Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИХ ПРОИЗВОДНЫХ КАТЕХОЛАМИНОВ И ИХ МЕТАБОЛИТОВ МЕТОДОМ ДЕРИВАТИЗАЦИИ

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для высокочувствительного и селективного определения маркеров различных заболеваний.

Проблема такого определения является актуальной задачей современного химического анализа. В настоящее время наиболее распространенными маркерами различных заболеваний являются физиологически активные вещества, такие как катехоламины (КА) (допамин (ДА), адреналин (АД)), и их основные метаболиты (гомованилиновая и ванилилминдальная кислоты (ГВК и ВМК, соответсвенно)). Возможность определения указанных соединений в биологических жидкостях и тканях человека на уровнях наномолярных концентраций и ниже (согласно исследованиям в смежных биохимическому анализу областях) позволяет диагностировать различные заболевания на самых ранних стадиях.

Значимой проблемой при определении следовых количеств КА и их метаболитов в реальных биообъектах возникает, когда в них присутствуют компоненты поглощающие в коротковолновой области спектра и создающие тем самым мешающие матричные эффекты. Для повышения не только чувствительности способа определения этих соединений (на уровне наномолярных концентраций), но и селективности, перспективен прием, заключающийся в переводе определения из коротковолновой в видимую область спектра (λ_ex 340-355 и λ_em 470-485 нм), где отсутствуют матричные эффекты биообъектов, путем дериватизации КА и их метаболитов органическими молекулами. Кроме того, получаемые соединения обладают значительно более интенсивной флуоресценцией, чем исходные определяемые соединения, что повышает не только селективность, но и чувствительность анализа.

Известен способ дериватизации КА и их метаболитов 0,1 М дифенилэтилендиамином (ДЭД) в присутствии ферроцианида калия, катализирующего окисление растворенным кислородом воздуха молекул КА до КА-o-хинонов, которые в свою очередь взаимодействуют с дериватизирующим реагентом (ДЭД) по реакции Михаэля (Н. Nohta, A. Mitsui, Y. Ohkura. High-performance liquid chromatographic determination of urinary catecholamines by direct pre-column fluorescence derivatization with 1,2-diphenylethylenediamine. J. Chromatogr. 380 (1986) 229-231.). Конечным продуктом дериватизации КА с ДЭД являются 2-фенил(4,5-дигидропирроло)[2,3-f]бензоксазольные производные, обладающие более интенсивной флуоресценцией, чем КА и их метаболиты в видимой области спектра. Процесс проходит в смеси буферного раствора и метанола: 0.3 М CAPS - КОН с рН 10: метанол как (30:70% об.). Окисление кислородом воздуха проходит в присутствии в качестве катализатора 20 мМ раствора ферроцианида K₃[Fe(CN)₆], при температуре T=50°C, в течение 20 мин.

Однако низкая технологичность указанного процесса обусловливается наличием токсичного растворителя 70% об. метанола, необходимостью термостатирования реакционной смеси при повышенной температуре 50°C, длительностью времени получения производных катехоламинов и их метаболитов необходимой интенсивности, которая составляет 100 отн. ед.

Известен принятый за прототип (К.В. Яблоцкий. Новые аспекты применения нативной и иммобилизованной пероксидазы хрена для определния ее ингибиторов и субстратов. Автореферат на соискание степени кандидата химических наук по специальности «Аналитическая химия» 02.00.02. Москва. 2010. 22 с.) способ дериватизации КА и их метаболитов 0,5 М бензиламином (БА) или дифенилэтилендиамином (ДЭД) в мицеллярной и водно-органической среде в присутствии пероксидазы из корней хрена, катализирующей окисление пероксидом водорода молекул КА до КА-o-хинонов, которые в свою очередь взаимодействуют с дериватизирующим реагентом, в качестве которого был использован бензиламин (БА) и дифенилэтилендиамин (ДЭД) по реакции Михаэля.

Процесс проходит в 5 мМ растворе ЦТМА в 0.1 М CAPS - KOH рН 11, (дериватизирующий агент - БА), или 0.5 М буферный раствор глицин - KOH, ДМСО (70:30 об.%, дериватизирующий агент - ДЭД), концентрация пероксида водорода - 1 мМ, t=30 мин (меньшее время дериватизации 5 мин удалось достигнуть только для адреналина), T=37°C.

Конечным продуктом дериватизации КА с БА или ДЭД являются 2-фенил(4,5-дигидропирроло)[2,3-f]бензоксазольные производные, обладающие в видимой области спектра более интенсивной флуоресценцией, чем сами КА и их метаболиты.

Однако и этот способ имеет те же недостатки, что и приведенный выше аналог: низкая технологичность указанного процесса обусловливается наличием токсичного растворителя 30% об. ДМСО, а также необходимостью термостатирования реакционной смеси при повышенной температуре 37°C.

Предлагаемое изобретение решает задачу повышения эффективности образования флуоресцирующих производных катехоламина при одновременном улучшении технологичности процесса.

Поставленная задача решается способом получения флуоресцирующих производных катехоламинов и их метаболитов методом дериватизации, включающим окисление исходных соединений и их обработку образующими конденсированные структуры аминами, в присутствии катализатора - пероксидазы из корней хрена. Новизна при этом заключается в том, что окисление исходных соединений, катализируемое пероксидазой хрена, проводят в присутствии 0,1 М CAPS-буферного раствора (pH 11) и 100 мкМ раствора пероксида водорода. Увеличение в 5 раз концентрации используемого буферного раствора и уменьшение в 10 раз концентрации пероксида водорода по сравнению с прототипом приводит к стабилизации биокатализатора - пероксидазы хрена и уменьшению денатурирующему действию на фермент окислителя - пероксида водородапроцесс проводят в водном растворе при комнатной температуре, то есть повышается эффективность пероксидазы в заявленном процессе дериватизации катехоламинов и их метаболитов посредством аминов, что позволяет получать флуоресцентные производные такой же интенсивности (100 отн. ед.), но комнатной температуре (без термостатирования) и в водной среде (в отсутствие органических растворителей и ПАВ, которые приводят к снижению износостойкости приборов и расходных материалов, к возникновению экологических проблем).

Наиболее интенсивный сигнал получают при проведении процесса в 0,1 М CAPS буферном растворе при концентрации пероксидазы хрена - 0,01-1 мкМ; концентрации пероксида водорода - 100 мкМ, концентрации дериватизирующего агента амина - 0,1-33 мМ; концентрации катехоламинов и метаболитов - 0,03-1 мкМ.

Наибольшую интенсивность флуоресцентного сигнала получают при использовании в качестве аминов бензиламина, дифенилэтилендиамина или o-фенилендиамина. Последний для дериватизации заявленных катехоламинов и метаболитов не применялся.

Технический результат предлагаемого изобретения при этом состоит не только в сокращении времени реакции с 30 до 5 мин, но и улучшении технологичности процесса из-за исключения длительного термостатирования реакционной смеси при повышенной температуре в присутствии токсичных растворителей (метанола, ДМСО).

Подбор окислительных систем путем варьирования природы биокатализатора и окислителя (пероксидаза хрена - пероксид водорода, грибная тирозиназа - кислород воздуха, лакказа - кислород воздуха) показал, что только выбранная авторами настоящего изобретения система в заявляемых условиях сочетает высокую технологичность процесса с высоким выходом по получаемым продуктам дериватизации.

Анализ известных технических решений позволяет сделать вывод о том, что предлагаемое изобретение не известно из уровня техники, что свидетельствует о его соответствии критерию "новизна".

Сущность настоящего изобретения для специалистов не следует явным образом из уровня техники, что позволяет сделать вывод о его соответствии критерию "изобретательский уровень".

Возможность проведения способа на традиционном оборудовании с достижением поставленной задачи свидетельствует о соответствии изобретения критерию "промышленная применимость".

На фиг. 1 представлены спектры поглощения АД (1), АД-o-хинона - продукта пероксидазного окисления АД (2) и 2-фенил-4,5-дигидропирроло-2-гидрокси-3-метил-бензоксадиазола - продукта дериватизации АД с БА (3), (сАД - 30 мкМ, время реакции 5 мин).

На фиг. 2 приведен масс-спектр продуктов дериватизации адреналина с БА в оптимальных условиях проведения реакции.

Приведенные примеры подтверждают, но не ограничивают заявляемое изобретение.

Пример 1. Способ получения 2-фенил-4,5-дигидропирроло-2-гидрокси-3-метил-бензоксазола, флуоресцирующего производного катехоламинов при ферментативной дериватизации АД с БА

В качестве производного катехоламинов был взят адреналин (АД), в качестве дериватизирующего агента бензиламин (БА).

Реакцию дериватизации АД с БА проводили по следующей методике: в стеклянную пробирку последовательно вводили 2,7 мл 0,1 М буферного раствора CAPS-KOH (рН 11,0), 0,100 мл 0,1 М раствора БА (33 мМ в системе), 0,100 мл 30 мкМ раствора пероксидазы (1 мкМ в системе), раствор АД (30-300 нМ в системе) и 0,100 мл 3 мМ раствора H₂O₂ (0,1 мМ в системе). Реакционную смесь тщательно перемешивали, переносили в кварцевую кювету и измеряли интенсивность флуоресценции методом флуориметрии. По истечении 5 мин от начала реакции (λ_ex=350 нм, λ_em=495 нм). Полученные данные свидетельствуют об увеличении интенсивности флуоресценции в примерно в 1.5 раза через одно и тоже время после начала реакции по сравнению со способами дериватизации катехоламинов и их метаболитов в присутствии неорганического катализатора.

Идентичность состава продуктов дериватизации катехоламинов на примере адреналина (АД) в заявляемых условиях и по способу прототипу (с использованием в качестве катализатора ферроцианида калия) контролировали методами спектрофотометрии(фиг. 1+ и жидкостной хроматомасс-спектрометрии.)

Из спектров поглощения видно, что в случае пероксидазного окисления адреналина, принадлежащего к классу катехоламинов, наблюдается максимум поглощения при 300 нм, соответствующий продуктам его окисления, молекулы которых содержат о-хиноидный фрагмент. В спектре поглощения продуктов дериватизации АД в присутствии ферроцианида калия имеется максимум при 350 нм, соответствующий длине волны возбуждения флуоресценции дериватизата АД. Полученные спектральные данные косвенно свидетельствуют об идентичности продуктов дериватизации АД, полученных в присутствии ПХ и ферроцианида калия.

Для более строго доказательства идентичности продуктов реакции дериватизации КА, полученных в присутствии ПХ и ферроцианида калия, изучили масс-спектры продуктов дериватизации адреналина с БА (фиг. 2). Полученные данные строго соответствуют литературным данным (Justin P. Pennington, Christian Schoneich, John F. Stobaugh. Selective Fluorogenic Derivatization with Isotopic Coding of Catechols and 2-Amino Phenols with Benzylamine: A Chemical Basis for the Relative Determination of 3-Hydroxy-tyrosine and 3-Nitro-tyrosine Peptides.Chromatographia November 2007, Volume 66, Issue 9-10, pp. 649-659, K.B. Яблоцкий. Новые аспекты применения нативной и иммобилизованной пероксидазы хрена для определния ее ингибиторов и субстратов. Автореферат на соискание степени кандидата химических наук по специальности «Аналитическая химия» 02.00.02. Москва. 2010. 22 с.).

На масс-спектре видно пики молекулярных ионов, подтверждающие идентичность конечных продуктов ферментативной и неферментативной (по способу-прототипу) дериватизации (последние описаны в литературе).

Пример 2. Способ получения 2-фенил-4,5-дигидропирроло-бензоксазола, флуоресцирующего производного катехоламинов на примере ферментативной дериватизации ДА с ДЭД.

В качестве производного катехоламинов был взят допамин (ДА), в качестве дериватизирующего агента - дифенилэтилендиамин (ДЭД).

Реакцию дериватизации ДА с ДЭД проводили по следующей методике: в стеклянную пробирку последовательно вводили 2,7 мл 0,5 М буферного раствора глицин-КОН (рН 8,0), 0,010 мл 0,1 М раствора ДЭД (33 мМ в системе), 0,100 мл 30 мкМ раствора пероксидазы (1 мкМ в системе), раствор ДА (30-300 нМ в системе) и 0,100 мл 3 мМ раствора H₂O₂ (100 мкМ в системе). Реакционную смесь тщательно перемешивали, переносили в кварцевую кювету и измеряли интенсивность флуоресценции по истечении 5 мин от начала реакции (λ_ex=350 нм, λ_em=495 нм).

Пример 3. Способ получения 2-фенил-бензоксадиол-6-уксусной кислоты, производной метаболитов катехоламинов, на примере ферментативной дериватизации ГВК с БА.

В качестве производного метаболитов катехоламинов была взята гомованилиновая кислота (ГВК), в качестве дериватизирующего агента бензиламин (БА).

Реакцию дериватизации ГВК с БА проводили по следующей методике: в стеклянную пробирку последовательно вводили 2,7 мл 0,1 М буферного раствора CAPS-КОН (рН 11,0), 0,100 мл 0,1 М раствора БА (33 мМ в системе), 0,100 мл 30 мкМ раствора пероксидазы (1 мкМ в системе), раствор ГВК (0,1-10 мкМ в системе) и 0,100 мл 3 мМ раствора H₂O₂ (100 мкМ в системе). Реакционную смесь тщательно перемешивали, переносили в кварцевую кювету и измеряли интенсивность флуоресценции по истечении 5 мин от начала реакции (λ_ex=350 нм, λ_em=430 нм).

Как видно из приведенных примеров, предлагаемое изобретение решает задачу получения флуоресцирующих производных катехоламинов и их метаболитов, а также получения более интенсивно флуоресцирующих производных за меньшее время при одновременном улучшении технологичности процесса за счет сокращения времени реакции (с 30 до 5 мин), отказа от нагревания и термостатирования, использования токсичных или агрессивных органических растворителей.