Результат интеллектуальной деятельности: ШТАММ Microbacterium species ДЛЯ ОЧИСТКИ СОЛОНОВАТОВОДНЫХ И МОРСКИХ ЭКОСИСТЕМ ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ

Изобретение относится к области биотехнологии и касается получения нового штамма бактерий, эффективного для очистки морских экосистем от загрязнений нефтью в течение 3-10 суток в диапазоне температур от +2°С.

Известен штамм Pseudomonasputida 36 (Авт. св. SU 1076446 А1, 1984, Бюл. №81), пригодный для очистки от нефти и нефтепродуктов пресной и морской воды (до 7,5% солености) в широком диапазоне температур (10-26°С).

Недостатком штамма является снижение эффективности очистки вод от нефти при температуре ниже +10°С и снижении уровня растворенного кислорода.

Известен штамм Mycobacterium flavescens (Патент RU 2053296 С1, 1996, Бюл. №3), обладающий высокой способностью к утилизации нефти и нефтепродуктов.

Недостатком штамма является его высокая чувствительность к температуре среды и насыщенности среды кислородом.

Известен штамм Mycobacterium species ЦКМ В 65-Б (Патент RU 2129603 С1, 1999, Бюл. №22), используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов в широком диапазоне температур (10-26°С).

Недостатком штамма является снижение эффективности очистки вод от нефти при температуре ниже +10°С и снижения уровня растворенного кислорода, что не позволяет ожидать эффективной очистки донных отложений от нефти.

Задача изобретения - получение штамма бактерии, обеспечивающей разрушение парафинов, смол, гетероциклических и полиароматических соединений в загрязненных нефтью морских водоемах при низкой температуре среды.

Штамм Microbacterium species BKM Ac-2615D выделен в 2010 году из накопительной культуры из проб загрязненного нефтью донного грунта солоноватоводного озера с глубины 1,0 м в зоне хронического нефтяного загрязнения путем высева водного разведения испытуемой пробы методом предельных разведений аликвоты по 100 мкл на поверхность агаризованной среды Стейниера. Авторское обозначение штамма КМ-251СО. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов, номер VKM Ac-2615D.

В классификации микроорганизмов по группам патогенности Санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.2322-08 от 1 мая 2008 г. «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» данный вид (род) не значится.

Штамм Microbacterium species BKM Ac-2615D растет на агаризованной среде, содержащей жидкие алканы в качестве единственного источника углерода и характеризуется следующими морфологическими, культуральными и физиологическими признаками: грамоположительные мелкие палочки неправильной формы, одиночные или в парах V-образной конфигурации, слабоподвижные. Колонии на питательном агаре округлой формы, непрозрачные, блестящие, оранжевого цвета. Консистенция слизистая. Выделяемый в среду пигмент отсутствует, способен закислять сахаросодержащую среду. Аэроб. Оксидазоположителен.

Режим хранения штамма - длительное хранение в лиофилизированной форме в плотно запаянных стеклянных ампулах. Кратковременное хранение (для подготовки биомассы с целевым использованием) - периодические пересевы - 1 раз в 2 месяца с хранением выросшей чистой культуры на скошенном агаре среды следующего состава: на 1000 мл воды - пептон 15 г, NaCl - 15; NaNO₃ - 2,0 г; KH₂PO₄ - 1,0 г; KCl - 0,5 г; MgSO₄×5H₂O - 0,5 г; агар микробиологический - 20,0; в закрытых пробирках в холодильнике при температуре не выше +6 и не ниже +1°С.

Условия культивирования. Культивирование штамма проводят на питательной среде следующего состава: на 1000 мл воды - пептон 15 г, NaCl - 15 г; NaNO₃ - 2,0 г; KH₂PO₄ - 1,0 г; KCl - 0,5 г; MgSO₄×5H₂O - 0,5 г; алканы - 10 г, рН 6,0-7,5. Наработку биомассы осуществляют на качалке при 220 об/мин, температуре +15-+25°С, в течение 3-5 суток.

Способность штамма к биодеструкции нефтяных углеводородов изучали в лабораторных опытах с морской водой, результаты приведены в примерах ниже.

Пример. Деструкция нефтяных углеводородов культурой Microbacterium species BKM Ac-2615D в среде с морской водой при температуре 2-4°С.

Для изучения углеводородокисляющих свойств штамма был проведен опыт в условиях жидкофазной ферментации в присутствии сырой нефти. В 250 мл колбы по 100 мл добавляли морскую воду с уровнем солености 2,7%, стерилизовали их при 1 АтИ (атмосфер избыточных) в течение часа в автоклаве, охлаждали до комнатной температуры, затем до температуры экспозиции в холодильнике, после чего проводили посев изучаемой культуры стерильной петлей из пробирки в колбу. Контрольную колбу микроорганизмами не заражали.

Опыт проводили в условиях интенсивной аэрации, устанавливая зараженные колбы на охлажденный до 0+2°С термостатируемый шейкер в течение 3-х суток при 220 об/мин. По истечении 3-х суток нефть извлекали из ферментационных колб экстракцией хлороформом и анализировали алкановую, полиароматическую, гетероциклическую фракции, а также концентрацию растворенных углеводородов.

Краткое описание фигуры 1

Фигура 1 представляет собой график изменения структуры алкановой фракции нефти после трехсуточной ферментации с культурой штамма Microbacterium species BKM Ac-2615D.

Как видно на Фиг. 1, в присутствии культуры исследуемого штамма по сравнению с контролем происходит изменение структуры алкановой фракции, где очевидно снижение массовой доли легких парафинов и увеличение массовой доли соединений с длиной цепи С25-С26 вероятнее всего за счет разрушения более тяжелых парафинов в ряду С27-С38. Наблюдается также увеличение массовой доли н-парафинов с длиной цепи более 40 атомов. Этот эффект может быть связан с деструкцией гетероциклических и смолистых фракций нефти, о чем свидетельствует снижение их общей массы в конце опыта (табл. 2). При этом возрастает концентрация растворенных в воде углеводородов, что также говорит об интенсификации разрушения сложных нефтяных углеводородов.

В опытных пробах происходит и снижение массовой доли полиароматических соединений (табл. 2), в частности концентрация бензо(а)пирена снижается в 2 раза, бензо(а)антрацена в 3,5 раза, что говорит о перспективности применения испытуемого штамма для очистки морских вод и донных отложений от опасных для природной среды полиароматических соединений.

Таким образом, достигнут технический результат по усилению разрушения в нефти нафтеновых фракций, гетероциклических соединений и смол, а также полиароматических соединений, бензо(а)пирена бензо(а)антрацена, позволяющий рекомендовать к использованию от вышеперечисленных углеводородов морской воды при низкой (от +2-+4°С) температуре среды, что в свою очередь актуально при проведении работ по очистке морских акваторий от нефти и нефтепродуктов в условиях высоких широт.