Результат интеллектуальной деятельности: НАБОР ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ПРАЙМЕРОВ И ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕНОГО ЗОНДА ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ РНК ВИРУСА ЛИХОРАДКИ ДОЛИНЫ РИФТ МЕТОДОМ ОТ ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в ветеринарии и медицине для выявления генетического материала (РНК) вируса лихорадки долины Рифт (ВЛДР) в клинических или биологических образцах, а также в объектах окружающей среды.

Лихорадка долины Рифт (ЛДР) - острое зоонозное заболевание, распространенное во многих странах Африки и на Ближнем Востоке. Возбудитель, относящийся к роду Phlebovirus семейства Bunyaviridae, характеризуется высокой вирулентностью в отношении многих видов диких и домашних копытных животных и человека.

Геном ВЛДР представлен одноцепочечной негативной РНК, разделенной на три сегмента (S, M и L). Биполярный S-сегмент содержит гены нуклеопротеина и неструктурных белков, М-сегмент кодирует оболочечные гликопротеины, L-сегмент - РНК-зависимую РНК полимеразу.

Передача вируса осуществляется через укусы комаров Culex spp. и Aëdes spp., его природный резервуар неизвестен. Заражение человека может произойти также при контакте с тканями и кровью заболевших животных либо при вдыхании вируссодержащих аэрозолей.

Лихорадка долины Рифт в настоящее время включена в группу карантинных инфекций, контролируемых Международными медико-санитарными правилами 2005 года. Эпизоотии ЛДР наносят огромный экономический ущерб животноводству, вызывая 80-100% гибель молодняка и внутриутробную гибель плода на любых сроках беременности. Клиническая картина характеризуется выраженной лихорадкой, некротическим гепатитом, гастроэнтеритом, обильными кровотечениями со слизистых оболочек.

У человека проявления заболевания варьируют от легкой гриппоподобной формы до тяжелой, сопровождающейся геморрагическим синдромом, некрозом печени и менингоэнцефалитом. При осложненном течении ЛДР показатели смертности могут достигать 50%, у выживших пациентов отмечаются остаточные неврологические явления и стойкое снижение остроты зрения, приводящее к инвалидизации. Наиболее часто развитие тяжелых форм ЛДР наблюдается во время вспышек, которым предшествовали эпизоотии среди домашних животных.

Своевременное проведение диагностических мероприятий, оценка эпидемической и эпизоотической ситуации по ЛДР, разработка комплексной программы профилактики инфекции требуют быстрой, высокочувствительной и достоверной идентификации возбудителя.

Одним из методов оперативной детекции РНК ВЛДР является метод полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР).

Известны синтетические олигонуклеотидные праймеры, используемые для выявления генетического материала ВЛДР, на основе амплификации консервативных последовательностей S- или М-сегментов РНК [1-4].

Однако данные наборы праймеров не предполагают использование флуоресцентно-меченых зондов для детекции результатов, что не позволяет регистрировать накопление специфичных ПЦР-продуктов в режиме реального времени. Кроме того, в некоторых работах специфичность детекции была достигнута за счет т.н. «гнездовой», или двухраундовой, ПНР с применением дополнительной пары внутренних праймеров [2, 5]. Известны синтетические олигонуклеотидные праймеры, способ выявления и дифференциации штаммов вируса лихорадки долины рифт на основе полимеразной цепной реакции и рестрикционного анализа (патент РФ №2457255, МПК C12Q 1/68, опубл. 27.07.2012 г.). Гидролиз продуктов ПЦР проводят эндонуклеазами рестрикции, а детекцию результатов анализа путем электрофореза в агарозном геле.

К недостаткам данного изобретения относятся следующие:

- увеличение общего времени анализа образцов до 5-6 часов (вместо 2,5-3 часов), поскольку отсутствие флуоресцентно-меченого зонда не позволяет регистрировать накопление специфичных ПЦР-продуктов в режиме реального времени;

- невозможность автоматического фиксирования и обработки экспериментальных данных;

- дополнительные манипуляции с ампликонами (ферментативный гидролиз и гель-электрофорез) многократно повышают вероятность ложно положительных результатов, связанных с контаминацией помещений и лабораторного оборудования продуктами ПЦР.

Известны «Primers and probe for detecting fragment S of rift valley fever virus» (патент Китая № CN 102433392 (А), МПК C12Q 1/68, опубл. 2012-05-02). В изобретении представлены олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентно-меченый зонд, предназначенные для идентификации РНК вируса лихорадки долины Рифт методом обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции в реальном времени. Область гибридизации праймеров и зонда (участок NS-гена S-сегмента, позиции №№37-128).

Однако, поскольку в изобретении для анализа выбран более вариабельный фрагмент РНК ВЛДР, праймеры и зонд в ряде случаев могут оказаться недостаточно специфичными для достоверной идентификации вируса.

Известны «PRIMERS AND ITS APPLICATION IN MULTIPLEX PCR TO IDENTIFY RINDERPEST, PESTE-DES-PETITS-RUMINANTS VIRUS, BLUETONGUE VIRUS AND RIFT VALLEY FEVER» (патент Респ. Кореи № KR 20110017706 (А), МПК C12Q 1/68, опубл. 2011-02-22). Представленные в патенте олигонуклеотидные праймеры являются специфичными в отношении РНК вируса лихорадки долины Рифт. Они применяются в составе мультиплексной ПЦР с электрофоретической детекцией результатов анализа.

Однако конкуренция различных олигонуклеотидных пар в отношении компонентов реакционной смеси (Taq-полимераза, дезоксинуклеозидтрифосфаты, ионы магния) может привести к снижению аналитической чувствительности системы. Кроме того, увеличение общего времени анализа образцов составляет до 5-6 часов (вместо 2,5-3 часов), поскольку отсутствие флуоресцентно-меченого зонда не позволяет регистрировать накопление специфичных ПЦР-продуктов в режиме реального времени. В изобретении не предполагается автоматическое фиксирование и обработка экспериментальных данных. Дополнительные манипуляции с ампликонами (ферментативный гидролиз и гель-электрофорез) многократно повышают вероятность ложно положительных результатов, связанных с контаминацией помещений и лабораторного оборудования продуктами ПЦР.

Известна «New fluorescence quantitative polymerase chain reaction (PCR) detection method for rift valley fever virus and rift valley fever virus detection PCR System» (патент Китая № CN 102140528 (А), МПК C12Q 1/68, опубл. 2011-08-03). Представленные в изобретении олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентно-меченый зонд предназначены для идентификации РНК вируса лихорадки долины Рифт методом обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции в реальном времени. Область гибридизации праймеров и зонда отличается от заявляемого технического решения.

Однако, поскольку в данном изобретении для анализа выбран более вариабельный фрагмент РНК ВЛДР, праймеры и зонд в ряде случаев могут оказаться недостаточно специфичными для достоверной идентификации вируса.

Наиболее близким аналогом (прототипом) являются олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентно-меченый зонд, позволяющие выявлять РНК ВЛДР в исследуемом образце путем амплификации участка S-сегмента (ген нуклеокапсидного белка N) с детекцией результатов в режиме реального времени [6].

Однако, учитывая данные по геномному разнообразию ВЛДР, представленные в GenBank, указанные праймеры и зонд, подобранные по шести нуклеотидным последовательностям референтных штаммов, могут в ряде случаев не обеспечить достоверной идентификации вируса вследствие недостаточной специфичности в отношении геновариантов ВЛДР, выявленных позже.

Техническим результатом заявляемого изобретения является создание более специфичного набора олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации генетического материала ВЛДР в клинических и биологических образцах и объектах внешней среды методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени.

Поставленная задача достигается подбором олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда, имеющих следующий нуклеотидный состав:

Праймер RVFV-2s: 5′-AGGAGCATCTGAAATAGG-3′

Праймер RVFV-2a: 5′-GGCTCAAATGATCAAMCC-3′

Зонд RVFV-2: 5′-FAM-TCATCATGGGAAACTCACGCA-BHQI-3′.

На начальном этапе был проведен поиск и определение наиболее консервативных участков L-сегмента РНК ВЛДР по 94 известным нуклеотидным последовательностям, представленным в базе данных NCBI MegaBLAST [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/]. В качестве мишени для диагностических праймеров и зонда была выбрана область, включающая 167 пар нуклеотидов (позиции №№180-346).

Обратную транскрипцию вирусной РНК, совмещенную с последующей амплификацией фрагмента кДНК в полимеразной цепной реакции, проводили на амплификаторе «CFX96» (BioRad, США). Детекция продуктов амплификации осуществлялась непосредственно в ходе ПНР благодаря применению флуоресцентно-меченого олигонуклеотидного зонда, гибридизующегося с продуктом реакции (ампликоном) и обеспечивающего дополнительную специфичность метода. Интенсивность флуоресценции возрастала в течение реакции пропорционально накоплению ампликонов.

Определяющим отличительным признаком предлагаемых праймеров и зонда по сравнению с прототипом является гибридизация к более специфичным последовательностям 94-х известных геномов ВЛДР.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Проверка аналитической чувствительности набора праймеров и зондов

Для контроля аналитической чувствительности предложенного набора праймеров и зондов была сконструирована рекомбинантная плазмида, содержащая вставку кДНК ВЛДР: плазмида pUC19, гидролизованная рестриктазой SmaI (позиция №415) была лигирована с фрагментом кДНК L-сегмента РНК ВЛДР (позиции №№180-346). Концентрацию ДНК рекомбинантной плазмиды (мкг/мл) определяли при помощи спектрофотометра «NanoView Plus» (GE Healthcare, США). Концентрацию геномных эквивалентов (ГЭ) вируса ЛДР рассчитывали с учетом молекулярного веса рекомбинантной плазмиды по формуле (1):

где М - концентрация плазмидной ДНК [ГЭ/мл];

С - концентрация рекомбинантной плазмиды [мкг/мл];

10^-6 - коэффициент перевода [мкг/мл] в [г/мл];

6,02·10²³ - число Авогадро;

2853 - длина плазмиды [пар оснований, п.н.];

3,26·10² - средний молекулярный вес одного звена нуклеотидной цепи [Да].

Из концентрированного раствора, содержащего в среднем 10⁷ ГЭ/мл, были приготовлены последовательные 10-кратные разведения плазмидной ДНК, которые использовались в качестве образцов для ОТ-ПЦР в режиме реального времени (по 10 мкл на реакцию). Соответственно, образцы содержали от 10⁵ и менее ГЭ на реакцию. Для контроля возможной контаминации в отдельную пробирку вносили 10 мкл воды для ПЦР.

Реакционная смесь общим объемом 25 мкл (включая объем исследуемого образца) содержала 1×AS-полимеразный буфер (67 mM Tris HCl, 16,6 mM (NH₄)₂SO₄, 0,01% Tween-20), 0,4 mM каждого дезоксинуклеозидтрифосфата, 3 mM MgCl₂, 1-5 е.а. обратной транскриптазы М-MuLV, 1 е.а. Hot Start Taq ДНК полимеразы (ООО «Сибэнзим», Новосибирск, Россия), 0,8 µМ каждого праймера и зонда (RVFV-2s: 5′-AGGAGCATCTGAAATAGG-3′, RVFV-2а: 5′-GGCTCAAA TGATCAAMCC-3′, RVFV-2: 5′-FAM-TCATCATGGGAAACTCACGCA-BHQI-3′) (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»).

ОТ-ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов реакции в режиме реального времени по каналу FAM/Green проводили на амплификаторе «CFX96» (BioRad, США) согласно протоколу, приведенному в таблице 1.

Результаты реакции интерпретировали на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривых флуоресценции с пороговыми линиями, что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла «Ct» в соответствующей графе таблицы результатов программы амплификатора. Результат считали положительным (образец содержит заявленное число ГЭ ВЛДР) в случае, если кривая накопления флуоресценции для соответствующего образца имела характерную экспоненциальную фазу роста и пересекала пороговую линию. При этом значение «Ct» для данного образца, возрастающее пропорционально его разведению, не должно было превышать 35.

Аналитическая чувствительность предложенного набора праймеров и зондов, определенная в результате экспериментов (фиг.1), составила 100 ГЭ ВЛДР (копий плазмидной ДНК, содержащей вирусспецифическую вставку) на 25 мкл реакционной смеси.

Пример 2. Определение генетического материала ВЛДР в вируссодержащем образце

Эффективность выявления РНК ВЛДР оценивали с использованием инактивированного образца музейного штамма RVF 2002/09-ПС, предоставленного ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии (Покров, Московская область, Россия).

Выделение РНК из исследуемого материала проводили с помощью набора реагентов «АмплиПрайм РИБО-преп» (ООО «НекстБИО», Москва, Россия) в соответствии с инструкцией по применению в присутствии внутреннего контрольного образца (ВКО).

ОТ-ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией ампликонов проводили в реакционной смеси следующего состава: 1×AS-полимеразный буфер (67 mM Tris HCl, 16,6 mM (NH₄)₂SO₄, 0,01% Tween-20), 0,4 mM каждого дезоксинуклеотидтрифосфата, 3 mM MgCl₂, 1-5 е.а. обратной транскриптазы M-MuLV, 1 е.a. Hot Start Taq ДНК полимеразы (ООО «Сибэнзим», Новосибирск, Россия), 0,8 μΜ каждого праймера и зонда (RVFV-2s: 5′-AGGAGCATCTGAAATAGG-3′, RVFV-2a: 5′-GGCTCAAA TGATCAAMCC-3′, RVFV-2: 5′-FAM-TCATCATGGGAAACTCACGCA-BHQI-3′) (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»).

Общий объем реакционной смеси (на одно исследование) составил 25 мкл, включая 10 мкл исследуемого образца. Для контроля возможной контаминации в отдельную пробирку вносили 10 мкл воды для ПЦР.

Совмещенную ОТ-ГТЦР и регистрацию результатов в режиме реального времени проводили на амплификаторе «CFX96» (BioRad, США) согласно протоколу, приведенному в таблице 2.

Детекция флуоресценции осуществлялась на канале FAM/Green для амплификации кДНК ВЛДР и на канале HEX/Yellow для амплификации ВКО.

Результаты реакции интерпретировали на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривых флуоресценции с пороговыми линиями, что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла «Ct» в соответствующей графе таблицы результатов программы амплификатора. Результат считали положительным в случае, если кривая накопления флуоресценции для соответствующего образца имела характерную экспоненциальную фазу роста и пересекала пороговую линию. При этом значение «Ct» для данного образца не должно было превышать 35 (фиг.2).

Таким образом, из вышеприведенных примеров 1 и 2 видно достижение заявляемого технического результата: созданы олигонуклеотидные праймеры и зонд для идентификации генетического материала ВЛДР в клинических и биологических образцах и объектах внешней среды методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени. Также определена аналитическая чувствительность набора для детекции ВЛДР, которая составила 100 геномных эквивалентов на 25 мкл реакционной смеси.

Источники информации

1. Jupp P.G., Grobbelaar A.A., Leman P.A. et al. Experimental detection of Rift Valley fever virus by reverse transcription-polymerase chain reaction assay in large samples of mosquitoes // J. Med. Entomol., 2000, 37: 467-471;

2. Sail A.A., Macondo E.A., Sène O.K. Use of reverse transcriptase PCR in early diagnosis of Rift Valley fever // Clin. Diagn. Lab. Immunol., 2002, 9: 713-715;

3. Espach Α., Romito M., Nel L.H. Development of a diagnostic one-tube RT-PCR for the detection of Rift Valley fever virus // Onderstepoort J. Vet. Res., 2002, 69 (3): 247-52; Yeh J.-Y., Lee J.-H., Seo H.-J. Simultaneous detection of Rift Valley fever, bluetongue, rinderpest and peste des petits ruminants viruses by a single-tube multiplex reverse transcriptase-PCR assay using a dual-priming oligonucleotide system // J. Clin. Microbiol., 2011, 49: 1389-1394;

4. патент РФ №2457255, МПК C12N 15/33, C12Q 1/68, опубл. 27.07.2012 г.

5. Yeh J.-Y., Lee J.-H., Seo H.-J. Simultaneous detection of Rift Valley fever, bluetongue, rinderpest and peste des petits ruminants viruses by a single-tube multiplex reverse transcriptase-PCR assay using a dual-priming oligonucleotide system // J. Clin. Microbiol., 2011, 49: 1389-1394;

6. Белов A.B., Гребенникова T.B., Забережный А.Д. и др. Тест-система на основе ПНР в реальном времени для выявления вируса ЛДР // Ветеринария, 2007, 6: 53-55.