Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ МИКРОСКОПИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ НАТИВНОГО СОСКОБА КОРНЯ ЯЗЫКА

Изобретение относится к медицине, в частности к микробиологии, и может быть использовано в стоматологии, терапии, педиатрии, дерматологии.

Микрофлора полости рта является важной составляющей, необходимой для здоровья человека. В настоящее время известно, что с изменением качественного и количественного состава микробиома полости рта связано развитие кариеса, специфических и неспецифических воспалительных процессов полости рта, многих заболеваний, включая неврологические и сердечно-сосудистые (Боровский Е.В., Машкиллейсон А.Л. Заболевания слизистой оболочки полости рта и губ. - М.: Медицина, 1994. - 297 с; Терапевтическая стоматология: национальное руководство /под ред. Проф. Л.А. Дмитриевой, проф. Ю.М. Максимовского «ГЭОТАР - Медиа», 2009. - 912 с; Янушевич О.О., Гринин В.М., Почтаренко В.А., Рунова Г.С. Заболевания пародонта. Современный взгляд на клинико-диагностические и лечебные аспекты/ под ред. О.О. Янушевича. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. - 160 с). Однако использование микроскопических методов исследования как клинической лабораторной диагностики заболеваний полости рта, ограничено. В последние годы предпочтение отдается культуральным/микробиологическим методам исследования микрофлоры полости рта из патологического очага (Николаев А.И., Цепов Л.М. Практическая терапевтическая стоматология. - М.: МЕДпресс-информ, 2010. - 924 с).

Но недостатком культурального/микробиологического исследования микрофлоры полости рта является:

- его высокая стоимость;

- трудоемкость методики;

- невыполнение правил забора и транспортировки биологического материала снижает качество результатов;

- требование создания как аэробных, так и анаэробных условий культивирования увеличивает стоимость расходных материалов;

- наличие в составе микроорганизмов полости рта трудно культивируемых и некультивируемых форм не позволяет выделять их и изучать свойства.

Кроме того, с целью диагностики и профилактики заболеваний внедряются новые молекулярно-генетические методы исследования микрофлоры полости рта: ПНР, секвенирование, генотипирование.

Но недостатком их является:

- доступность метода в крупных и хорошо оснащенных центрах, НИИ;

- высокая стоимость оборудования и расходных материалов;

- значительная затрата времени на исследование;

- требование высокой квалификации обученного персонала.

Известны способы микроскопического исследования окрашенных препаратов соскоба слизистой оболочки спинки языка, применяемые в стоматологии для диагностики лептотрихиоза полости рта (Боровский Е.В., Чумаков А.А., Миренова Л.Г. Диагностика и лечение лептотрихоза слизистой полости рта: методические рекомендации. - М.: ММСИ имени Н.А. Семашко, 1987. - 4 с). По данной методике берут соскоб металлическим стоматологическим инструментом/шпателем и наносят на предметное стекло. После высушивания на воздухе 20 минут проводится фиксация мазка смесью Никифорова 20-30 минут. На высушивание и окрашивание по Романовскому-Гимзе официнальной смесью азура и эозина требуется 40 минут. Дальнейшее промывание и высушивание - 20 минут и микроскопия с увеличением ×40, затем ×100.

Но недостатком этого микроскопического метода исследования окрашенного мазка из флоры полости рта является:

- затраты времени на фиксацию, окрашивание и высушивание мазка не менее 120 минут;

- недоступность эфира для приготовления смеси Никифорова;

- использование одного предметного стекла снижает качество приготовления мазка заданной толщины;

- невозможность морфологической дифференциации химической структуры клеточной стенки, то есть принадлежности микроба к грам+ или грам- бактериям;

- необходимость делать соскоб с языка в кабинете стоматолога специальными инструментами.

Известен также негативный способ микроскопического исследования соскоба слизистой оболочки спинки языка, других слизистых полости рта, применяемый в дерматологии для лабораторной диагностики лептотрихиоза и грибковой инфекции полости рта (Клиническая дерматовенерология: в 2 т. / под ред. Ю.К. Скрипкина, Ю.С. Бутова. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009. - Т.1. - 720 с.). Делают соскоб с языка металлическим шпателем, наносят на предметное стекло, не высушивая, смешивают с каплей 10% раствора щелочи - КОН (калиевой) или NaOH (натриевой) и накрывают покровным стеклом. Препарат немедленно изучают под микроскопом с увеличением ×10 и ×40.

Но недостатком этого микроскопического метода исследования неокрашенного мазка флоры полости рта является:

- изучение микрофлоры в соскобе возможно не более 10 минут после смешивания с щелочью, в дальнейшем микробы в препарате разрушаются, утрачивая морфологию, искажая микроскопическую картину;

- для исследования доступна только форма микробной клетки и количество микроорганизмов в поле зрения;

- преимущественно используется для изучения клеток грибов, которые не разрушаются под действием щелочи, а не множества представителей бактериального мира;

- щелочь разрушает связи между бактериями, невозможно составить представление о взаимодействии бактерий в микробиоме;

- невозможность дифференциации бактерий по химической структуре клеточной стенки, то есть принадлежности микроба к грам+ или грам- бактериям;

- щелочь разрушает эпителий, что делает невозможным исследование в соскобе эпителиальных клеток ни по количеству, ни по структуре;

- консультирование по спорным результатам микроскопии возможно проводить только непосредственно во время исследования; невозможно вернуться к изучению препарата на следующий день или позже.

Специфическим маркером баланса симбиотических отношений макроорганизма и микроорганизмов микрофлоры тела человека считают состояние его микробиомов (Нетрусов А.И., Бонч-Осмоловская Е.А., Горленко Е.М. Экология микроорганизмов / под ред. Проф. А.И. Нетрусова. - М.: Академиа, 2004. - 272 с.), которое коррелирует с потреблением питательных веществ, отражает различные физиологические состояния макроорганизма и показывает изменение иммунного статуса.

Задача - предложить способ микроскопического исследования нативного соскоба со слизистой корня языка, лишенный вышеперечисленных недостатков.

Технический результат состоит в возможности выявления количества микроорганизмов микробиома полости рта, их химической принадлежности по строению клеточной стенки к грамнегативным или грампозитивным бактериям, морфологии, пространственного расположения, коадгезии между собой и гистадгезии к клеткам эпителия, путем применения сложной дифференциальной окраски фиксированного мазка из глубокого соскоба корня языка, содержащего основных представителей микробиома, методом Грама.

Технический результат достигается тем, что в качестве биоматериала для микроскопии используется глубокий соскоб корня языка, который берут на границе задней трети спинки и корнем языка стерильным деревянным шпателем, с усилием надавливая на слизистую. Забранный в количестве 0,5 мл нативный биоматериал наносится шпателем поочередно на два сухих стерильных предметных стекла и равномерно распределяется на каждом стекле площадью около 1,5-2 см² в пределах круга-метки. Препараты высушиваются на воздухе 20 минут, фиксируются мазками вверх в пламени спиртовки непрерывно 5-6 секунд и окрашиваются сложным дифференциальным методом Грама (Общая и санитарная микробиология с техникой микробиологических исследований: учебное пособие / под ред. А.С. Лабинской, Л.П. Блинковой, А.С. Ещиной. - М.: Медицина, 2004. - 576 с. / с. 93-94). Метод датского бактериолога Ханса Христиана Грама включает последовательное окрашивание фиксированного мазка карболовым генцианвиолетом, обработку раствором Люголя, обесцвечивание спиртом, промывание водой и докрашивание водно-спиртовым раствором фуксина. Используют приготовленные по рецептуре красители и/или набор реагентов для окраски по Граму производителя ЗАО ЭКОлаб ТУ 9389-083-70423725-2007, РУ ФСР 2008/03335 от 23.09.08.

Результаты оценивают следующим образом: окрашенные по Граму мазки на двух предметных стеклах исследуются под биологическим микроскопом с иммерсией, используется объектив иммерсионный ×100 и окуляр ×15 (см. фото 1-4).

Методом случайной выборки нами было обследовано 2700 человек разного пола, национальности, социального положения и возраста - дети от 1 года и взрослые люди до 87 лет. У всех исследуемых установлен микроскопический статус соскоба корня языка: микроскопическим методом определены количественное содержание бактерий в 0,5 мл соскоба, принадлежность к грам+ или грам- бактериям, морфология и размеры бактерий, наличие бактерий, схожих с лептотрихиями, и грибов, схожих с кандидами, коэффициенты коадгезии и гистадгезии, количество и характеристика клеток и ядер эпителия.

Результаты представлены в таблице 1.

При анализе данных, представленных в таблице 1, видно, что применение способа микроскопии нативного соскоба корня языка, окрашенного методом Грама, объективно характеризует как качественный, так и количественный состав микробиома полости рта в его естественном состоянии, включая клетки эпителия слизистой корня языка.

Преимущества предложенного способа:

- в качестве метода клинической лабораторной диагностики способ полностью раскрывает картину биопленок/взаимодействия бактерий между собой и состояния эпителия;

- способ не инвазивен и безопасен для пациента;

- для получения результата о составе микробиома требуется 30 минут;

- предложенный способ может быть применен в любом лечебном учреждении, в амбулаторных условиях кабинета любого специалиста;

- фиксированные мазки можно доставлять и окрашивать в баклаборатории стандартным методом Грама; не требует специально обученного персонала;

- способ может использоваться при проведении мероприятий по скрининг-диагностике состояния микробиома полости рта;

- может явиться профилактическим методом в группах риска по заболеванию кариесом зубов и патологии желудочно-кишечного тракта.

Пример 1

Аркадий Г., 19 лет. Практически здоров. Содержание бактерий в соскобе с языка умеренное, преобладают грампозитивные кокки, имеются грамнегативные диплококки, что соответствует норме микробиома. Лептотрихии единичные в поле зрения микроскопа, длиной до 15 мкм, клеток грибов не обнаружено. Клетки эпителия типичные, 0-1 в поле зрения, с хорошо структурированным ядром, коэффициент гистадгезии умеренный, коадгезия микроорганизмов между собой невысокая.

Пример 2

Марина Д., 51 год. Диагноз: красный плоский лишай. Сахарный диабет II типа. В соскобе с языка большое количество микроорганизмов, которые располагаются скоплениями по типу «шаров», преобладают грамнегативные кокки и палочки. Лептотрихии до 20-30 в каждом поле зрения, длина их до 40 мкм, имеются ложные гифы грибов до 3-5 в поле зрения. Эпителий разрушен, 8-10 в поле зрения, множество ядер, коэффициент гистадгезии высокий, коадгезия микроорганизмов между собой очень высокая.

Т.о. предлагается способ микроскопического исследования нативного соскоба слизистой корня языка, включающий забор материала стерильным шпателем, приготовление мазка на предметном стекле, высушивание, фиксацию мазка и его окрашивание, микроскопию с иммерсией и объектив ×100, отличающийся тем, что для исследования забирают 0,5 мл биоматериала из глубокого соскоба со слизистой на границе задней трети спинки и корня языка, готовят два мазка на двух предметных стеклах площадью 1,5-2,0 см² каждый, далее мазки высушивают на воздухе 20 минут, фиксируют жаром в пламени спиртовки в течение 5-6 секунд, окрашивают сложным дифференциальным методом Грама, просматривают не менее 10 полей зрения на каждом стекле, подсчитывают общее количество микроорганизмов, коэффициенты коадгезии и гистадгезии, пространственное расположение бактерий, преобладание грам+ или грам- бактерий, наличие бактерий, схожих с лептотрихиями, геликобактерами, наличие ложных гиф грибов, количество и состояние клеток и ядер эпителия.