СПОСОБ ОЦЕНКИ НАРУШЕНИЯ ОКСИГЕНАЦИИ ГЕМОГЛОБИНА В ЭРИТРОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ БЕРЕМЕННЫХ НА ТРЕТЬЕМ ТРИМЕСТРЕ ГЕСТАЦИИ ПРИ СНИЖЕНИИ ГЛЮКОНЕОГЕНЕЗА НА ФОНЕ ОБОСТРЕНИЯ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ

Глюконеогенез - процесс образования углеводов из неуглеводных предшественников: пирувата, лактата, аминокислот [1, 2, 3, 4, 6, 7, 8]. Этот процесс активно протекает в печени, почках, мышцах, эритроцитах и других органах [1, 9]. Глюконеогенез протекает во взаимодействии не только с гликолизом, но и с другими метаболическими процессами, такими как цикл трикарбоновых кислот, обмен жирных кислот и другие. Исходя из этого контроль глюконеогенеза должен осуществляться не только ключевыми ферментами глюконеогенеза, но и ферментами гликолиза, сателлитными ферментами глюконеогенеза, связывающими глюконеогенез с циклом трикарбоновых кислот, а также с метаболитами и кофакторами, такими как окисленные и восстановленные формы никотинамидных нуклеотидов (НАД⁺, НАДН), оксалатацетата, ацетил-КоА [7].

«Обход» необратимых ключевых реакций гликолиза при синтезе углеводов из неуглеводных предшественников обеспечивают ключевые ферменты глюконеогенеза: фосфоенолпируватдегидрогеназа, пируваткарбоксилаза, которые относятся к группе сателлитных ферментов глюконеогенеза [1]. При глюконеогенезе из лактата НАД⁺ восстанавливается за счет окисления лактата в пируват, катализируемого лактатдегидрогеназой. Фосфоенолпируват является предшественником глюкозы в цикле глюконеогенеза [12].

Эритроциты привлекают особое внимание с позиций оценки в них процессов глюконеогенеза, поскольку они лишены самого главного источника энергообразования - цикла трикарбоновых кислот (цикла Кребса). Процесс глюконеогенеза для эритроцитов приобретает особую важность. Очень слабо разработаны вопросы влияния факторов, которые могут влиять на скорость реакций глюконеогенеза. Отмечено, что на снижение глюконеогенеза могут влиять голод или снижение уровня инсулина при диабете [10, 11, 13].

Цель исследования: изучить гистохимическим методом интенсивность реакции фосфоенолпируватдегидрогеназы, обеспечивающей процесс синтеза через лактат гликогена в эритроцитах на фоне обострения в организме цитомегаловирусной инфекции у беременных на третьем триместре гестации, что приводит к формированию неустойчивости эритроцитов и формированию угрозы развития гипоксического состояния.

Заявленный способ имеет следующие приемы.

1. Обследовано 40 беременных на сроке гестации 20-22 недели в возрасте 18-25 лет с хронической цитомегаловирусной инфекцией (ЦМВИ) в стадии обострения (основная группа) и 15 беременных на тех же сроках гестации без патологии (контрольная группа). У беременных симптоматически ЦМВИ проявлялась в виде острого респираторного заболевания, сопровождающегося ринофарингитом. Клинический диагноз - обострение ЦМВИ - устанавливался при комплексном исследовании периферической крови на наличие IgM или четырехкратного и более нарастания титра антител IgG в парных сыворотках в динамике через 10 дней, индекса авидности - более 65%, а также ДНК ЦМВ. Исследования проводились с учетом требований Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных исследований с учетом человека» с поправками 2000 г. и правилами клинической практики в Российской Федерации, утвержденными приказом Министерства РФ №266 от 19.06.2003 г.

Верификация ЦМВ, определение типоспецифических антител, индекса авидности осуществлялись методами ИФА на спектрофотометре «Stat Fax 2100» (USA) с использованием тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск); выявление ДНК ЦМВ методами ПЦР на аппарате ДТ-96 с использованием наборов НПО «ДНК-технология» (Москва).

2. Активность фосфоенолпируватдегидрогеназы в эритроцитах периферической крови беременных следующим образом: гепаринизированную кровь, взятую у беременной в третьем триместре на фоне обострения цитомегаловирусной инфекции до титра антител 1:1600 в количестве 0,5 мл, помещали в 0,5 мл инкубационного раствора (1М фосфоенолпирувата - 0,4 мл; НАДФ - 4 мг/2 мл; рН - 7,5). Смешивали и помещали на 15 мин в термостат при 37°C, затем каплю взвеси помещали на предметное стекло, покачивали, чтобы капля растеклась и слегка подсохла. После этого наносили глицерин-желатину и накрывали покровным стеклом. Эта же процедура проводилась и с кровью от контрольных беременных.

3. Полученный препарат изучали с помощью цифрового микроскопа МТ (Япония) и по компьютерной программе «Scion Image» выполняли подсчет интенсивности реакции на фосфоенолпируватдегидрогеназу, приходящуюся на 1 эритроцит (как среднюю на 100 обработанных эритроцитов).

4. Количество разных форм эритроцитов подсчитывали с помощью цитофотометрической автоматизированной установки «Mekos» (Москва) Регистрационное удостоверение МЗ РФ 29/10010198/1282-01.

5. Содержание оксигемоглобина определяли по методу Эвелина и Мэллой [5].

На основании полученных данных было установлено, что при обострении цитомегаловирусной инфекции до титра антител к цитомегаловирусу 1:1600 в третьем триместре беременности в эритроцитах периферической крови резко снижается процесс глюконеогенеза, поскольку активность фосфоенолпируватдегидрогеназы уменьшалась до 12,0±0,09 усл.ед. (Фиг.1.); контроль - 35,0±1,2 усл.ед. (Фиг.2.). На этом фоне в периферической крови количество дискоцитов уменьшалось до 74,0±1,3% (контроль - 90,0±1,5%); количество эхиноцитов увеличивалось до 7,0±0,2% (контроль - 3,0±0,06%); мишеневидных увеличивалось - до 8,5±0,3% (контроль - 4,0±0,06%); количество дегенеративных форм увеличивалось до 10,5±0,15% (контроль - 3,0±0,05%). Количество оксигемоглобина снижалось до 92,0±1,6% (контроль - 97,5±1,3%), что создает угрозу формирования у беременных гемической гипоксии.

Литература

1. Ермолаева Л.П. Регуляция глюконеогенеза в онтогенезе // М.: Наука, 1987. - С.165.

2. Кендыш И.Н. Субстратная регуляция глюконеогенеза // Успехи совр. биологии. - 1978. Т.86. вып.2 (5) - С.192-205.

3. Кендыш И.Н. Значение глюкагона в регуляции метаболизма // Успехи совр. биологии. - 1979. Т.86. вып.3 - С.359-372.

4. Кендыш И.Н. Ингибиторы глюконеогенеза // Вопр. мед. химии. - 1984. т.30. вып.4. - С.2-12.

5. Покровский А.А. Биохимические методы исследования // справочник. М.: Медицина, 1969. - С.337.

6. Шапот B.C., Блинов В.А. Глюконеогенез в животном организме // Успехи биол. химии. - 1975. Т.16. - С.196-213.

7. Hanson R.W., Fisher L. The regulation of phosphenolpyruvate carbokylase in fetal ratliver // Enzyme. 1973. Vol.15. P.97-110.

8. Hers H.G., Hue L. Gluconeogenesis and related aspects of glycolysis // Ann. Rev. Biochem. 1983. Vol.52. P.617-653.

9. Mallete L.E., Exton J.H. Control of gluconeogenesis from amine acids in the perfused rat liver // J.Biol. Chem. 1969. Vol.244. №20. P.5713-5723.

10. Robinson B.H. The postnatal development of gluconeogenic enzymes in guinea - pig kidney cortex // FEBS Lett. 1976. Vol.65. №3. P.319-321.

11. Robinson A.M., Girazd I.R. Evilence for a role of insulin in the regulation of lipogenesis in lacting rat mammary gland. Mecsurements of lipogenesis in vivo and plasma hormone concentrations in response to starvation and refeeding // Biochem. J. 1978. Vol.176, №1. P.343-346.

12. Tilgman S.M., Hanson R.W. Hormonal regulation of phosphoenol-pyruvate carboxykinase (GTR) in mammalian tissues // Gluconeogenesis: its regulation in mammalian speies 1976. P.47-91.

13. Wieland O.H., Siess E.A. Regulation of the mammalian pyruvate dehydrogenase complex by covalent modifrcation // Symposia of the Society for Experim. Biology. Symp. XXVII: Rate control of biological processes / Ed. D.D. Davis Cambridge Univ. Press. 1973. P.371-400.

На фигуре 1 изображена гистохимическая реакция на активность фосфоенолпируватдегидрогеназы в эритроцитах периферической крови беременной на третьем триместре гестации при обострении цитомегаловирусной инфекции при титре антител к цитомегаловирусу 1:1600, интенсивность реакции на фосфоенолпируватдегидрогеназу снижена до 12,0±0,09 усл.ед. Увеличение 10×90.

В эритроцитах в силу снижения активности фосфоенолпируватдегидрогеназы подавляется процесс глюконеогенеза и снижается оксигенация гемоглобина.

На фигуре 2 изображена гистохимическая реакция в эритроцитах периферической крови беременной, на третьем триместре не болевшей на протяжении всего периода гестации. Интенсивность реакции на фосфоенолпируватдегидрогеназу в эритроцитах - 55,0±1,2 усл.ед. Увеличение 10×90.