Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ХРОНИЧЕСКОГО ВИРУСНОГО ГЕПАТИТА И ЖИРОВОЙ БОЛЕЗНИ ПЕЧЕНИ У БОЛЬНЫХ С СИНДРОМОМ ДИСЛИПИДЕМИИ

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике во внутренних болезнях, может быть использовано для дифференциальной диагностики хронического вирусного гепатита и жировой болезни печени у больных с синдромом дислипидемии.

Известный лабораторный способ дифференциальной диагностики хронического вирусного гепатита и жировой болезни печени заключается в прижизненном морфологическом исследовании биоптатов печени (Ghany М., Doo Е. Assessment of liver fibrosis: palpate, poke or pulse? Hepatology, 2005. V.42 (4). P.759-761; The role of liver biopsy in chronic hepatitis C. Saadeh S., Cammell G., Corey W.D. et al. Hepatology, 2001. V.33. P.196-200; Nainon O., Xiq G., Vanghan G. Diagnosis of hepatitis a virus infection: a molecular approach. Clin. Microbiol. Rev., 2006. V.19 (1). P.63-79); Roussele M.C. Sources of variability in histological scoring of chronic viral hepatitis. Hepatology, 2005. V.41 (2). P.257-264; Павлов Ч.С., Ивашкин B.T. Биопсия печени: методология и практика сегодня. Рос. журн. гастроэнтерол. гепатол. колопроктол., 2006, Т.16, №4. С.65-78; Павлов Ч.С., Золоторевский В.Б., Ивашкин В.Т. Современные методы ранней диагностики фиброза печени. Клиническая медицина, 2005., Т. 83, №12. С.58-60; Ивашкин В.Т., Шульпекова Ю.О. Неалкогольный стеатогепатит. Русский медицинский журнал, 2000. Т.2. С.41-45; Подымова С.Д. Жировой гепатоз, неалкогольный стеатогепатит. Клинико-морфологические особенности. Прогноз. Лечение. Русский медицинский журнал, 2005, №2. С.61-66).

Недостатки способа диагностики: несмотря на высокую информативность, метод пункционной биопсии печени является трудоемким, достаточно травматичным, имеется техническая сложность получения материала и значительная вероятность развития тяжелых осложнений.

Технический результат: снижение травматичности, повышение доступности и простоты исполнения при высокой чувствительности, специфичности и эффективности.

Способ дифференциальной диагностики заключается в следующем: у больных в сыворотке крови спектрофотометрически определяют активность фермента антиоксидантной системы глутатионредуктазы (ГЛР) методом Manso и Wrob-Leveski на спектрофотометре КФК-3-«ЗОМЗ» (Россия, г. Сергиев-Посад) с целью оценки наличия и степени окислительного стресса (Медицинские лабораторные технологии. Руководство по клинической лабораторной диагностики. Том. 1. Под ред. А.И. Карпищенко. Изд-во Гэотар Медицина, 2012, 472 с.).

У пациентов с синдромом дислипидемии при значении ГЛР менее или равно 14,6 мкмоль/л/мин диагностируют жировую болезнь печени, при концентрации ГЛР более 14,6 мкмоль/л/мин - хронический вирусный гепатит.

Способ забора крови для определения активности ГЛР осуществляют следующим образом: кровь из локтевой вены в количестве 5 мл забирают в вакуумную пробирку с активатором свертывания и центрифугируют для получения сыворотки 10 мин при 1500 об/мин.

Принцип метода определения активности ГЛР основан на том, что фермент катализирует следующую реакцию:

Количество используемого в реакции НАДФН пропорционально активности фермента.

При определении активности ГЛР сыворотка предварительно инкубируется в фосфатном буфере при pH 7,0 с НАДФН и реакция инициируется окисленным глутатионом. Потребление кофермента измеряют, регистрируя падение поглощения при длине волны 340 нм. Реактивы:

1. 0,1 М калий-фосфатный буфер с 1 мМ ЭДТА, pH - 7,0 (производитель ООО «Биотех», г. Пермь). Приготовление реактива: 13,6 г. дигидрофосфата калия (KH₂PO₄) и 292 мг сухой навески ЭДТА растворяют в 500 мл дистиллированной воды. 0,1 М раствор KOH доводят и разбавляют дистиллированной водой до 1 л.

2. 20 мМ окисленный глутатион (12,24 мг/мл окисленного глутатиона на 1 мл дистиллированной воды) (производитель «AppliChem», Германия).

3. 3,2 мМ НАДФН (1,49 мг/мл НАДФН на 1 мл дистиллированной воды) (производитель «AppliChem», Германия).

Ход определения. Для исследования активности ГЛР 0,05 мл сыворотки крови в соответствии 1:10 вносят в кювету с длиной оптического пути 10 мм, содержащую 1,8 мл 0,1 М калий-фосфатного буфера, pH - 7,0 с 1 мМ ЭДТА, 0,1 мл 20 мМ окисленного глутатиона. Производят кинетическое определение оптической плотности при длине волны - 340 нм против воды. Затем для инициации реакции добавляют 0,1 мл 3,2 мМ раствора НАДФН и в течение 3-х минут проводят кинетическое определение оптической плотности при длине волны - 340 нм.

Расчет активности ГЛР производят по следующей формуле:

Е - активность фермента, мкмоль/(мкмоль/л/мин);

А - разность экстинции пробы до и после инкубации;

V_pc - объем реакционной смеси - 2,05 мл;

V_пр - объем пробы - 0,05 мл;

l - длина оптического пути - 1 см;

Е - молярный коэффициент светопоглощения НАДФН при длине волны 340 нм, равный 6,22*10 3 м -1*см -1;

t - время инкубации 3 минуты.

При значении ГЛР менее или равно 14,6 мкмоль/л/мин диагностируют жировую болезнь печени, при концентрации ГЛР более 14,6 мкмоль/л/мин - хронический вирусный гепатит.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. Больная К. 36 лет, рост 158 см, вес 81 кг, индекс массы тела 32. Синдром дислипидемии. Жалобы на слабость и снижение аппетита. Объективно - печень +1,5 см, безболезненная, гладкая. Биохимическое исследование: АЛТ - 54 Ед/л, ACT - 25 Ед/л, общий билирубин - 17,7 мкмоль. По данным УЗИ - умеренные диффузные изменения в печени. Показатели липидного обмена в сыворотке крови: триглицериды (ТГ) - 1,71 ммоль/л, общий холестерин (ОХ) - 6,88 ммоль/л, липопротеиды высокой плотности (ЛПВП) - 1,09 ммоль/л, липопротеиды низкой плотности (ЛПНП) - 3,95 ммоль/л. Уровень ГЛР в сыворотке крови 47,2 мкмоль/л/мин. Диагноз хронического вирусного гепатита подтвержден.

Пример 2. Больной К. 39 лет, рост 176 см, вес 90 кг, индекс массы тела 29. Синдром дислипидемии. Жалобы на слабость, снижение аппетита, тошноту и тяжесть в правом подреберье. Объективно - печень +2,0 см, безболезненная, гладкая. Биохимическое исследование: АЛТ - 56 Ед/л, ACT - 31 Ед/л, общий билирубин - 8,7 мкмоль/л. По данным УЗИ - диффузные изменения в печени. Показатели липидного обмена в сыворотке крови: ТГ - 1,9 ммоль/л, ОХ - 5,52 ммоль/л, ЛПВП - 1,17 ммоль/л, ЛПНП - 3,06 ммоль/л. Уровень ГЛР в сыворотке крови 26 мкмоль/л/мин. Диагноз хронического вирусного гепатита подтвержден.

Пример 3. Больной М. 37 лет, рост 185 см, вес 112 кг, индекс массы тела 33. Синдром дислипидемии. Жалобы на тупые боли в верхних отделах живота, явления диспепсии и слабость. Объективно - печень +1,5 см, безболезненная, гладкая. Биохимическое исследование: АЛТ - 77 Ед/л, ACT - 50 Ед/л, общий билирубин - 9,05 мкмоль/л. По данным УЗИ - диффузные изменения печени. Параметры липидного обмена сыворотки крови: ТГ - 1,71 ммоль/л, ОХ - 6,18 ммоль/л, ЛПВП - 1,2 ммоль/л, ЛПНП - 4,32 ммоль/л. Уровень ГЛР в сыворотке крови 3,2 мкмоль/л/мин. Диагноз жировой болезни печени подтвержден.

Пример 4. Больная С. 54 лет, рост 165 см, вес 86 кг, индекс массы тела 32. Синдром дислипидемии. Жалобы на снижение аппетита и тяжесть в правом подреберье. Объективно - печень +1,0 см, безболезненная, гладкая. Биохимическое исследование: АЛТ - 71 Ед/л, ACT - 55 Ед/л, общий билирубин - 12,2 мкмоль/л. По данным УЗИ - диффузные изменения печени. Показатели липидного спектра в сыворотке крови: ТГ - 2,87 ммоль/л, ОХ - 7,04 ммоль/л, ЛПВП - 1,34 ммоль/л, ЛПНП - 4,88 ммоль/л. Уровень ГЛР в сыворотке крови 7,3 мкмоль/л/мин. Диагноз жировой болезни печени подтвержден.

Данные статистики определения активности фермента ГЛР в сыворотке крови больных хроническим вирусным гепатитом (ХВГ) и жировой болезнью печени (ЖБП) с синдромом дислипидемии в сравнении с группой практически здоровых лиц представлены в таблице.

Операционные характеристики лабораторного теста определения активности ГЛР в сыворотке крови больных с синдромом дислипидемии и поражением печени с целью дифференциации хронического вирусного гепатита и жировой болезни печени по степени окислительного стресса: диагностическая чувствительность (ДЧ) составила 100%, диагностическая специфичность (ДС) - 100%, диагностическая эффективность - 100%. Точка разделения для больных хроническим вирусным гепатитом и жировой болезнью печени с синдромом дислипидемии по активности ГЛР при построении кумулятивных кривых зарегистрирована на уровне 14,6 мкмоль/л/мин. Соответственно при уровне ГЛР менее или равно 14,6 мкмоль/л/мин больных с синдромом дислипидемии диагностируют жировую болезнь печени, при уровне ГЛР более 14,6 мкмоль/л/мин - хронический вирусный гепатит.

Положительный эффект от использования предлагаемого способа дифференциальной диагностики хронического вирусного гепатита и жировой болезни печени по активности антиоксидантного фермента ГЛР с целью оценки степени окислительного стресса заключается в его простоте, доступности, нетравматичности, отсутствии осложнений, информативности, чувствительности и специфичности.