Результат интеллектуальной деятельности: CПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ИНГИБИТОРА СЕКРЕЦИИ СИДЕРОФОРОВ, СИНТЕЗИРУЕМОГО pgm ШТАММАМИ Y. pestis И ВЫДЕЛЕННЫЙ ИНГИБИТОР

Изобретение относится к медицинской микробиологии и касается поиска новых подходов к созданию антибактериальных препаратов, которые ингибируют такие существенные для патогенных бактерий свойства, как секреция сидерофоров, аутоагглютинация и вирулентность для животных.

В настоящее время в стратегии борьбы с инфекциями внимание исследователей привлекает процесс ассимиляции бактериями железа, в частности сидерофоры - низкомолекулярные хелаторы железа, используемые патогенными бактериями для извлечения железа из его комплексов с белками в организме хозяина. Сидерофоры являются признанными факторами вирулентности многих патогенных бактерий. Не исключением является и возбудитель чумы (Yersinia pestis), которому сидерофор иерсиниабактин (Ybt) необходим для роста в железодефицитных условиях при 37°C и проявления высокой вирулентности для лабораторных животных [1].

Известны синтетические ингибиторы биосинтеза иерсиниабактина, которые обладали антибактериальной активностью против возбудителя чумы в железодефицитных условиях in vitro [2]. Данные о проверке эффективности этих препаратов на модели животных в литературе отсутствуют. Разработка этих препаратов была основана на представлении, что млекопитающие не синтезируют сидерофоры, и, следовательно, процесс ингибирования их синтеза представлялся специфичным для бактерий. Однако в 2010 г. сидерофоры и ферменты их биосинтеза, сходные с таковыми у бактерий, были обнаружены и у млекопитающих [3]. Было установлено, что сидерофоры млекопитающих образуют так называемый лабильный пул внутриклеточного железа, необходимый для образования реактивных соединений кислорода иммунокомпетентными клетками. Отсутствие у животных способности синтезировать эти сидерофоры приводило к нарушению метаболизма железа и повышению чувствительности к бактериальным инфекциям. Эти данные свидетельствуют о том, что терапевтическое применение ингибиторов, воздействующих на этап синтеза сидерофоров, может иметь побочные эффекты.

Наиболее близкой к предмету предлагаемого изобретения является работа [4], в которой получены первые сведения о том, что аттенуированные бактерии, которые с высокой частотой образуются в популяции эпидемических штаммов Y.pestis, синтезируют природный ингибитор сидерофорной активности. В этой работе авторы показали, что мутанты Y.pestis, в которых произошла делеция хромосомного pgm локуса (pgm^- штаммы), кодирующего белки биосинтеза и транспорта сидерофора иерсиниабактина, не только не проявляют активности на индикаторной среде для выявления сидерофоров, но и выделяют в среду вещество, ингибирующее сидерофорную активность pgm⁺ штаммов. Однако это вещество не было выделено и охарактеризовано.

Проведенное авторами предлагаемого изобретения изучение этого ингибитора показало, что он влияет не на синтез, а на выделение сидерофоров в среду различными штаммами Y.pestis, и поэтому он был назван ингибитором секреции сидерофоров (siderophore secretion inhibitor, SSI).

Техническая задача предлагаемого изобретения состояла в разработке способа выделения ингибитора секреции сидерофоров (SSI) как препарата, снижающего вирулентность Y.pestis.

Поставленная задача достигается тем, что способ выделения ингибитора секреции сидерофоров, синтезируемого pgm^- штаммами Y.pestis, включает следующие стадии:

а) в качестве штамма-продуцента используют штамм Y.pestis КМ 1279 (депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб»), который получен из pgm^- вакцинного штамма Y.pestis EV76;

б) штамм Y.pestis КМ 1279 засевают петлей в 5 мл среды LB и выращивают в термостате при 26°C 48 час;

в) по 0,2 мл культуры засевают на 10 чашек Петри с 1,5% агаром LB (pH 7,2) и выращивают при 26°C в течение 48 час;

г) бактерии смывают с поверхности агара холодным (4°C) забуференным фосфатом физраствором (ЗФР) и осаждают их центрифугированием (8000 об/мин) на холоду (4°C) в течение 15 минут;

д) бакмассу в количестве 10 г дважды отмывают от остатков питательной среды, суспендируя бактерии в ЗФР и осаждая их центрифугированием (8000 об/мин) на холоду (4°C) в течение 15 минут;

е) клеточный осадок суспендируют в 100 мл раствора 5 мМ NaOH (рН 9,0), выдерживают, периодически встряхивая, при 37°C два часа и отделяют клетки центрифугированием (8000 об/мин) при 20°C в течение 15 минут, супернатант отбирают и процедуру повторяют трижды;

ж) три супернатанта в объеме 300 мл объединяют и фильтруют через нитроцеллюлозную мембрану с диаметром пор 0,22 мкм и получают щелочной раствор, в котором содержится ингибитор;

з) щелочной раствор трехкратно экстрагируют смесью хлороформ-метанол-вода (5:2:1) в количестве 50 мл, разделяя хлороформную и водно-метанольную фракции путем центрифугирования при 8000 об/мин 10 мин;

и) хлороформные фракции отбирают, объединяют и освобождают от водорастворимых примесей путем экстракции водой, водную фракцию отделяют центрифугированием при 8000 об/мин 10 мин и удаляют;

к) хлороформную фракцию высушивают в вакуумном роторном испарителе и получают 10 мг сухого препарата.

Кроме того, ингибитор секреции сидерофоров, который расположен на поверхности бактерий Y.pestis и присутствие которого коррелирует со способностью клетки чумного микроба к блокировке сидерофорной активности и снижению аутоагглютинации бактерий, характеризуется:

- молекулярной массой 380,6 Да;

- присутствием ионов железа;

- флуоресценцией в ультрафиолете;

- липопептидной природой;

- гидрофобными свойствами;

- коричневой окраской сухих кристаллов.

Способ выделения SSI осуществляется следующим образом.

В качестве штамма-продуцента SSI используют штамм Y.pestis КМ 1279 (депонирован заявителями в Государственной коллекции патогенных бактерий ФГУЗ Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб» Роспотребнадзора). Штамм получен из pgm^- штамма Y.pestis EV76 путем удаления из него трех характерных для возбудителя чумы плазмидных репликонов. Способ выделения SSI из штамма Y.pestis КМ 1279 включает следующие технические приемы:

I - получение бактериальной массы;

II - выделение SSI;

III - очистка препарата.

Первый прием состоит в получении бактериальной массы штамма-продуцента SSI. С этой целью штамм Ypestis КМ 1279 предварительно засевают петлей в 5 мл среды LB (Difco, США) и выращивают в термостате при 26°C 48 час. После этого по 0,2 мл культуры засевают на 10 чашек Петри с 1,5% агаром LB (pH 7,2) и выращивают при 26°C на протяжении 48 час. Затем бактерии смывают с поверхности агара холодным (4°C) забуференным фосфатом физраствором (ЗФР) и осаждают их центрифугированием (8000 об/мин) на холоду (4°C) в течение 15 минут. Далее 10 г бакмассы дважды отмывают от остатков питательной среды, суспендируя бактерии в ЗФР и осаждая их центрифугированием (8000 об/мин) на холоду (4°C) в течение 15 минут.

Второй прием заключается в смыве SSI с поверхности бактерий. Для этого полученный клеточный осадок суспендируют в 100 мл раствора 5 мМ NaOH (pH 9,0), выдерживают, периодически встряхивая, при 37°C два часа. После этого отделяют клетки центрифугированием (8000 об/мин) при 20°C в течение 15 минут, супернатант отбирают и процедуру повторяют трижды. Затем три супернатанта объединяют и фильтруют через нитроцеллюлозную мембрану с диаметром пор 0,22 мкм и получают щелочной раствор, в котором содержится SSI.

Третий прием представляет собой очистку препарата. Для этого к полученному щелочному раствору добавляют 50 мл смеси хлороформ-метанол-вода в соотношении (5:2:1) и проводят трехкратную экстракцию SSI. Хлороформную и водно-метанольную фракции разделяют путем центрифугирования при 8000 об/мин 10 мин. После этого хлороформные фракции отбирают, объединяют и освобождают от водорастворимых примесей путем экстракции водой, водную фракцию отделяют центрифугированием при 8000 об/мин 10 мин и удаляют. Затем хлороформную фракцию высушивают в вакуумном роторном испарителе и получают 10 мг сухого препарата SSI, представляющего собой кристаллы коричневого цвета.

Характеристика физико-химических свойств SSI

Полученный препарат SSI характеризуется следующими свойствами: а) сухой препарат SSI представляет собой кристаллы коричневого цвета, обладающие гидрофобными свойствами, поскольку не растворяются в воде, но растворяются в органических растворителях (этаноле, этилацетате, ацетоне, хлороформе, бензоле);

б) SSI является флуоресцирующим низкомолекулярным веществом липопептидной природы (пример 1);

в) SSI имеет молекулярную массу 380,6 Да (пример 2);

г) в состав SSI входят ионы железа, которые выявляются в препарате после его обработки 30 мМ НСl (пример 3).

Таким образом, анализ физико-химических свойств полученного с помощью вышеописанного метода препарата показал, что SSI является низкомолекулярным, гидрофобным, флуоресцирующим веществом липопептидной природы. Присутствие ионов железа, которые выявляются только после обработки препарата кислотой, свидетельствует о том, что SSI представляет собой связанный с железом хелатор.

Характеристика функциональных свойств SSI

Использование выделенного препарата в микробиологических экспериментах и в опытах по заражению лабораторных животных бактериями высоковирулентного штамма Y.pestis позволило выявить у SSI следующие функциональные свойства:

а) в присутствии SSI бактерии pgm⁺ штаммов Y.pestis, проявляющие сидерофорную активность на индикаторной среде для выявления сидерофоров, утрачивают способность выделять сидерофоры в среду (пример 4);

б) препарат SSI снижает аутоагглютинацию pgm⁺ бактерий Y.pestis, характеризующихся, в отличие от pgm^- бактерий, высокой способностью к агрегации даже в дистиллированной воде (пример 5);

в) при введении препарата мышам вместе с высоковирулентным штаммом Y.pestis 231 SSI снижает способность штамма вызывать летальное заболевание животных (пример 6).

Следовательно, анализ функциональных свойств SSI показал, что он не только ингибирует выделение в среду сидерофоров, но и тормозит аутоагглютинацию бактерий, а также их вирулентность для мышей.

Пример 1. Свидетельствующий о чистоте препарата и о липопептидной природе SSI

Изучение свойств полученного с помощью вышеописанного метода препарата SSI путем гель-электрофореза и тонкослойной хроматографии было проведено при использовании в качестве контроля препарата сидерофора иерсиниахелина (Ych). Препарат Ych получают из штамма Y.pestis КМ 1279, как описано ранее [5]. Анализ препаратов SSI и Ych с помощью гель-электрофореза в полиакриламидном геле показал, что в низкомолекулярной области SSI дает одну полосу, которая интенсивно флуоресцирует при облучении ультрафиолетом с длиной волны 254 нм (см. фото 1А, где 1 - SSI ДО мкг, 2 - Ych, 10 мкг).

После окраски гелей универсальным красителем «Stains-all» в препарате SSI также выявлялась одна полоса, окрашивающаяся в характерный для липидов желтый цвет. При этом препарат Ych не обладал флуоресценцией и не окрашивался красителем «Stains-all».

Отсутствие в препарате SSI примесей также подтверждалось с помощью восходящей тонкослойной хроматографии на пластинах силикагеля и использования 80% этанола в качестве мобильной фазы (см. фото 1Б, где 1 - SSI, 1 мкг, 2 - Ych, 1 мкг). И в этом анализе в образцах, содержащих SSI, на хроматограммах обнаруживалось одно пятно с Rf 0,9, которое окрашивалось в парах йода и флуоресцировало при облучении ультрафиолетом. При этом препарат Ych, имевший Rf 0,7, окрашивался йодом, но не обладал флуоресцентными свойствами. После опрыскивания пластин 0,2%-ным раствором нингидрина в ацетоне (с последующим прогреванием при 110°C) SSI, но не Ych, окрашивался в фиолетовый цвет, характерный для α-аминокислот и содержащих их пептидов.

Вывод: SSI представляет собой липопептид, содержащий в своем составе флюорофор.

Пример 2. Иллюстрирующий молекулярную массу SSI

Молекулярную массу SSI определяют с помощью времяпролетной масс-спектрометрии с ионизацией лазерной десорбцией при содействии матрицы (matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass-spectrometry, MALDI-TOF-MS). С этой целью используют масс-спектрометр Bruker Reflex III (Bruker Daltonics Coventry, UK). В качестве матрицы используют оксибензойную кислоту, на которую наносили препарат SSI, растворенный в этилацетате. Спектр зарегистрирован в виде положительно заряженных ионов в диапазоне m/z 100-6000. Анализ спектра (см. график на Фиг.1) показал, что молекулярный ион SSI соответствует m/z 380,6.

Вывод: SSI является низкомолекулярным веществом с молекулярной массой 380,6 Да.

Пример 3. Доказывающий присутствие в SSI связанного железа

В препарате SSI, который обрабатывают 30 мМ соляной кислотой, в отличие от необработанного препарата, были обнаружены ионы железа с помощью коммерческого хромогенного хелатора железа хромазурола S (CAS). Отделяющиеся от SSI в кислой среде ионы железа окрашивали CAS-реагент в синий цвет. Фракционирование обработанного кислотой препарата SSI с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) показало, что он содержит две фракции (см. график на Фиг.2).

На графике (Фиг.2): А. ВЭЖХ на колонке С-18-Nucleosil ODS. Элюент - раствор ацетонитрила с линейным градиентом концентрации (0-60%) в течение 30 мин. Б. MALDI-TOF - масс-спектры двух фракций SSI, полученных при ВЭЖХ.

Первая из них (1) обладала слабой флуоресценцией и не ингибировала секрецию сидерофоров, т.е. не обладала свойствами SSI. Во второй фракции (2) содержалось интенсивно флуоресцирующее в ультрафиолете вещество, поэтому его поглощение при 215 нм было значительно ниже, чем у вещества из первой фракции.

При MALDI-TOF-MS (Фиг.2Б) вещество 1 имело m/z 302,63, а вещество 2 - 359,9. При этом вещество с m/z 359,9, в отличие от вещества с m/z 302,63, обладало всеми свойствами SSI. Разница в m/z исходного препарата SSI и его фракций в кислой среде, а также выявление в препарате, обработанном кислотой, ионов железа позволили заключить, что значение m/z 380,6 соответствует натриевой соли связанного с железом вещества (m/z 359,9), которое в кислой среде теряет железо (m/z 302,6).

Вывод: SSI является связанным с железом хелатором железа.

Пример 4. Подтверждающий способность препарата SSI блокировать секрецию сидерофоров бактериями Y.Pestis

Сидерофор-ингибирующая активность препарата была исследована при его добавлении к индикаторному штамму Y.pestis 336 (подвид caucasica) и высеве бактерий на индикаторную среду для выявления сидерофоров. Среда содержит хромогенный хелатор железа хромазурол S (CAS), который при 30%-ном насыщении железом имеет сине-зеленую окраску, изменяющуюся на желтую после удаления ионов железа сидерофорами. Штамм Y.pestis 336, в отличие от большинства штаммов Y.pestis, которые с высокой частотой утрачивают pgm локус, стабильно сохраняет pgm локус и сидерофорную активность на индикаторной среде. Добавление SSI в дозе 1-10 мкг к 10 мкл суспензии Y.pestis 336, содержащей 10⁹ кл./мл, и посеве суспензии на CAS-агар выявило способность препарата блокировать выделение сидерофоров в среду. В отличие от контрольной культуры, не содержащей SSI, культура с SSI не образовывала зон просветления СAS-реактива вокруг посева (см. фото 2).

На фото: 1. Y.pestis 336 - контроль без добавления SSI. 2. Y.pestis 336+1 мкг SSI. 3. Y.pestis 336+5 мкг SSI. 4. Y.pestis 336+10 мкг SSI.

Вывод: SSI блокирует секрецию сидерофоров бактериями Y.pestis.

Пример 5. Демонстрирующий способность препарата SSI снижать аутоагглютинацию Y.pestis Влияние SSI на экспрессию признака аутоагглютинации было выявлено при сравнении изогенных pgm⁺ и pgm^- клонов штамма Y.pestis TS. Оба типа клеток обладали этим признаком, хотя он был выражен у них в разной степени. Продуцирующие SSI pgrri клетки, образующие легко диспергируемые хлопья в жидкой среде, по сравнению с pgm⁺ клетками, обладают большей поверхностной гидрофобностью и агглютинировали только в солевых растворах. Более выраженной АА была у не продуцирующих SSI pgm⁺ клеток, которые образовывают прочные агрегаты даже в дистиллированной воде, в отличие от pgm^- клеток. Анализ способности pgm⁺ бактерий проявлять аутоагглютинацию в воде показал, что в присутствии SSI, они теряли способность агглютинировать в воде (см. Фото 3).

На фото: 1. Y.pestis TS - контроль без добавления SSI. 2. Y.pestis TS+1 мкг SSI. 3. Y.pestis TS+5 мкг SSI. 4. Y.pestis TS+10 мкг SSI.

После взаимодействия с SSI pgm⁺ бактерии агглютинируют только в солевых растворах, как и pgm^- бактерии.

Вывод: SSI снижает способность Y.pestis к аутоагглютинации.

Пример 6. Выявляющий ингибирующее действие SSI на вирулентность возбудителя чумы

Влияние SSI на вирулентность возбудителя чумы анализируют при использовании высоковирулентного штамма Y.pestis 231 (LD₅₀ 2,5±1,4 кл.). В этом эксперименте трем группам мышей вводят подкожно по 1000 бактерий (первая группа), 1000 бактерий +10 мкг SSI (вторая группа), а также 1000 бактерий +10 мкг SSI, инактивированного путем удаления из него железа в кислой среде методом экстракции препарата 8-оксихинолином (третья группа). Анализ количества павших в течение 21 дня (срок наблюдения) после заражения животных показал, что препарат SSI снижает способность штамма Y.pestis 231 вызывать летальную инфекцию у мышей. В трех независимых экспериментах добавление к бактериям активного препарата SSI за 30 мин перед заражением приводило к выживанию больше половины животных. При этом инактивированный препарат SSI, утративший связанное железо и способность ингибировать секрецию сидерофоров и аутоагглютинацию, не влиял на вирулентность. Все животные, зараженные Y.pestis вместе с этим препаратом, погибали в сроки, достоверно не отличавшиеся от таковых в контрольной группе (см. Фиг.3).

Вывод: SSI снижает вирулентность возбудителя чумы.

Таким образом, выделенный с помощью вышеописанного способа препарат SSI обладает ингибирующим действием на такие существенные для патогенных бактерий свойства Y.pestis, как секреция сидерофоров, аутоагглютинация и вирулентность для лабораторных животных.

Полученные результаты позволяют заключить, что SSI, продуцируемый аттенуированными pgm^- клетками и отсутствующий у вирулентных pgm⁺ бактерий Y.pestis, является природным регулятором вирулентности возбудителя чумы. Дальнейшее изучение этого регулятора будет способствовать расшифровке молекулярных механизмов регуляции патогенных свойств Y.pestis, а также разработке препаратов нового поколения для патогенетического лечения чумы. Ингибирование вирулентных свойств Y.pestis, ограничивающее размножение бактерий в организме хозяина, будет не только усиливать действие применяемых антибиотиков, но и обеспечит иммунной системе возможность эффективно элиминировать возбудителя. Создание подобных препаратов может расширить арсенал средств борьбы с чумой как при самостоятельном применении, так и в сочетании с регламентированной этиотропной терапией.

Источники информации

1. Perry R., Fetherston J. Yersiniabactin iron uptake: mechanisms and role in Yersinia pestis pathogenesis. Microb. Infect. 2011, 13, 808-817.

2. Stirrett K.L, Ferreras J.A., Jayaprakash V., Sinha B.N., Rene Т., Quadri L.E., N. Small molecules with structural similarities to siderophores as novel antimicrobials against Mycobacterium tuberculosis and Yersinia pestis. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2008, 18, 2662-2668.

3. Devireddy L.R., Hart D.O., Goetz D.H. and Green M.R. A mammalian siderophore synthesized by an enzyme with a bacterial homolog involved in enterobactin production. Cell. 2010, 141, 1006-1017.

4. Подладчикова O.H., Иванова B.C., Еременко H.C., Лебедева C.A. Характеристика мутантов возбудителя чумы, различающихся по признаку пигментсорбции. Мол. генет., микробиол. и вирусол. 2003, 1, 26-31.

5. Podladchikova О., Rykova V., Antonenka U., Rakin A. Yersinia pestis autoagglutination is mediated by Hep-like protein and siderophore yersiniachelin. Adv. Exp. Med. Biol. 2012, 954, 289-292.