Mycoplasma hominis содержит питательную основу, аргинин, стимуляторы роста, селективные компоненты, лошадиную сыворотку, pH-индикатор и дистиллированную воду. В качестве питательной основы служит PPLO бульон, в качестве стимуляторов роста - дрожжевой экстракт, в качестве селективных добавок - антибиотики и противогрибковый препарат и в качестве pH-индикатора - феноловый красный и бриллиантовый синий.

Дрожжевой экстракт готовят из свежих хлебопекарных дрожжей (ООО «Дю-Ле», Яст Болагет, Швеция, кат. №00462, 2014 г.). Дрожжи помещают в кастрюлю в кипящую дистиллированную воду из расчета 250 г/л, кипятят в течение 40 мин. Полученный экстракт осветляют и стерилизуют автоклавированием.

Содержание питательной среды имеет следующее соотношение ингредиентов, г/л:

Питательная среда содержит селективные добавки - антибиотики и противогрибковый препарат, при следующем соотношении ингредиентов, г/л:

Питательную среду разливают в 100 мл флаконы по 25 мл и лиофильно сушат. Перед использованием флакон с лиофильной питательной средой для выявления Mycoplasma hominis растворяют 50 мл дистиллированной воды. Условия хранения питательной среды см. табл.1.

В предложенном составе питательной среды представлено оптимальное количественное соотношение компонентов, концентраций антибиотиков и индикаторного красителя.

Достигаемый технический результат - упрощение состава рецептуры, повышение скорости и точности диагностики микоплазменной инфекции за счет повышения чувствительности и селективности среды. Кроме того, среда обеспечивает высокие ростовые свойства, позволяющие проводит учет роста M. hominis через 24 ч, четкий визуальный учет результатов. Последнее достигается за счет использования смеси двух красителей, один из которых рН-зависимый. При рН 6,7-6,9 (начало роста M. hominis) цвет среды - фиолетовый, что визуально более отличимо, чем желтый или малиновый цвета среды в прототипе. Высокая селективность заявляемой среды обеспечивается за счет использования оптимального набора антибактериальных и противогрибковых препаратов, например флуконазола, который даже в высокой концентрации не подавляет рост M. Hominis, в отличие от амфоторецина В, используемого в прототипе. Использование более новых антибиотиков цефтриаксона, амоксиклава вместо ампициллина и полимиксина В обеспечивает выскокую селективность в отношении большинства представителей грамположительной и грамотрицательной бактериальной флоры, потенциально содержащейся в исследуемом образце.

В таблице 2 представлен сравнительный анализ компонентов заявляемой среды с ближайшим аналогом. В таблице на одной строке указаны компоненты, выполняющие одинаковую функцию. Проведенный анализ ростовых и селективных свойств заявляемой среды и ближайшего аналога представлен в таблице 3.

Для приготовления основы среды в 400 мл дистиллированной воды растворяют PPLO бульон б/кф (Pronadisa, Laboratorios CONDA, ЗАО «ДиаКон», кат. №1262, 2014 г.) - 32,00-35,00 г, L-аргинина гидрохлорид (имп, НТК «Диаэм», кат. №1119-34-2, 2014 г.) - 18,0-22,0 г, феноловый красный (Нева Реактив, PANREAC-131615, 2014 г.) - 0,10-0,14 г и бриллиантовый синий (Нева Реактив, ACROS-22973, 2014 г.) - 0,04-0,08 г. Доводят раствор дистиллированной водой до 700 мл, 600 мл или 500 мл, в соответствии с каждым ниже приведенным примером. Полученную основу среды стерилизуют автоклавированием.

Для приготовления среды в стерильных условиях смешивают 700 мл, 600 мл или 500 мл основы питательной среды с дрожжевым экстрактом - 150,00-250,00 мл, лошадиной сывороткой (ООО «БиолоТ», код: 1.1.5., 2014 г.) - 150,00-250,00 мл. Смесь тщательно перемешивают, затем добавляют цефтриаксон - 0,10-0,14 г, амоксиклав (амоксициллин натриевая соль / клавулановая кислота калиевая соль) - 0,025-0,035 г, ванкомицина гидрохлорид - 0,003-0,005 г, флуконазол - 0,038-0,042 г, кларитромицин - 0,006-0,010 г. Устанавливают pH 6,7-6,9, добавляя по каплям 1N соляную кислоту. Конечный объем питательной среды составляет 1000 мл.

Пример 1.

Состав среды:

Для приготовления основы среды в 400 мл дистиллированной воды растворяют PPLO бульон б/кф (Pronadisa, Laboratorios CONDA, ЗАО «ДиаКон», кат. №1262, 2014 г.) - 32,00 г, L-аргинина гидрохлорид (имп, НТК «Диаэм», кат. №1119-34-2, 2014 г.) - 18,0 г, феноловый красный (Нева Реактив, PANREAC-131615, 2014 г.) - 0,10 г и бриллиантовый синий (Нева Реактив, ACROS-22973, 2014 г.) - 0,04 г. Доводят раствор дистиллированной водой до 700 мл. Полученную основу среды стерилизуют автоклавированием.

Для приготовления среды в стерильных условиях смешивают 700 мл основы питательной среды с дрожжевым экстрактом - 150,00 мл, лошадиной сывороткой (ООО «БиолоТ», код: 1.1.5., 2014 г.) - 150,00 мл. Смесь тщательно перемешивают, затем добавляют цефтриаксон - 0,10 г, амоксиклав (амоксициллин натриевая соль/клавулановая кислота калиевая соль) - 0,025 г, ванкомицина гидрохлорид - 0,003 г, флуконазол - 0,038 г, кларитромицин - 0,006 г. Устанавливают pH 6,7-6,9, добавляя по каплям 1N соляную кислоту. Конечный объем питательной среды составляет 1000 мл.

Пример 2 (оптимальный).

Состав среды:

Для приготовления основы среды в 400 мл дистиллированной воды растворяют PPLO бульон б/кф (Pronadisa, Laboratorios CONDA, ЗАО «ДиаКон», кат. №1262, 2014 г.) - 34,00 г, L-аргинина гидрохлорид (имп, НТК «Диаэм», кат. №1119-34-2, 2014 г.) - 20,0 г, феноловый красный (Нева Реактив, PANREAC-131615, 2014 г.) - 0,12 г и бриллиантовый синий (Нева Реактив, ACROS-22973, 2014 г.) - 0,06 г. Доводят раствор дистиллированной водой до 600 мл. Полученную основу среды стерилизуют автоклавированием.

Для приготовления среды в стерильных условиях смешивают 60 мл основы питательной среды с дрожжевым экстрактом - 200,00 мл, лошадиной сывороткой (ООО «БиолоТ», код: 1.1.5., 2014 г.) - 200,00 мл. Смесь тщательно перемешивают, затем добавляют цефтриаксон - 0,12 г, амоксиклав (амоксициллин натриевая соль/клавулановая кислота калиевая соль) - 0,032 г, ванкомицина гидрохлорид - 0,004 г, флуконазол - 0,040 г, кларитромицин - 0,008 г. Устанавливают pH 6,7-6,9, добавляя по каплям 1N соляную кислоту.

Конечный объем питательной среды составляет 1000 мл.

Пример 3.

Состав среды:

Для приготовления основы среды в 400 мл дистиллированной воды растворяют PPLO бульон б/кф (Pronadisa, Laboratorios CONDA, ЗАО «ДиаКон», кат. №1262, 2014 г.) - 35,00 г, L-аргинина гидрохлорид (имп, НТК «Диаэм», кат. №1119-34-2, 2014 г.) - 22,0 г, феноловый красный (Нева Реактив, PANREAC-131615, 2014 г.) - 0,14 г и бриллиантовый синий (Нева Реактив, ACROS-22973, 2014 г.) - 0,08 г. Доводят раствор дистиллированной водой до 500 мл. Полученную основу среды стерилизуют автоклавированием.

Для приготовления среды в стерильных условиях смешивают 500 мл основы питательной среды с дрожжевым экстрактом - 250,00 мл, лошадиной сывороткой (ООО «БиолоТ», код: 1.1.5., 2014 г.) - 250,00 мл. Смесь тщательно перемешивают, затем добавляют цефтриаксон - 0,14 г, амоксиклав (амоксициллин натриевая соль/клавулановая кислота калиевая соль) - 0,035 г, ванкомицина гидрохлорид - 0,005 г, флуконазол - 0,042 г, кларитромицин - 0,010 г. Устанавливают pH 6,7-6,9, добавляя по каплям 1N соляную кислоту. Конечный объем питательной среды составляет 1000 мл.

Селективная питательная среда должна обеспечивать рост Mycoplasma hominis, который сопровождается изменением цвета среды с зеленого на фиолетовый за счет проявления ферментативной активности, и тормозить рост сопутствующих микроорганизмов (грамположительных и грамотрицательных бактерий, грибов и других микоплазм).

Диагностика инфекций, вызываемых Mycoplasma hominis, с помощью питательной среды для визуального выявления Mycoplasma hominis включает внесение исследуемого материала в пробирки для микропроб, содержащих питательную среду, проведение двух последовательных разведений исследуемой пробы в среде с шагом 10 и оценку изменения цвета питательной среды в пробирках. В качестве питательной среды используют:

питательную среду, содержащую питательную основу, аргинин, стимуляторы роста, селективные компоненты, лошадиную сыворотку, pH-индикатор и дистиллированную воду. В качестве питательной основы среда содержит PPLO бульон, в качестве стимуляторов роста - дрожжевой экстракт, в качестве селективных добавок - антибиотики и противогрибковый препарат, и в качестве pH-индикатора - феноловый красный и бриллиантовый синий.

Способ диагностики прост в постановке, не требует специального оборудования, позволяет проводить как выявление возбудителя, так и полуколичественное определение его титра.

Диагностика инфекций, вызываемых Mycoplasma hominis с помощью питательной среды для выявления Mycoplasma hominis, включает:

1. В лиофилизированную питательную среду для выявления Mycoplasma hominis добавляют двойной объем дистиллированной воды и перемешивают до полного растворения (в течение 1 мин).

2. Полученную прозрачную среду зеленого цвета разливают по 0,9 мл в пробирки для микропроб, закрывают и хранят до применения при температуре 2-8°C не более 7 сут или при температуре минус 7°C и ниже не более 2 мес. Перед проведением анализа пробирки со средой выдерживают при комнатной температуре (18-25°C) в течение 1 ч.

3. В зависимости от целей исследования дальнейшее определение может быть проведено в варианте качественного или полуколичественного анализа.

3.1. Проведение качественного анализа.

Вносят исследуемую пробу в объеме 100 мкл раствора из пробирки с пробой в транспортной среде в пробирку, обозначенную K(+++) и содержащую 0,9 мл жидкой питательной среды для выявления Mycoplasma hominis.

3.2. Проведение полуколичественного анализа.

Делают два последовательных разведения исследуемой пробы с шагом 10. Для этого исходную пробирку с пробой, обозначенную K(+++), встряхивают и переносят из нее 100 мкл раствора в другую пробирку, обозначенную K(++) и содержащую 0,9 мл питательной среды для выявления Mycoplasma hominis, что соответствует разведению в 10 раз. Затем переносят 100 мкл раствора из пробирки K(++) в пробирку, обозначенную K(+) и содержащую 0,9 мл питательной среды для выявления Mycoplasma hominis, что соответствует разведению исследуемой пробы в 100 раз.

4. Пробирки с исследуемыми пробами и одну пробирку без пробы (контроль питательной среды K(-)) помещают в термостат при температуре 37±1°C.

5. Учет результатов проводят через 24 ч. Окончательный учет результатов проводят через 72 ч. Рост Mycoplasma hominis сопровождается изменением цвета питательной среды с зеленого на фиолетовый, без помутнения, за счет проявления ферментативной активности, гидролиза аргинина и сдвига pH. В случае низкой обсемененности материала изменение цвета среды происходит на третьи сутки.

Интерпретацию результатов анализа см. табл. 2.

5.1. Интерпретация качественного анализа.

Положительным результатом «+» считается появление фиолетовой окраски среды в пробирке с исследуемой пробой K(+++) при сохранении зеленой (исходной) окраски в контрольной пробирке K(-). Отсутствие изменения окраски среды в исследуемой пробе K(+++) по сравнению с окраской среды в контрольной пробирке K(-) оценивается как отрицательный результат «-».

5.2. Интерпретация полуколичественного анализа.

Появление фиолетовой окраски среды только в пробирке K(+++) при отсутствии изменений в окраске среды в пробирках K(++), K(+) и K(-) указывает на то, что титр Mycoplasma hominis составляет не более 10² колониеобразующих единиц в мл (КОЕ/мл). Появление фиолетовой окраски среды в двух пробирках K(+++) и K(++) при отсутствии изменений в окраске среды в пробирках K(+) и K(-) указывает на то, что титр Mycoplasma hominis составляет не более 10³ КОЕ/мл. Появление фиолетовой окраски среды в трех пробирках K(+++), K(++) и K(+) при отсутствии изменения в окраске среды в пробирке K(-) свидетельствует о том, что титр Mycoplasma hominis составляет не менее 10⁴ КОЕ/мл.

Отсутствие изменения окраски среды в трех пробирках с пробой K(+++), K(++) и K(+) по сравнению с окраской среды в контрольной пробирке K(-) считается отрицательным результатом «-».

5.3. Примечание.

Помутнение среды во время культивирования (при изменении или без изменения окраски в пробирках с исследуемыми пробами) свидетельствует о росте посторонней микрофлоры. Результаты исследования таких проб учету не подлежат и требуют повторного проведения анализа или дополнительного посева на плотную питательную среду для морфологической идентификации колоний Mycoplasma hominis.

В качестве транспортной среды используют среду при следующем соотношении ингредиентов, г/л:

Для проведения диагностики используется следующий клинический материал:

- соскоб клеток влагалища, цервикального канала, слизистой уретры;

- секрет предстательной железы (0,50-0,10 мл), эякулят (0,50-0,10 мл);

- первая порция утренней мочи (осадок, полученный центрифугированием 10 мл первой порции утренней мочи).

Для достоверной диагностики возбудителей урогенитальных микоплазмозов необходимо стандартное взятие исследуемого материала и соблюдение условия его хранения:

1. Процедура взятия материала должна быть стандартной. Забор проб осуществлять с помощью ложки Фолькмана или одноразового тампона (щетки);

2. Не использовать при взятии материала местных антисептиков;

3. Необходимо брать материал до начала проведения антибактериальной терапии;

4. Важно получить достаточное количество клеток, поскольку микоплазма является микроорганизмом, колонизирующим клеточную поверхность;

5. Необходимо тщательное удаление слизи из цервикального канала;

6. Взятие уретральных образцов следует проводить не ранее чем через 2-3 часа после мочеиспускания;

7. Получение секрета предстательной железы и эякулята проводить непосредственно после мочеиспускания;

8. Исследуемый материал помещать в специальную транспортную среду, наилучшим образом обеспечивающую сохранение жизнеспособности микоплазм.

9. Пробирки с пробами в транспортной среде закрыть, промаркировать и доставить в лабораторию. Время и условия транспортировки исследуемых образцов см. табл.1.

Чувствительность и специфичность данной питательной среды имеют стандартные значения для культурального метода диагностики.