ИММУНОГЕН ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И ПРОФИЛАКТИКИ ЗАВИСИМОСТИ ОТ ОПИАТОВ

Изобретение относится к биологии и медицине, в частности к наркологии.

Известен иммуноген, представляющий собой конъюгаты производных морфина (6-гемисукцинильного и 3-O-карбоксиметильного) с белком-носителем (столбнячный анатоксин), способный, по результатам доклинических испытаний на грызунах, запускать синтез поликлональных антител к опиатам - морфину и его структурному аналогу героину - в результате повторного введения этих препаратов при активной иммунизации [EP 1767221 A2, 28.03.2007; US 20080241183 A1, 10.02.2008; US 008,008,457 В2, 30.08.2011]. При введении такого иммуногена в крови появляются в высоких титрах антитела к этим опиатам, способные связать поступающие в организм извне наркотики в кровяном русле и воспрепятствовать тем самым их проникновению в мозг через гематоэнцефалический барьер. В результате снижения положительного подкрепления угасает влечение к опиатам (морфину и его производным, в частности, героину), что было показано на модели внутривенного самовведения этих наркотиков грызунами.

Недостатком этого иммуногена является невозможность его применения в Российской Федерации в соответствии с Федеральным законом «О наркотических средствах и психотропных веществах» №3-Ф3, вступившим в силу 8 января 1998 г. Согласно пункту 6 статьи 31 этого закона «В Российской Федерации запрещается лечение наркомании наркотическими средствами и психотропными веществами, внесенными в Список II» (Постановление Правительства РФ от 30.06.1998 №681, ред. от 26.02.2013), а предложенный иммуноген предполагает введение в организм человека препарата, содержащего в своем составе наркотик. Хотя наркотик в препарате и соединен химическим (ковалентным) способом с белком-носителем, нельзя исключить нестабильность такого соединения, приводящую к самопроизвольному распаду на исходные составляющие, пусть даже в незначительных количествах.

Известен синтетический иммуноген для терапии и профилактики злоупотреблений наркотическими и психоактивными веществами [RU 2236257 C1, 15.09.2003], который представляет собой конъюгат в виде носителя - природного или искусственного белка (яичный альбумин, человеческий гаммаглобулин, микробные токсины) и наркотического или психотропного соединения из следующих групп низкомолекулярных соединений: ароматические пропанамины, или изохинолины, или дифенилметаны, или индоламины, или производные барбитуровой кислоты, или производные замещенных пиперидинов. Конъюгат модифицирован иммунокомпетентным полиэлектролитом - полиоксидонием. К недостаткам этого иммуногена, в котором используются наркотические вещества, относятся приведенные выше сведения о запрете применения в Российской Федерации таких препаратов для лечения наркомании в соответствии с №3-ФЗ «О наркотических средствах и психотропных веществах». Предлагаемый авторами упомянутого патента в качестве иммуногена для введения с целью нейтрализации опиатов в крови наркоманов конъюгат 3-гемисукцинильного производного налтрексона (налоксон и его структурный аналог пролонгированного действия налтрексон являются конкурентными антагонистами опиоидных рецепторов и разрешены к применению в клинической практике) с белком и полиоксидонием также нельзя применять для терапии или профилактики опийной наркомании, поскольку в случае острого отравления опиатами пострадавших трудно будет спасти введением налоксона. Налоксон будет связываться в кровяном русле антителами, выработанными в процессе многократных инъекций этого иммуногена, и не сможет воспрепятствовать действию наркотиков опийной группы на уровне опиоидных рецепторов мозга. Лечение опийной зависимости налтрексоном также будет невозможно из-за запуска образования антител к препарату при каждом его попадании в организм. Утверждение авторов о том, что такие антитела будут вырабатываться пожизненно, также делает этот иммуноген неприемлемым для лечения опийных наркоманов, поскольку в Российской Федерации принято лечение зависимости от опиатов длительным введением налтрексона.

Известно также средство для профилактики и лечения опийной наркомании [RU 2264228, 20.11.2005], представляющее собой иммуноген - первичные моноклональные антитела к опиатам, в частности, к конъюгату морфин-3БСА, при иммунизации которыми в организме животного или человека должны образовываться антиидиотипические (вторичные) антитела. Механизм действия такого средства, по мнению автора, связан с модификацией образуемыми антиидиотипическими антителами периферических опиоидных рецепторов, что отраженным образом может влиять на опиоидную систему мозга. Недостатком этого средства является достаточно сложная и дорогая технология получения моноклональных антител (получение поликлональных антител проще и дешевле), а также тот факт, что эффект от иммунизации будет наблюдаться только в случае присутствия в крови определенного уровня вторичных (антиидиотипических) антител к опиатам (морфину). Употребление опиатов, которое может иметь место, несмотря на иммунизацию, не будет дополнительно стимулировать выработку вторичных (антиидиотипических) антител к опиатам (морфину).

Техническим результатом предлагаемого нами изобретения является устранение вышеуказанных недостатков, расширение арсенала патогенетически обоснованных способов лечения и профилактики зависимости от опиатов, повышение эффективности терапии и предупреждение возможных побочных реакций за счет возможности применения иммуногена у человека, поскольку иммуноген не содержит в своем составе наркотические и психотропные средства, запрещенные к применению в Российской Федерации в соответствии с Федеральным законом «О наркотических средствах и психотропных веществах» №3-Ф3, вступившим в силу 8 января 1998 г.; стимуляция образования антител к наркотику, способных связать наркотик или его метаболиты в крови, при каждом повторном употреблении опиатов, благодаря наличию иммунологической памяти на иммуноген; отсутствию опасности связывания применяемых с лечебной целью конкурентных антагонистов опиоидных рецепторов - налоксона и налтрексона - третичными антителами к опиатам, а именно морфину и его производным, образуемым в результате серии повторных инъекций иммуногена.

Указанный результат достигается тем, что для лечения и профилактики зависимости от опиатов проводят серию инъекций иммуногена, представляющего собой поликлональные антиидиотипические (вторичные) антитела к опиатам, а именно морфину и его производным.

Этот иммуноген получают известным способом в результате иммунизации животных, не родственных человеку по иммуноглобулинам (например, кроликов, лошадей, баранов, крупного рогатого скота) [Клюкина B.C. Промышленные технологии производства тест-систем для диагностики инфекционных болезней свиней. Дисс. докт. биол. наук, Щелково, 2002], поликлональными идиотипическими (первичными) антителами к опиатам, а именно морфину и его производным. Первичные антитела к опиатам, а именно морфину и его производным, получают известным способом из сыворотки крови животных, серологически родственных человеку (к примеру, свиней) [Клюкина B.C. Промышленные технологии производства тест-систем для диагностики инфекционных болезней свиней. Дисс. докт. биол. наук, Щелково, 2002; Lunney J.К. Advances in swine biomedical model genomics. Int. J. Biol. Sci., 2007, 3, 179-184; Dreher F., Kamburov A., Herwig R. Construction of a pig physical interactome using sequence homology and a comprehensive reference human interactome. Evol. Bioinform., 2012, 8, 119-126], после повторных иммунизаций конъюгатами морфина и производных морфина с белком, ковалентно связанным с молекулой морфина через гидроксилы при атомах углерода в 6-ом и 3-ем положениях фенантренового кольца. Определенная часть антиидиотипических (вторичных) антител, согласно теории иммунных сетей Jerne N.K. [Towards a network theory of the immune system. Ann Immunol (Paris) 1974, 125C, 373-389], теоретически будет напоминать по конфигурации первоначальный антиген, т.е. морфин и его производные, конъюгированные с белком, и являться «внутренним образом» первоначального антигена. В результате инъекций предлагаемого нами иммуногена в организме человека может происходить образование третичных антител, напоминающих по своим характеристикам первичные антитела к опиатам.

Кроме того, в организме человека, иммунизированного предлагаемым иммуногеном, также будут вырабатываться вторичные (антиидиотипические) антитела к иммуноглобулинам G исходного животного, взятого для первичной иммунизации. Поэтому при выборе свиньи в качестве животного-продуцента первичных антител в организме человека при введении предлагаемого нами иммуногена будут образовываться вторичные антитела к свиному иммуноглобулину G, имеющие, по той же теории Jerne N.K., пространственное сходство с самим иммуноглобулином свиньи. Здесь важно отметить, что иммуноглобулин G (IgG) свиньи характеризуется высокой степенью гомологии с IgG человека, в результате чего неблагоприятные побочные реакции при введении таких антител будут сведены к минимуму.

Не вытекает явным образом из известного уровня техники, что образование в организме антител в ответ на введение иммуногена, представляющего собой антиидиотипические (вторичные) антитела к опиатам, а именно морфину и его производным, т.е. третичных антител, может реально уменьшить основные проявления опийной зависимости - влечение к опиатам и опийный абстинентный синдром, а также оказывать профилактическое действие.

Сущность изобретения состоит в том, что лечение и профилактику зависимости от опиатов осуществляют путем проведения серии повторных инъекций иммуногена, представляющего собой поликлональные антиидиотипические (вторичные) антитела к опиатам, а именно морфину и его производным, образованные в организме животных, не родственных человеку по иммуноглобулинам (например, кроликов, баранов, крупного рогатого скота, лошадей), в ответ на серию повторных инъекций первичных антител к опиатам, а именно морфину и его производным, при этом первичные антитела получают из сыворотки крови свиней, как серологически родственного человеку вида, после серии повторных инъекций смеси конъюгатов морфина и его производных с белком, ковалентно связанным с молекулой морфина через гидроксилы при атомах углерода в 6-ом и 3-ем положениях фенантренового кольца.

Иммуноген для лечения и профилактики зависимости от опиатов получают следующим образом.

В состав иммуногена входят поликлональные антиидиотипические (вторичные) антитела к опиатам, а именно морфину и его производным. Иммуноген может быть использован в смеси с известными усилителями иммунного ответа (адъювантами). В качестве адъювантов, допущенных для использования у животных, применяют коммерческие адъюванты Фрейнда (Sigma-Aldrich) - полный и неполный, представляющие собой водно-масляную эмульсию, содержащую и не содержащую микобактерии туберкулеза соответственно; биоразлагаемые полимеры [Kohn J., Niemi S.M., Albert E.C. et al. Single-step immunization using a controlled release, biodegradable polymer with sustained adjuvant activity. J. Immunol. Methods, 1986, 95, 31-38], липосомы [Patel G.B., Zhou H, KuoLee R, Chen W.J. Archaeosomes as adjuvants for combination vaccines. Liposome Res., 2004, 14, 191-202] и др. Адъюванты, разрешенные к применению у человека, могут включать, но не ограничиваться, окись алюминия [US 008,008,457 B2, 30.08.2011], различные соли алюминия, водно-масляные эмульсии, липосомы, бактериальные токсины [De Gregorio Е., Caproni Е, Ulmer JB. Vaccine adjuvants: mode of action. Vaccine adjuvants: mode of action. Front. Immunol., 2013, doi: 10.3389/fimmu. 2013.00214, PMID: 23914187 [PubMed], интерлейкин 12 [Portielje J.E., Kruit W.H., Eerenberg A.J., et al. Subcutaneous injection of interleukin 12 induces systemic inflammatory responses in humans: implications for the use of IL-12 as vaccine adjuvant. Cancer Immunol. Immunother, 2005, 54, 37-43] и др.

Количество белка в иммуногене может составлять 1-2 мг/кг массы тела. Количество адъюванта в смеси с иммуногеном может составлять 5-50 объемных процентов в зависимости от свойств применяемого адъюванта.

В состав иммуногена могут входить несущественные компоненты, такие как растворители, буферные растворы и консерванты. Предпочтительным растворителем в составе иммуногена является вода для инъекций. В случае нерастворимости в воде адъюванта иммуноген вводится в виде взвеси или эмульсии.

Все компоненты иммуногена должны быть стерильными, смешиваются в стерильных условиях, помещаются в стерильные флаконы или запаиваются в стерильные ампулы.

Три этапа получения иммуногена.

Этап 1. Синтез конъюгатов морфина и его производных с высокомолекулярным носителем, которым может быть, в частности, бычий сывороточный альбумин (БСА) или другие молекулы (столбнячный анатоксин, стафилококковый анатоксин и др.).

Для получения таких конъюгатов молекула морфина должна быть предварительно активирована введением в состав молекулы различных реакционных групп. Известно, что предпочтительными участками для химической модификации молекулы морфина являются фенольный гидроксил при атоме углерода в положении 3 фенантренового кольца в структурной формуле морфина и спиртовый гидроксил при атоме углерода в положении 6 [Anton В., Salazar A, Flores A, et al. Vaccines against morphine/heroin and its use as effective medication for preventing relapse to opiate addictive behaviors. Hum. Vaccin., 2009, 5, 214-229]. Антигены, образованные в результате химического сшивания модифицированных молекул морфина по гидроксилам при атомах углерода в 6-ом и 3-ем положении с молекулой белка-носителя, вызывают при активной иммунизации появление антител, которые будут в одинаковой степени узнавать морфин, героин, кодеин и продукты их метаболизма в результате ферментативного соединения в организме человека с глюкуроновой кислотой (морфин-3- и морфин-6-глюкурониды, также обладающие агонистической активностью по отношению к опиоидным рецепторам). При этом образуемые антитела не будут обладать специфичностью по отношению к конкурентным антагонистам опиоидных рецепторов (налоксону и налтрексону).

Нами использованы известные методики получения 3-O-карбоксиметильного (3-КММ) и 6-гемисукцинильного (6-ГСМ) производных морфина, а также конъюгатов этих производных морфина с бычьим сывороточным альбумином - БСА [Spector S., Parker C.W. Morphine: radioimmunoassay. Science, 1970, 168, 1347-1348; Wainer B.H., Fitch F.W., Rothberg R.M., Fried J. Morphine-3-succinyl-bovine serum albumin: an immunogenic hapten-proteih conjugate. Science, 1972, 176, 1143-1145; Wainer B.H., Fitch F.W., Rothberg R.M., Fried J. The structure of morphine monohemisuccinate. Science, 1972, 178, 647-648; Simon E.J., Dole W.P., Hiller J.M. Coupling of a new, active morphine derivative to sepharose for affinity chromatography. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1972, 69, 1835-1837; Wainer B.H., Fitch F.W., Fried J, Rothberg R.M. A measurement of the specificities of antibodies to moiphine-6-succinyl-BSA by competitive inhibition of 14 C-morphine binding. J. Immunol., 1973, 110, 667-673; Hill J.H., Wainer B.H., Fitch F.W., Rothberg R.M. Delayed clearance of morphine from the circulation of rabbits immunized with morphine-6-hemisuccinate bovine serum albumin. J. Immunol., 1975, 114, 1363-1368].

3-O-карбоксиметильное производное морфина получают реакцией морфина гидрохлорида с 2-кратным мольным избытком хлоруксусной кислоты в 3N растворе гидроксида натрия. Реакцию ведут при перемешивании и комнатной температуре в течение 1 часа. Затем доводят pH реакционной смеси до 6,0-7,0 постепенным добавлением концентрированной соляной кислоты. Выпавший осадок отфильтровывают на стеклянном фильтре и промывают хлороформом. 3-КММ очищают перекристаллизацией из абсолютного этанола. При этом немодифицированный морфин остается в растворе, а 3-КММ выпадает в осадок. Продукт мигрирует при тонкослойной хроматографии на силикагеле в системе метанол : ледяная уксусная кислота (1:1) с Rf=0,4.

Сшивание производных морфина с белком (бычьим сывороточным альбумином или другим) проводят с помощью бифункционального реагента 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида гидрохлорида (EDC), реагирующего со свободными карбоксильными группами в эфирных производных 3-КММ и 6-ГСМ и с ε-аминогруппами остатков лизина в боковых цепях БСА, по известной методике [Spector S., Parker C.W. Morphine: radioimmunoassay. Science, 1970, 168, 1347-1348].

Модификацию БСА 3-O-карбоксиметилморфином проводят по следующей методике. К 100 мг БСА в 2,0 мл дистиллированной воды прибавляют при перемешивании 35 мг 3-O-КММ и 25 мг EDC. Перемешивают 24 часа при 20°C, затем диализуют против дистиллированной воды (2 смены по 2 л, затем в 2 л 0,01М калий-фосфатного буфера, pH 7,4). Полученный конъюгат лиофилизируют и хранят при +4°C или хранят в замороженном состоянии при -20°C.

Степень модификации БСА рассчитывают по разнице свободных аминогрупп в исходном белке БСА и в синтезированном конъюгированном препарате 3-O-КММ-БСА с использованием метода определения свободных аминогрупп в белковых препаратах с помощью 2,4,6-тринитробензолсульфокислоты (ТНБС) в соответствии с известной методикой [Goldfarb A.R. Reactivity of amino groups in proteins. Biochim. Biophys. Acta, 1970, 200, 1-3; Полевая О.Ю., Башарова Л.А., Шайдров B.B., Ковалев И.Е. Ковалентное связывание этаперизина с белком для получения антител, нейтрализующих физиологическое действие этаперазина. Хим.-фарм. ж., 1976, №9, 15-19]. Известно, что ТНБС реагирует только со свободными аминогруппами лизина в молекуле БСА с образованием тринитробензолсульфопроизводного лизина, все свободные остатки лизина в котором замещены. Молярное поглощение (экстинкция) такого соединения при 345 нм составляет 1,15·10⁴. Количество свободных аминогрупп в немодифицированной молекуле БСА или в молекуле БСА, модифицированной каким-либо гаптеном (в нашем случае производным морфина) рассчитывают по формуле:

где Eмол - молярное поглощение БСА или конъюгата производного морфина с БСА, обработанных ТНБС, при 345 нм [Полевая О.Ю., Башарова Л.А., Шайдров В.В., Ковалев И.Е. Ковалентное связывание этаперизина с белком для получения антител, нейтрализующих физиологическое действие этаперазина. Хим.-фарм. ж., 1976, №9, 15-19].

Этим способом вначале было определено, что в молекуле БСА присутствуют 60 свободных аминогрупп, поскольку молярная экстинкция немодифицированного БСА при 345 нм составляет 6,9·10⁵. Количество свободных аминогрупп в полученном конъюгированном препарате 3-O-КММ-БСА рассчитывают по той же формуле. В полученном нами конъюгированном препарате на 1 моль БСА приходится 9 молей 3-O-КММ. Таким образом, модификация белка составляет 15%.

6-гемисукцинильное производное морфина получают с помощью янтарного ангидрида. К 50 мг морфина гидрохлорида прибавляют 58 мг янтарного ангидрида в 2,5 мл пиридина, нагревают при 50°C в течение 8 час в колбочке с холодильником. Затем пиридин упаривают при 40°C в вакууме. Осадок промывают хлороформом на фильтре и сушат. При тонкослойной хроматографии на силикагеле в системе метанол : ледяная уксусная кислота (1:1) немодифицированный морфин остается на старте, тогда как М-6-ГС мигрирует с Rf 0,3. В полученном продукте обнаружены лишь следы немодифицированного морфина. Выход продукта не менее 95%.

Модификацию БСА полученным препаратом М-6-ГС проводят по следующей методике. К 50 мг БСА в 2,0 мл дистиллированной воды добавляют 15 мг М-6-ГС и 10 мг EDC, перемешивают на магнитной мешалке 15 час при комнатной температуре, затем проводят диализ в 0,01 М калий-фосфатном буфере с pH 7,4 (3×2 л). Полученный конъюгат лиофилизируют и хранят при +4°C или хранят при -20°C. Степень модификации белка в конъюгате, рассчитанная по методу реагирования свободных аминогрупп лизина с ТНБС, составила 7 молей М-6-ГС на 1 моль БСА, или 11,7%.

Этап 2. Получение первичных поликлональных антител к опиатам, а именно морфину и его производным.

Первичные поликлональные антитела к опиатам - морфину и его производным получают иммунизацией животных, родственных человеку по иммуноглобулинам, к примеру, свиней. Мы использовали для иммунизации мини-свинью Светлогорской породы, самку в возрасте 3 мес., весом 9 кг. Выбор нами этого вида обусловлен тем обстоятельством, что иммуноглобулины свиньи класса G (IgG) имеют большое сродство к IgG человека. По данным Клюкиной B.C. [Клюкина B.C. Промышленные технологии производства тест-систем для диагностики инфекционных болезней свиней. Дисс. докт. биол. наук, Щелково, 2002], перекрестная реактивность полученного автором конъюгата антител к IgG свиньи с пероксидазой хрена, с IgG человека колебалась в пределах 90-95%.

Первую инъекцию проводят внутривенно, вводя животным антиген, представляющий собой равную смесь конъюгированных препаратов 3-O-КММ-БСА и М-6-ГС-БСА, в дозе 1 мг/кг массы тела в 1 мл стерильного физиологического раствора в хвостовую вену. Вторую инъекцию делают через 7 дней внутримышечно в 2 точки задних конечностей в той же дозе в 2 мл физиологического раствора, предварительно смешанного с равным объемом полного адъюванта Фрейнда. Третью инъекцию делают через 14 дней после второй подкожно в 2 точки в области шейных лимфоузлов в той же дозе и в том же объеме физиологического раствора, предварительно смешанного с равным объемом неполного адъюванта Фрейнда. Реиммунизацию проводят через 3-6 мес. после последней инъекции в виде двух подкожных инъекций того же антигена в дозе 1 мг/кг массы тела в 2 мл физиологического раствора, смешанного с равными объемами полного (первая инъекция) или неполного (вторая инъекция) адъюванта Фрейнда в область шейных лимфоузлов с интервалом в 14 дней. Забор крови осуществляют из хвостовой вены на 9-е, 14-е, 21-е сутки.

Титры антител в полученных сыворотках определяют непрямым методом иммуноферментного анализа (ИФА) [Дзантиев Б.Б., Егоров A.M. Современное состояние и перспективы развития иммуноферментного анализа. Журн. Всесоюз. хим. о-ва им. Д. И. Менделеева, 1982. Т. 27, №4. С.442-449; Антитела. Методы. Книга 2 / под ред. Д. Кэтти. М.: «Мир», 1991. - 382 с.]. Для выявления титров первичных антител к морфиновой части конъюгированного антигена на твердой фазе полистирольного планшета (фирмы Nunc) сорбируют конъюгированный антиген 3-КММ или М-6-ГС с белком, отличным от БСА, к примеру, с лизоцимом. Такие конъюгированные антигены получают по методикам, описанным выше для БСА. Реакцию визуализируют, используя конъюгат антител к IgG свиньи с пероксидазой хрена (производства фирмы Sigma или собственного производства), и субстрат-хромогенную смесь (субстрат - перекись водорода, хромоген-ортофенилендиамин, Sigma). Для снижения неспецифического связывания и лучшего выявления специфических антител в буферный раствор для разведения сывороток и пероксидазного конъюгата добавляют 0,4% лошадиной сыворотки. После первого цикла иммунизации титры антител к морфину находились в диапазоне 2,4·10^-3-1,3·10^-4. После цикла реиммунизаций имеет место повышение титров до 2,6·10^-4-1,0·10^-5. За титр сыворотки принимают такое ее разведение, при котором величина оптической плотности в ИФА (за вычетом оптической плотности контроля пероксидазного конъюгата) превышает величину оптической плотности в контроле с соответствующим разведением нормальной свиной сыворотки (также за вычетом оптической плотности контроля пероксидазного конъюгата) в 2 раза.

Для последующей работы из сыворотки крови свиньи, содержащей первичные антитела к опиатам - морфину и его производным, выделяют иммуноглобулины класса G (IgG) методом ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-сефадексе А-50 по методу Клюкиной B.C. [Промышленные технологии производства тест-систем для диагностики инфекционных болезней свиней. Дисс. докт. биол. наук, Щелково, 2002]. На первом этапе выделяют суммарную фракцию иммуноглобулинов методом осаждения 20% водным раствором полиэтиленгликоля (ПЭГ)-6000. Для этого к 5 мл сыворотки медленно, при помешивании добавляют равный объем раствора ПЭГ-6000, встряхивают в течение 15 мин при комнатной температуре и центрифугируют полученную смесь при 1000 g в течение 20 мин. Преципитат растворяют в 2,5 мл 0,01 М калий-фосфатного буфера, pH 7,4, содержащего 0,1 М натрия хлорида, и диализуют против того же буфера при +4°C в течение 18-20 час. Затем 2 мл полученного раствора IgG с концентрацией 50 мг/мл наносят на колонку с ДЭАЭ-сефадексом A-50 (1,5×30 см), уравновешенную 0,02 М калий-фосфатным буфером, pH 7,0, и элюируют IgG тем же буфером. Скорость элюции составляет 75 мл/час, объем фракций - 3 мл. Отобранные фракции, содержащие IgG, объединяют и концентрируют в 3 раза с помощью концентраторов (Spin-X UF 6 Corning) и центрифугирования при 4000 g в течение 30 мин.

Оптическую плотность измеряют на спектрофотометре при длине волны 280 нм. Для спектрофотометрического определения концентрации IgG в полученном препарате используют коэффициент молярной экстинкции 1,2. Практический выход IgG составляет, как правило, 20%.

Этап 3. Получение антиидиотипических (вторичных) антител к опиатам, а именно морфину и его производным.

Антиидиотипические (вторичные) антитела к опиатам, а именно морфину и его производным, получают путем иммунизации кроликов первичными антителами к опиатам - морфину и его производным - в виде очищенной на ДЭАЭ-сефадексе фракции IgG свиньи. Для иммунизации используют кроликов пород Серый великан, или Советская Шиншилла, или Калифорнийская, или др. в возрасте 7-8 мес., весом 5-6 кг, предпочтительно самок. Первую инъекцию проводят внутривенно, вводя животным антиген в дозе 1 мг/кг массы тела в 1 мл стерильного физиологического раствора в краевую ушную вену. Вторую инъекцию проводят через 7 дней введением того же антигена в той же дозе подкожно в 8 точек спины вдоль хребта (по 0,25 мл в каждую точку). Антиген предварительно разводят в 0,01 М калий-фосфатном буфере (pH 7,4), смешанном с равным объемом полного адъюванта Фрейнда. Третью инъекцию проводят через 14 дней после второй инъекции введением антигена в той же дозировке, смешанного с неполным адъювантом Фрейнда, подкожно в 8 точек спины. Забор крови из краевой ушной вены осуществляют на 9-й, 14-й, 21-й день после последней инъекции. Через 3 мес. после последней инъекции кроликов реиммунизируют теми же антигенами в дозе 1 мг/кг массы тела, смешанными в равных объемах с полным (первая инъекция) и неполным (вторая инъекция) адъювантом Фрейнда с интервалом в 14 дней. Инъекции проводят подкожно в 8 точек спины. Забор крови осуществляют аналогично на 9-й, 14-й, 21-й день после последней инъекции.

Следует подчеркнуть, что в организме кролика, иммунизированного свиными первичными антителами к опиатам, а именно морфину и его производным, вырабатываются как первичные антитела к иммуноглобулинам G свиньи, так и вторичные (антиидиотипические) антитела к опиатам - морфину и его производным, являющиеся лишь пространственным иммуноглобулиновым образом исходного антигена (а не субстанцией морфина). Титр полученных антител определяют непрямым методом ИФА. При этом в лунках полистирольного планшета сначала сорбируют антиген, использованный для иммунизации кролика (первичные антитела к опиатам - морфину и его производным, продуцированные свиньей), затем - полученную сыворотку иммунизированного кролика в раститровке. Реакцию визуализируют добавлением конъюгата антител к IgG кролика с пероксидазой хрена (производства фирмы Sigma или собственного) и описанной выше субстрат-хромогенной смеси. Для снижения неспецифического связывания и лучшего выявления специфических антител в буферный раствор для разведения сывороток и пероксидазного конъюгата добавляют 0,4% лошадиной сыворотки. Полученные титры варьировались от 2,4·10^-4 до 1·10^-5.

Подтверждением того, что полученные поликлональные антиидиотипические (вторичные) антитела содержат в себе клон, являющийся пространственным иммуноглобулиновым образом морфина, служит постановка непрямого ингибиторного ИФА, где связывание постоянной концентрации антиидиотипических (вторичных) антител кролика с антигеном, сорбированным на твердой фазе (первичные антитела), тормозится дозозависимым образом добавлением различных концентраций субстанции морфина в виде морфина гидрохлорида (от 10^-3 М до 10^-10 М). В контрольные лунки добавляют сыворотку нормального (не иммунизированного) кролика. При этом на ингибиторной кривой можно было выделить 2 пика торможения связывания морфином: больший пик (24,8%-21,6% торможения) в области концентраций ингибитора 10^-6-10^-7 М и меньший пик (10,3%) в области концентраций ингибитора 10^-10 М.

Из сывороток крови кроликов, содержащих вторичные антитела к опиатам, а именно морфину и его производным, выделяют иммуноглобулины класса G (IgG) методом ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-сефадексе А-50 известным способом [Иммунологические методы / под ред. X. Фримеля, Изд-во «Мир», Москва, 1979, стр.267] с небольшой модификацией. На первом этапе к 6 мл сыворотки добавляют равный объем 20% водного раствора полиэтиленгликоля (ПЭГ) с мол. массой 6000 при помешивании в течение 15 мин при комнатной температуре, затем центрифугируют при 1000 g 20 мин. Преципитат растворяют в 3 мл 0,01 М калий-фосфатного буфера (pH 7,4), содержащего 0,1М натрия хлорида, и диализуют против того же буфера при +4°C в течение 18-20 час. Колонку с ДЭАЭ-сефадексом А-50 (1,5×30 см) уравновешивают стартовым калий-фосфатным буфером, pH 7,2. На колонку наносят 4 мл IgG после диализа с концентрацией 30 мг/мл. Первую фракцию IgG элюируют тем же буфером. Вторую фракцию элюируют градиентом 0,01-0,2М калий-фосфатного буфера (pH 8). Скорость элюции составляет 75 мл/час, объем фракций - 3 мл. Оптическую плотность фракций измеряют на спектрофотометре при длине волны 280 нм. Для определения концентрации полученного препарата IgG используют коэффициент молярной экстинкции ε=1,2. Отобранные фракции, содержащие оба пика IgG, объединяют и концентрируют в 3 раза с помощью концентраторов (Spin-X UF 6 Corning) и центрифугирования при 4000 g в течение 30 мин. Практический выход IgG составляет, как правило, 60%.

Иммуноген может быть изготовлен в виде различных дозированных форм, хорошо известных из уровня техники. Примеры таких форм включают растворы для инъекций, накожные аппликации и аэрозоли.

Иммуноген применяют следующим образом. Взвесь или суспензию, содержащую поликлональные антиидиотипические (вторичные) антитела к опиатам, а именно морфину и его производным и усилитель иммунного ответа, например окись алюминия, вводят подкожно, внутримышечно или интраназально. Инъекции иммуногена можно проводить через 1-2 недели, курс может включать 3-6 инъекций.

Изобретение может быть продемонстрировано следующими примерами.

Пример 1.

Купирование проявлений зависимости от опиатов иммунизацией крыс линии Wistar иммуногеном - поликлональными антиидиотипическими антителами кролика к опиатам, а именно морфину и его производным - лечение

Эксперименты проведены на 40 крысах линии Wistar, вес 200 г, самцы. Крысы были произвольно разбиты на 4 группы по 10 животных в каждой. Крысы содержались в индивидуальных клетках со свободным доступом к стандартному сухому лабораторному корму и воде в двух поилках, при естественном освещении.

Оценку лечебного эффекта специфической иммунизации проводили двумя способами: 1) путем исследования предпочтения наркотика зависимыми от опиатов животными в тесте свободного выбора, что можно рассматривать как эквивалент влечения наркомана к наркотику, и 2) путем исследования выраженности зависимости по тяжести опийного абстинентного синдрома.

1. Влияние специфической иммунизации на предпочтение раствора морфина в условиях свободного выбора (влечение)

Первоначально крысы первых трех групп были наркотизированы морфином в форме морфина гидрохлорида, который вводили внутрибрюшинно в течение 7 дней два раза в сутки в возрастающих дозах от 5 до 50 мг/кг на одну инъекцию в стерильном физиологическом растворе. Утром 8-го дня крысы получали одну инъекцию морфина в дозе 60 мг/кг. Крысы группы 4 служили контролем (вместо морфина они получали инъекции физиологического раствора). Через 2 часа после последней утренней инъекции всем крысам поочередно вводили внутрибрюшинно раствор налоксона гидрохлорида в дозе 1 мг/кг, вызывая тем самым быстрое развитие абстинентного синдрома у наркотизированных крыс, сразу после чего животных помещали в автоматизированную установку «Открытое поле» (фирма Laboras, Нидерланды). Наблюдение вели в течение 15 мин. Учитывали такие показатели, как горизонтальная и вертикальная двигательная активность, общее время неподвижности, груминг (реакция чистки), диарея, отряхивания «мокрой собаки», встряхивание передними лапами и головой, птоз, скрежет зубами или жевание. По специфическим признакам высчитывали суммарный балл опийного абстинентного синдрома в небольшой модификации [Судаков С.К., Борисова Е.В., Русаков Д.Ю. Метод количественной оценки синдрома отмены у морфин-зависимых крыс. Эксперим. и клинич. фармакол., 1994, т.57, №2, с.60]. Результаты оценки тяжести абстинентного синдрома в трех группах морфинизированных крыс в сравнении с контрольной группой 4 представлены на фиг.1.

Как видно из представленных данных, крысы первых трех групп характеризуются наличием у них признаков опийной зависимости, о чем свидетельствует статистически значимое повышение по сравнению с контрольной (неморфинизированной) группой суммарного балла абстиненции, а также значимое снижение двигательной активности, как горизонтальной, так и вертикальной. Снижение двигательной активности соответствует статистически значимому повышению общей длительности неподвижного состояния, а также снижению пройденного расстояния. Следует отметить, что по критерию Ньюмена-Кейлса все три накротизированные группы (1, 2 и 3) по исследованным параметрам между собой значимо не различаются.

После тестирования крыс всех групп переводят на свободный выбор между раствором 2,5% сахарозы в воде и раствором морфина гидрохлорида в 2,5% растворе сахарозы для исследования предпочтения. Регистрируют потребление каждого раствора и рассчитывают коэффициент предпочтения как отношение объема выпитого раствора морфина гидрохлорида к общему объему выпитой жидкости.

Одновременно начинают введение животным иммуногена (активная иммунизация).

Группа 1 (опытная) получает инъекцию иммуногена (антиидиотипические антитела к опиатам - морфину и его производным - кролика). В первой инъекции крысы этой группы получают раствор очищенных иммуноглобулинов кролика, иммунизированного первичными антителами к опиатам, а именно морфину и его производным, продуцированным свиньей, в дозе 2 мг/кг (0,4 мг на крысу по белку) в 4 точки спины вдоль хребта подкожно. Антитела растворяют в 0,5 мл стерильного физиологического раствора и смешивают с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ) в объемном соотношении 1:1.

Группа 2 (группа сравнения) получает инъекцию нормального кроличьего иммуноглобулина в такой же дозе по белку и в таком же адъюванте в аналогичные точки, как и группа 1.

Группа 3 (наркотизированный контроль) получает инъекцию того же объема адъюванта (ПАФ), смешанного с физиологическим раствором в объемном соотношении 1:1 в те же точки.

Группа 4 (контрольная) получает инъекцию физиологического раствора в том же объеме в те же точки.

Вторую инъекцию делают через 14 дней после первой. Крысы группы 1 получают внутрибрюшинно инъекцию иммуногена в дозе 5 мг/кг (1 мг на крысу) в стерильном физиологическом растворе без адъюванта. Крысы группы 2 получают такую же дозу нормального иммуноглобулина G кролика, крысы группы 3 и группы 4 получают внутрибрюшинно инъекцию только физиологического раствора.

Третью инъекцию делают через 7 дней после второй также внутрибрюшинно. При этом крысы группы 1 получают иммуноген в дозе 10,0 мг/кг (2 мг на крысу), крысы группы 2 получают инъекцию нормального кроличьего иммуноглобулина G в той же концентрации. Крысы групп 3 и 4 получают внутрибрюшинно инъекцию физиологического раствора.

Иммунизацию крыс проводят на фоне свободного выбора между двумя поилками с растворами сахарозы и морфина в сахарозе с целью оценки предпочтения по коэффициенту предпочтения.

Результаты анализа динамики предпочтения представлены на фиг.2. Предпочтение оценивают, начиная с 8-го дня пребывания в условиях свободного выбора и заканчивают на 23-й день. За это время крысы получают 3 инъекции иммуногена, причем окончательное тестирование проводят на 7-й день после 3-ей (последней) инъекции иммуногена. Как видно из представленных данных, только в группе 1, получавшей инъекции иммуногена (антиидиотипические - вторичные - антитела кролика к опиатам, а именно морфину и его производным, отмечено снижение коэффициента предпочтения раствора морфина в свободном выборе в среднем на 42% в отличие от всех других групп сравнения, где отмечено даже повышение предпочтения.

Таким образом, снижение предпочтения опиата - морфина в тесте свободного выбора, являющееся экспериментальным аналогом снижения влечения к наркотику у зависимых лиц, свидетельствует о достижении положительного эффекта лечения зависимости от опиатов - морфина и его производных, в частности, таких как героин и кодеин, данным иммуногеном.

Возможность расширения эффективности предлагаемого нами иммуногена для лечения зависимости не только от опиата-морфина, но также и от других опиатов, в частности, от героина и кодеина, которые являются производными морфина по гидроксильным остаткам при 3-ем и/или 6-ом атомах углерода в фенантреновом кольце молекулы морфина, обусловлена тем обстоятельством, что предлагаемый нами иммуноген является антиидиотипическими (вторичными) антителами к исходным антигенам - производным морфина, в которых белковая часть конъюгата присоединена к молекуле морфина, модифицированной по гидроксилам при 3-ем и 6-ом атомах углерода в структурной формуле морфина. А из данных литературы хорошо известно, что антигены, образованные в результате химического сшивания молекул морфина, модифицированных по гидроксилам при атомах углерода в 3-ем и 6-ом положении, с молекулой белка-носителя, вызывают при активной иммунизации появление антител, которые будут в одинаковой степени узнавать морфин, героин, кодеин и продукты их метаболизма в результате ферментативного соединения в организме человека с глюкуроновой кислотой (морфин-3- и морфин-6-глюкурониды, также обладающие агонистической активностью по отношению к опиоидным рецепторам) [Anton B., Salazar A, Flores A, et al. Vaccines against morphine/heroin and its use as effective medication for preventing relapse to opiate addictive behaviors. Hum. Vaccin., 2009, 5, 214-229; US 008,008,457 B2, 30.08.2011]. При этом, по данным тех же исследователей, образуемые антитела не обладают специфичностью по отношению к конкурентным антагонистам опиоидных рецепторов (налоксону и налтрексону).

2. Влияние специфической иммунизации на выраженность проявлений опийного абстинентного синдрома (выраженность зависимости)

Через 7 дней после последней инъекции иммуногена (на 23-й день от начала иммунизации и питья в двухпоилочном тесте) утром крысам поочередно ввели внутрибрюшинно раствор налоксона гидрохлорида в дозе 1 мг/кг, после чего животных сразу помещали в автоматизированную установку «Открытое поле» на 15 мин, как описано выше.

На фиг.3 представлены показатели двигательной активности животных во всех исследованных группах, а также суммарный балл абстиненции. Как видно из представленных данных, крысы в группе 1, иммунизированные специфическими антиидиотипическими антителами к опиатам, а именно морфину и его производным - иммуногеном, проявляют менее выраженные признаки абстинентного синдрома после нахождения в течение 23 дней в условиях свободного выбора между растворами сахарозы и морфина в сахарозе, чем крысы групп 2, 3 и 4, что свидетельствует о меньшей выраженности у них зависимости от морфина. Статистически значимые различия получены по суммарному баллу абстиненции, вертикальной активности и общей длительности неподвижности.

Для большей наглядности мы провели сравнение показателей каждой из четырех групп крыс после трех инъекций иммуногена и питья в свободном выборе с показателями, характеризующими выраженность абстинентного синдрома в объединенной группе морфинизированных крыс (1, 2 и 3) до начала иммунизации, а также с показателями, характеризующими отсутствие признаков абстинентного синдрома в контрольной группе 4 (фиг.4), где приведены также теоретические средние показатели между этими двумя полярными группами. Как видно из проведенных сравнений, крысы в группе 1, получавшие инъекции иммуногена, занимают по выраженности признаков абстинентного синдрома промежуточное положение между объединенной наркотизированной группой до иммунизации и контрольной (неморфинизированной) группой. Сдвиг в сторону величин, сближающих опытную группу 1 с контрольной неморфинизированной группой, особенно выявляется при оценке общего балла абстиненции, общей длительности неподвижного состояния и вертикальной активности.

Полученные результаты можно объяснить тем фактом, что у крыс в группе 1 зависимость от морфина была ниже вследствие снижения влечения к наркотику и потребления меньших количеств морфина в условиях свободного выбора.

Применение данного иммуногена не исключает возможности его использования при более длительных схемах иммунизации.

Определение титров специфических антител у крыс

В крови крыс, полученной после декапитации животных, определяли титры антител к иммуногену - поликлональным антиидиотипическим (вторичным) антителам кролика к опиатам, а именно морфину и его производным. Титры антител определяли непрямым методом ИФА (фиг.5). Реакцию визуализировали добавлением антител к иммуноглобулинам крысы, меченных пероксидазой хрена (Sigma), и описанной выше субстрат-хромогенной смеси. Для снижения неспецифического связывания и лучшего выявления специфических антител в буферный раствор для разведения сывороток и пероксидазного конъюгата добавляли 0,4% лошадиной сыворотки. Как и ожидалось, наибольшие титры выявлены в первой группе животных. Титр антител в группе 2 можно объяснить тем фактом, что обе группы животных были иммунизированы иммуноглобулинами G кролика. Процент гомологии при тестировании в непрямом ИФА сывороток крыс первых двух групп (сорбция на планшете специфических антиидиотипических антител к опиатам кролика) составил 36,1%) при разведении сывороток 1:1600 и 43,4%) при разведении сывороток 1:6400. В контрольных группах неиммунизированных крыс (группы 3 и 4) антител выявлено не было.

Поскольку в ответ на иммунизацию антиидиотипическими (вторичными) антителами к опиатам, а именно морфину и его производным, в организме крыс должны вырабатываться третичные антитела, по своей пространственной структуре напоминающие первичные антитела к опиатам, а именно морфину и его производным, мы провели также определение непрямым методом ИФА титров антител, способных связать морфин, конъюгированный с белком, отличным от белка, использованного при получении первичных антител. В качестве такого белка мы применили лизоцим. Для этого в лунках планшетов для ИФА был сорбирован антиген - конъюгат морфина с лизоцимом. Оказалось, что титры антител к морфину обнаружены только у крыс в группе 1. Средний геометрический титр составлял при этом 1:1425.

Реакция антител из сывороток крыс специфична к морфину и его производным, поскольку их перекрестных реакций в ИФА с налоксоном, сорбированным в лунках планшета в виде конъюгатов 3-O-карбоксиметильного и 6-гемисукцинильного производных налоксона с белком-лизоцимом, в тех же концентрациях не выявлено. Таким образом, предлагаемый нами иммуноген не препятствует лечению налоксоном и его производными в случае необходимости, что способствует повышению эффективности лечения зависимости от опиатов данным иммуногеном.

Результаты определения титров антител к морфину объясняют результаты поведенческих экспериментов на крысах. Положительный результат лечения в виде снижения опийной зависимости отмечено лишь у крыс группы 1, которая получала инъекции иммуногена, поскольку только у крыс в этой группе выработались в достаточном титре специфические антитела, способные связывать опиаты, в частности, морфин и его производные, такие как героин, кодеин, а также их метаболиты, что свидетельствует об эффективности применения данного иммуногена для лечения зависимости от опиатов.

Пример 2

Купирование проявлений зависимости от опиатов предварительной иммунизацией интактных крыс линии WAG иммуногеном - поликлональными антиидиотипическими (вторичными) антителами к опиатам, а именно морфину и его производным из сыворотки кролика - профилактика

Эксперименты проведены на 20 крысах линии WAG, вес 300 г, самцы. Крысы были произвольно разбиты на 2 группы по 10 животных в каждой. Животные содержались в клетках группами по 5 голов со свободным доступом к стандартному сухому лабораторному корму и воде, при естественном освещении.

Первоначально крысы группы 1 (опытная) получили серию инъекций иммуногена - поликлональных антиидиотипических (вторичных) антител к опиатам, а именно морфину и его производным. Крысы группы 2 служили контролем. Была применена следующая схема иммунизации:

1-ю иммунизацию делали подкожно в 4 точки спины вдоль хребта, Иммуноген вводили в дозе 1 мг/кг, т.е. по 0,3 мг на животное. Антитела растворяли в 0,5 мл стерильного физиологического раствора и смешивали с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ) в объемном соотношении 1:1. Крысы группы 2 получали инъекции только ПАФ, смешанного с физиологическим раствором в отношении 1:1, в те же точки и в тех же объемах.

2-ю иммунизацию проводили через 14 дней аналогичным образом в той же дозе, за одним исключением - иммуноген смешивали с неполным адъювантом Фрейнда (НАФ). Контрольной группе 2 вводили только НАФ, смешанный с физиологическим раствором.

3-ю иммунизацию проводили через 14 дней после 2-й внутрибрюшинно, иммуноген смешивали в равных объемах с НАФ. Контрольной группе крыс вводили НАФ, смешанный с физиологическим раствором в отношении 1:1.

На 12-й день после третьей иммунизации крыс обеих групп наркотизировали морфином в форме морфина гидрохлорида по описанной в первом примере схеме для выработки зависимости (в возрастающих дозах от 5 до 50 мг/кг на одну инъекцию внутрибрюшинно в течение 7 суток 2 раза в сутки). На 8-й день через 2 часа после последней утренней инъекции морфина в дозе 60 мг/кг всем крысам поочередно вводили внутрибрюшинно раствор налоксона гидрохлорида в дозе 1 мг/кг, вызывая тем самым быстрое развитие абстинентного синдрома, сразу после чего животных помещали в автоматизированную установку «Открытое поле» (фирма Laboras, Нидерланды). Наблюдение вели в течение 15 мин. Учет показателей проводили так, как было описано в примере 1.

Оценку профилактического эффекта инъекций иммуногена проводили путем исследования выраженности развившейся зависимости от опиатов, о которой судили по тяжести опийного абстинентного синдрома. Результаты оценки тяжести абстинентного синдрома в двух группах морфинизированных крыс представлены на фиг.6.

Как видно из представленных на фиг.6 данных, предварительная иммунизация крыс иммуногеном позволила смягчить проявления развившейся впоследствии зависимости (в результате принудительной морфинизации) по таким параметрам, как суммарный балл абстиненции, горизонтальная и вертикальная активность, пройденное расстояние, что свидетельствует о возможном применении иммуногена для профилактики развития зависимости.

После декапитации крыс было проведено определение уровня третичных антител к опиатам - морфину и его производным, способных связывать в кровяном русле опиаты, методом непрямого ИФА. Для этого в лунках полистирольных планшетов сорбировали антиген - морфин-лизоцим. Затем в лунки добавляли исследуемые сыворотки крыс обеих групп. Реакцию визуализировали добавлением конъюгата антител к IgG крысы с пероксидазой хрена (производства фирмы Sigma) и субстрат-хромогенной смеси. В буферный раствор для разведения сывороток и пероксидазного конъюгата добавляют 0,4% лошадиной сыворотки. Среднегеометрический титр антител к морфину в иммунизированной группе 1 оказался равным 1:1552. В контрольной (неиммунизированной группе) такие антитела отсутствовали, что свидетельствует об эффективности применения предлагаемого иммуногена для выработки антител, связывающих опиаты - морфин и его производные, в частности героин, кодеин, а также их метаболиты - в крови.

Таким образом, исследования показали эффективность данного иммуногена для лечения и профилактики зависимости от опиатов - морфина и его производных, таких как, в частности, героин и кодеин, в экспериментах на грызунах, а также перспективность его применения у лиц, употребляющих эти наркотики.

Возможность расширения эффективности предлагаемого нами иммуногена для лечения и профилактики зависимости не только от опиата-морфина, но также и от других опиатов, в частности, от героина и кодеина, которые являются производными морфина по гидроксильным остаткам при 3-ем и/или 6-ом атомах углерода в фенантреновом кольце молекулы морфина, обоснована нами выше.