Результат интеллектуальной деятельности: ШТАММ АС25 ПОСТОЯННОЙ ГИБРИДОМНОЙ ЛИНИИ КЛЕТОК МЫШИ Mus. musculus-ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К АНТИГЕНУ Н3 ВИРУСА ГРИППА ЛОШАДЕЙ

Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии, в частности к гибридомной технологии, и касается получения моноклональных антител к антигену H3 вируса гриппа лошадей H3N8. Изобретение может быть использовано при создании диагностикумов и иммунохимических тест-систем для выявления поверхностных гликопротеидов (НА) вируса гриппа лошадей в биологических жидкостях.

Грипп лошадей - острое высококонтагиозное респираторное заболевание, характеризующееся поражением слизистых оболочек верхних дыхательных путей, лихорадкой, симптомами общей интоксикации, нарушением деятельности сердечно-сосудистой и нервной систем. Согласно классификации Международного комитета по таксономии вирусов вирус гриппа лошадей относится к семейству Orthomyxoviridae (от греч. orthos - прямой и греч. myxa - слизь), роду Influenzavirus А, виду Influenza A virus. Вирионы вируса гриппа представляют собой сферические частицы диаметром 80-120 нм, в центре находятся РНК-фрагменты, заключенные в липопротеидную оболочку, на поверхности которой имеются «шипы», состоящие из гемагглютинина (H или НА) и из нейраминидазы (N или NA). По антигенным вариантам поверхностных гликопротеидов H и N выделяют серотипы, два из которых H7N7 и H3N8 вызывают грипп лошадей. Однако в настоящее время эпизоотии гриппа лошадей обусловлены вирусом 2-го подтипа - H3N8, а вирус первого подтипа (H7N7) полностью элиминирован в популяции лошадей, либо эта инфекция протекает субклинически [1].

Гриппозная инфекция остается серьезной проблемой для коневодства, вызывая массовые вспышки респираторных заболеваний лошадей во всем мире. Заболевание наносит существенный ущерб коневодству вследствие снижения племенной и спортивной ценности переболевших животных, затрат на лечение, карантинных мероприятий, срыва планов спортивных соревнований и других экономически значимых причин.

Диагностика гриппа лошадей осуществляется по оценке наличия антител в сыворотках животных, при этом наиболее широко применяются серологические методы исследования, а именно реакция торможения гемагглютинации (РТГА) и одиночный радиальный гемолиз (ОРГ). С этой целью определения повышения уровня антител к вирусу гриппа лошадей исследуют парные пробные сыворотки крови, взятые у животных в первые дни болезни и спустя 2-3 недели. В настоящее время в серологической диагностике не используются методы, позволяющие выявлять возбудитель заболевания в начальный период инфекции до появления антител к вирусу гриппа лошадей, что снижает эффективность лечебных и профилактических мероприятий.

Для выявления антигенов вируса гриппа лошадей наибольшей чувствительностью и специфичностью обладают тест-системы, в основу которых положен принцип меченых антител - иммуноферментный анализ (ИФА). Использование моноклональных антител для приготовления конъюгатов антител с меткой позволяет повысить специфичность анализа, обеспечить большую достоверность и информативность анализа. Кроме того, методология постановки ИФА разработана для применения в массовых исследованиях.

В доступной нам литературе сведения о штаммах гибридомных культур клеток, продуцирующих моноклональные антитела к антигену Н3 вируса гриппа лошадей, не найдены.

В задачу наших исследований входило - получить штамм постоянной гибридомной линии клеток, обладающий in vitro высокой продукцией моноклональных антител к поверхностному гликопротеиду (Н3) вируса гриппа лошадей, которые можно использовать в качестве «захватывающих» и детектирующих антител в ИФА.

Способ получения предложенного штамма состоит в следующем.

Предлагаемый штамм гибридных клеток получен путем слияния клеток перевиваемой культуры миеломы мыши P3-X63-Ag-8. 653 с лимфоцитами селезенки мыши линии BALB/c, иммунизированной двукратным внутрибрюшинным и однократным внутривенным введением 100 мкг очищенного антигена вируса гриппа лошадей H3N8 штамма «А/лошадь 2/Битца/07».

На высоте иммунного ответа (через 3 дня после последней инъекции) провели слияние спленоцитов иммунизированных мышей с клетками мышиной миеломы линии P3-X63-Ag-8. 653.

Слияние клеток проводили по стандартной методике с использованием ПЭГ с м.м. 1500. Соотношение клеток миеломы и лимфоцитов составляло 1:4-1:10. Селекцию гибридом проводили на среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин. Гибридомы культивировали на 96-луночных панелях производства фирмы «Nunc» на среде RPMI-1640 с добавлением 10% сыворотки эмбрионов коров в атмосфере, содержащей 5% CO₂.

Скрининг гибридом на продукцию специфических моноклональных антител проводили методом твердофазного ИФА с использованием аллантоисной жидкости, содержащей вирус гриппа лошадей двух подтипов: H7N7 и H3N8 («Equine 1/Prague» и «А/лошадь 2/Битца/07»). Клонирование и реклонирование клеточных культур проводили на 96-луночных панелях методом предельных разведений с использованием макрофагального фидерного слоя.

В результате был отобран и размножен клон клеток, продуцирующий моноклональные антитела к поверхностному гликопротеиду (Н3) вируса гриппа лошадей. Этот клон клеток был последовательно размножен в 96-, 24-луночных панелях, а затем в культуральных матрасах.

Культуральная жидкость была исследована на содержание специфических антител. Титр специфических антител в ИФА составлял 1:16-1:64. Препараты моноклональных антител получали трехкратным осаждением раствором сульфата аммония 50% насыщения с последующим диализом. Была определена видовая принадлежность и специфичность моноклональных антител методом ИФА.

Предложенный штамм обладает следующими свойствами.

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ. Клетки однородные, округлой формы с крупным овальным ядром, содержащим от 1 до 3, чаще 1-2 ядрышек. При посеве клетки равномерно распределяются на поверхности субстрата и в культуральной жидкости. Индекс пролиферации равен 5-6.

КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА. Клетки культивируют в среде RPMI-1640 с добавлением 10% сыворотки эмбрионов коров. Клетки размножаются в суспензии, частично прикрепляясь к поверхности пластикового культурального сосуда. Посевная концентрация 10000 клеток/см³ ростовой среды. Через 2-3 суток после образования суспензии, 80% культуральной жидкости удаляют вместе с находящимися в ней клетками. К оставшимся клеткам добавляют такой же объем свежей питательной среды, pH 7,2-7,4. Кратность рассева 1:5. Периодичность субкультивирования - 1 раз в 3-5 суток. При посевной концентрации 20000 клеток/см² суспензия формируется через 2-3 суток. Индекс пролиферации равен 5-6.

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ В ОРГАНИЗМЕ ЖИВОТНЫХ. Клетки вызывают образование асцитов у линейных мышей BALB/c, обработанных пристаном за 7-10 дней до внутрибрюшинного введения 2-10×10⁶ клеток/мышь. Активность в ИФА асцитной жидкости составляет 1:1280-1:5120.

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА. Штамм продуцирует моноклональные антитела к поверхностному гликопротеиду (HA) вируса гриппа лошадей H3, не имеющие перекрестной реактивности с поверхностным гликопротеидом (HA) вируса гриппа лошадей H7. Специфичность антител определяют в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с использованием в качестве антигенов аллантоисной жидкости, содержащей вирус гриппа лошадей двух подтипов: H7N7 и H3N8 («Equine 1/Prague» и «А/лошадь 2/Битца/07»).

КОНТАМИНАЦИЯ. Контаминация простейшими, грибами, бактериями, микоплазмами, вирусами не выявлена.

ХРАНЕНИЕ КУЛЬТУР. Среда для замораживания: 70% среды RPMI-1640, 20% сыворотки эмбрионов коров, 10% диметилсульфоксида. Концентрация клеток в пластиковых криопробирках 1,5-2,0×10⁶ клеток/см³ среды. Режим замораживания: до минус 70°C-1°/мин, далее - жидкий азот (минус 196°C). Восстановление после замораживания: быстрое размораживание при 37°C, центрифугирование при 1200 об/мин 10 мин, ресуспендирование в ростовой среде. Жизнеспособность после размораживания 70-80%.

Штамм используют при изготовлении диагностической тест-системы для выявления вируса гриппа лошадей H3N8 в биологических жидкостях.

Штамм гибридных клеток AC25 является постоянной линией клеток с неограниченным сроком жизни, пригодной для биотехнологии при наработке препаратов.

Свойства штамма и продуцируемых им моноклональных антител отражены в конкретных примерах.

Пример 1. Иммунологические свойства моноклональных антител. Специфичность антител определяют методом иммуноферментного анализа в планшетах, сенсибилизированных вирусом гриппа лошадей двух подтипов: H7N7 и H3N8 («Equine 1/Prague» и «А/лошадь 2/Битца/07»). В планшет вносят культуральную жидкость и инкубируют 1,5 часа при 37°C, вносят конъюгат антител против иммуноглобулина IgG мыши с пероксидазой (изготовленный предприятием по производству бакпрепаратов НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН), инкубируют в том же режиме и вносят субстратную смесь, содержащую перекись водорода и ТМБ. После развития окрашивания в течение 10 мин останавливают реакцию добавлением раствора серной кислоты и измеряют значения оптической плотности. Значения оптической плотности в лунках, сенсибилизированных вирусом гриппа лошадей 2-го подтипа «А/лошадь 2/Битца/07» и 1-го подтипа «Equine 1/Prague», составили соответственно 1,725 и 0,031. Отношение оптических плотностей, превышающее 55, свидетельствует о том, что моноклональные антитела взаимодействуют только с антигеном вируса гриппа лошадей 2-го подтипа (H3N8) и не обладают кросс-реактивностью по отношению к антигену вируса гриппа лошадей 1-го подтипа H7N7.

Пример 2. Культивирование штамма in vitro и количественная оценка продукции антител. Клетки штамма АС25 культивируют в стеклянных матрасах при температуре 37,0°C в питательной среде, состоящей из среды RPMI-1640 и 10% сыворотки крови эмбрионов коров, антибиотиков (пенициллина и стрептомицина по 500000 ЕД/дм³). Оптимальная плотность посадки 2×10⁴ клеток на 1 см³ среды. Через 3-5 суток после образования суспензии культуральную жидкость частично удаляют и добавляют необходимое количество свежей питательной среды. Титр антител к антигену H3 вируса гриппа лошадей в культуральной жидкости в ИФА составил 1:64.

Пример 3. Культивирование в организме животных и количественная оценка продукции антител. Клетки штамма в дозе 2-10×10⁶ клеток/мышь в 0,5 см³ фосфатно-солевого буфера вводили в брюшную полость линейных мышей BALB/c, которым предварительно за 7 суток ввели 0,3 см³ пристана. На 10-14 сутки получали асцитическую жидкость, титр специфических моноклональных антител к антигену Н3 вируса гриппа лошадей в которой составил в ИФА 1:2560.

Пример 4. Проведение иммуноферментного анализа с использованием моноклональных антител. Препараты моноклональных антител получали из асцитической жидкости трехкратным осаждением раствором сульфата аммония 50% насыщения с последующим диализом.

На первом этапе поверхность пластика панели для микротитрования сенсибилизировали за счет неспецифической адсорбции препаратом моноклональных антител к антигену H3 вируса гриппа лошадей, продуцируемых штаммом АС25, из раствора с концентрацией 10 мкг/см³ при pH 7,2-7,4. Инкубацию проводили в течение 16-20 часов при температуре 4°C.

Вносили контрольные и анализируемые образцы смывов из носовой полости и инкубировали в течение 1 час при температуре 37°C.

Избыток реагентов после каждой стадии сенсибилизации твердой фазы и проведения иммуноферментного анализа отмывали раствором детергента в фосфатно-солевом буферном растворе.

В качестве детектирующих антител использовали меченные пероксидазой глобулины петуха, иммунизированного вирусом гриппа лошадей 2-го подтипа. Связывание антител с пероксидазой из корней хрена проводили методом, разработанным Wilson, Nakane после активации фермента перйодатом натрия [2]. Инкубацию проводили в течение 1 часа при температуре 37°C.

Учет реакции проводили по изменению оптической плотности анализируемых образцов по сравнению с контрольными отрицательными образцами после добавления субстратной смеси, содержащей тетраметилбензидин (ТМВ) и перекись водорода H₂O₂. Положительными считали пробы, оптическая плотность которых в два и более раз превышала оптическую плотность отрицательного контроля.

При проведении исследования 25 проб смывов из носовой полости у животных в период инфицирования хозяйства установили, что вирус гриппа 2-го подтипа выявлен у 15 животных.

Предложенный штамм апробирован с положительным результатом в Государственном научном учреждении «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р.Коваленко Россельхозакадемии» (ГНУ ВИЭВ Россельхозакадемии) в 2013 году.

Технико-экономическое обоснование. Получен штамм АС25 гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела к поверхностному гликопротеиду (НА) вируса гриппа лошадей H3N8, характеризующийся следующими полезными свойствами:

- является постоянной линией клеток с неограниченным сроком жизни, пригодной для биотехнологии при наработке препаратов;

- обладает высоким уровнем продукции моноклональных антител. Титры антител в нативной культуральной жидкости составляли 1:16-1:64, в асцитической жидкости 1:1280-1:5120 в иммуноферментном анализе;

- моноклональные антитела специфичны к поверхностному гликопротеиду (НА) вируса гриппа лошадей H3;

- моноклональные антитела не реагируют с поверхностным гликопротеидом (НА) вируса гриппа лошадей Н7;

- моноклональные антитела, фиксированные на твердой фазе, обеспечивают прочную фиксацию антигена вируса гриппа лошадей и специфичность иммуноферментного анализа при выявлении вируса гриппа лошадей H3N8 в биологическом материале;

Штамм АС25 депонирован в Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных РККК (СХЖ РАСХН) ВИЭВ под №86.

Штамм АС25-продуцент моноклональных антител к поверхностному гликопротеиду (НА) вируса гриппа лошадей H3N8 может найти применение при изготовлении иммуноферментной тест-системы для диагностики гриппа лошадей. Использование такой тест-системы позволит выявлять возбудитель заболевания в первые дни инфицирования до появления антител, что позволит повысить эффективность противоэпизоотических мероприятий, сократить сроки оздоровления коневодческих хозяйств, неблагополучных по гриппу лошадей.

Источники информации

1. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. - 7^th ed. Volumes 1 and 2, 2012. - xxxv + 1404p.

2. Книга "Immunofluorescence and related staining techniques" под ред. W. Knapp.- Elsevier: North-Holland Biomedical Press. - 1978. - P.215-221.