Результат интеллектуальной деятельности: ШТАММ БАКТЕРИИ Pseudomonas aeruginosa

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарии и предназначено для производства вакцинных препаратов против псевдомоноза свиней.

Псевдомоноз - острая инфекционная болезнь животных и птицы, характеризующаяся у молодняка септическим процессом, поражением легких, желудочно-кишечного тракта и суставов, а у взрослых особей репродуктивных органов и молочной железы. Возбудителем псевдомоноза является грамотрицательная аэробная бактерия Pseudomonas aeruginosa, которая по антигенной структуре подразделяется на 20 серологических групп (Псевдомоноз животных / И.А. Болоцкий, А.Г. Шипицын, А.К. Васильев и др. - М.: Колос, 2010. - 223 с.).

Псевдомоноз животных, в т.ч. свиней, регистрируется во всех регионах России независимо от природно-географических условий. В подавляющем большинстве случаев возбудителем псевдомоноза свиней является Pseudomonas aeruginosa серогрупп O1, O3, O4, О6, O11, 019 (Пруцаков С.В. Псевдомоноз продуктивных животных в регионе Северного Кавказа / Автореф. дисс. докт. вет. наук. - Краснодар, 2011. - 37 с.). Учитывая данные обстоятельства, для профилактики болезни была разработана вакцина поливалентная против псевдомоноза сельскохозяйственных животных (Пат. РФ №2308288), которая в качестве антигенов содержит суспензию клеток чистых культур Pseudomonas aeruginosa, принадлежащих к 10 серогруппам (O1, O2, O3, O4, О6, О10, O11, O13, O18, O19), полученных путем отбора паренхиматозных пораженных органов из местного эпизоотического очага. Существенным недостатком такой вакцины является использование для ее получения неохарактеризованных (случайных) штаммов с неизвестными иммуногенными свойствами.

Известен вакцинный штамм бактерий Pseudomonas aeruginosa 514₂, используемый для изготовления вакцины против псевдомоноза пушных зверей (Пат. РФ 2169193, прототип). Недостатком данного штамма является то обстоятельство, что он ориентирован на создание вакцины против псевдомоноза пушных зверей, при этом у вакцинированных животных формируется иммунитет к экзотоксину А, а не к соматическому О-антигену, который сохраняется непродолжительное время.

Технического решения, в ходе которого использовался штамм Pseudomonas aeruginosa для получения вакцины против псевдомоноза свиней с заданным О-антигенным профилем и иммунногенными свойствами, в доступной научной и патентной литературе нами не выявлено.

Штамм Pseudomonas aeruginosa №10 выделен от павшего поросенка в 2003 г., в 2011 г. предложен в качестве вакцинного штамма, а в 2013 г. депонирован во Всероссийской коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве (Россия, 123022, Москва, Звенигородствое шоссе, 5, ФГБУ «ВГНКИ») под регистрационным номером «№10-ДЕП».

Штамм Pseudomonas aeruginosa №10-ДЕП предназначен в качестве производственного штамма для изготовления вакцины против псевдомоноза свиней и хранится в ФГУП «Армавирская биофабрика».

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала штаммов Pseudomonas aeruginosa, обладающих и длительно сохраняющих свои иммунногенные свойства и пригодных для изготовления высокоэффективных вакцинных препаратов.

Технический результат достигается тем, что штамм возбудителя псевдомоноза свиней коллекции ФГБУ ВГНКИ, депонированный под наименованием «Pseudomonas aeruginosa №10» и регистрационным номером «№10-ДЕП», предназначен для изготовления вакцины против псевдомоноза свиней.

Штамм Pseudomonas aeruginosa №10-ДЕП характеризуется следующими свойствами.

Культурально-морфологические признаки: грамотрицательная палочка размерами 2-3×0,5-0,8 мкм, подвижная, спор и капсул не образует, располагается поодиночно. Растет на простых питательных средах с образованием сине-зеленого пигмента пиоцианина и слизи. На поверхности мясо-пептонного бульона дает пленку серовато-серебристого цвета, а на поверхности мясо-пептонного агара - шероховатые неправильной формы колонии.

Физиолого-биохимические признаки: мезофил, аэроб, растет при температуре от 18 до 42°C, но оптимальная температура роста 35-37°C. Окисляет глюкозу, восстанавливает нитраты до нитритов, ферментирует аргинин, разжижает желатину, свертывает молоко, разрушает эритроциты барана, образует цитохромоксидазу.

Антигенные свойства: агглютинируется типовой сывороткой О11 до титра 1:1280.

Вирулентные свойства: вызывает гибель белых мышей при внутрибрюшинном введении 3-5×10⁶ микробных клеток.

Иммуногенные свойства: при двукратной иммунизации кроликов инактивированными формалином клетками в дозе 0,5-1,5×10¹⁰ и взрослых свиней в дозе 4-6×10¹⁰ микробных тел через 14 дней после последней иммунизации в сыворотке крови животных появляются антитела в титре 1:512-1:1024. Защитный титр антител равный для данного штамма 1:64 сохраняется у иммунизированных животных в течение 12 месяцев.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Штамм Pseudomonas aeruginosa №10 выращивают на бульоне Хоттингера в течение 24-46 ч при 36-37°C с pH 7,2-7,4 и постоянном встряхивании на шуттель-аппарате. По истечении срока инкубации культуру проверяют на чистоту путем окрашивания по Граму, доводят физиологическим раствором до концентрации 10 млрд. микробных клеток в 1 мл, после чего инактивируют формалином, содержащим не менее 36% формальдегида до конечной концентрации 0,3-0,4% и выдерживают в течение 14 суток при температуре культивирования. После окончания срока инактивации в культуру вносят 3%-ный раствор гидроокиси алюминия, фасуют во флаконы и укупоривают. Полученная вакцина представляет собой прозрачную жидкость желтовато-зеленоватого цвета с беловато-сероватым рыхлым осадком, при встряхивании образуется однородная суспензия.

Пример 2. Полученную по примеру 1 вакцину проверяют на стерильность и безвредность.

Стерильность вакцины контролируют по отсутствию роста при посеве на среды Сабуро (на грибы), Эндо (колиформные бактерии), МПА (мезо-фильные аэробные бактерии), Китта-Тароци (на анаэробы). Рост на всех средах отсутствовал, что свидетельствует о стерильности вакцины.

Безвредность проверяют на 3 белых мышах массой 18-20 г, которым вакцину вводят подкожно в объеме 0,3 мл и наблюдают в течение 7 дней. Все подопытные животные остались живы, на месте введения вакцины патологических изменений не было, что свидетельствует о безвредности препарата.

Пример 3. Иммуногенность вакцины оценивают по протективности при экспериментальном псевдомонозе на белых мышах и величине накопления титров специфических антител у иммунизированных вакциной кроликов и свиней.

3 группы белых мышей по 10 животных в каждой за 10 дней до заражения эпизоотическим штаммом Pseudomonas aeruginosa О11 иммунизировали: мышей 1 группы вакциной из штамма Pseudomonas aeruginosa №10 в дозе 0,1 мл подкожно; мышей из 2 группы вакциной из штамма Pseudomonas aeruginosa 514₂ в дозе 0,1 мл подкожно; мышам из 3 группы ввели физраствор в объеме 0,1 мл подкожно. Через 10 дней после иммунизации всех мышей заразили патогенным изолятом Pseudomonas aeruginosa серогруппы О11 в дозе 100 млн. микробных тел внутрибрюшинно. В течение 14 дней за мышами вели наблюдение и производили учет павших.

Результаты отражены в таблице 1, из которой видно, что в первой группе выжило 100% экспериментально зараженных животных, что на 50% больше, чем во второй группе, животные которой иммунизировались вакциной из эпизоотического штамма. В контрольной группе, где животным вводился физраствор, погибли все мыши. Следовательно, вакцина против псевдомоноза из штамма Pseudomonas aeruginosa №10 защитила наибольшее количество экспериментально зараженных животных, а значит она более иммуногенна, чем вакцина, приготовленная из штамма Pseudomonas aeruginosa 514₂.

Иммуногенность штамма Pseudomonas aeruginosa №10 оценивали по способности стимулировать выработку специфических антител на 10 кроликах и 10 взрослых свиньях. Для этого животных иммунизируют дважды с интервалом 14 дней: кроликов в дозе 1 мл на голову, свиней - 5 мл на голову. По истечении 14, 30, 90, 180, 270 и 360 дней после последней иммунизации в реакции агглютинации определяют титры антител к Pseudomonas aeruginosa серогруппы О11.

Результаты отражены в таблице 2, из которой видно, что депонированный штамм Pseudomonas aeruginosa №10, предназначенный для изготовления вакцины против псевдомоноза свиней обладает более выраженными иммуногенными свойствами, чем вакцина из штамма Pseudomonas aeruginosa 514₂, поскольку обеспечивает образование в 3-4 раза большего уровня специфических антител. Кроме того, в организме иммунизированных животных в группах, где использовалась вакцина из штамма Pseudomonas aeruginosa №10 защитный уровень антител к соматическому антигену О11 (не менее 1:64) сохранялся в течение 12 месяцев, а у животных, иммунизированных вакциной из штамма Pseudomonas aeruginosa 514₂ - 3-6 месяцев. Отсюда следует, что вакцина, приготовленная из штамма Pseudomonas aeruginosa №10, обеспечивает более продолжительный и напряженный иммунитет, чем вакцина из штамма Pseudomonas aeruginosa 514₂.

Пример 4. На свино-товарной ферме, неблагополучной по псевдомонозу, иммунизируют 30 поросят 2-недельного возраста полученной по примеру 1 вакциной из штамма Pseudomonas aeruginosa №10 (опытная группа) и 30 поросят аналогичного возраста вакциной из штамма Pseudomonas aeruginosa 514₂ (положительный контроль), 30 поросят не иммунизировались (отрицательный контроль). Бактериологическими исследованиями установлено, что заболевание вызывает Pseudomonas aeruginosa серогруппы O11. Поросята опытной группы и группы положительного контроля иммунизировались по одинаковой схеме: дважды с интервалом 14 дней внутримышечно с внутренней стороны бедра в дозе 1,0 и 1,5 мл. Наблюдение за животными вели в течение 120 дней, отмечая все случаи заболевания и гибели поросят, связанные с псевдомонозом.

Результаты опыта отражены в таблице 3, из материалов которой видно, что в опытной группе заболело псевдомонозом 4 поросенка, из них ни один не пал. В группе положительного контроля заболело 11 поросят, из которых пало 4. В группе отрицательного контроля заболело 17 поросят, из которых пало - 8. Следовательно, заболеваемость и смертность в опытной группе составила соответственно 13,3 и 0%, в группе положительного контроля - 36,7 и 13,3%, в группе отрицательного контроля - 56,7 и 26,7%. Сохранность поросят в опытной группе составила 100%, в группе положительного контроля - 86,7% и в группе отрицательного контроля - 73,3%.

Таким образом, вакцина, полученная в соответствии с предлагаемым изобретением, а именно из штамма Pseudomonas aeruginosa №10, обеспечивает наибольшую выживаемость животных при экспериментальном и спонтанном псевдомонозе, чем вакцина из штамма Pseudomonas aeruginosa 514₂, поскольку способна в большей степени стимулировать выработку и циркуляцию в организме иммунизированных животных специфических антител к соматическому антигену O11. Следовательно, штамм Pseudomonas aeruginosa №10 пригоден для изготовления вакцины против псевдомоноза свиней.