Результат интеллектуальной деятельности: РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ Escherichia coli, ОБЛАДАЮЩИЙ КОНСТИТУТИВНОЙ АСПАРТАЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ И СПОСОБ СИНТЕЗА L-АСПАРАГИНОВОЙ КИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭТОГО ШТАММА В КАЧЕСТВЕ БИОКАТАЛИЗАТОРА

Заявляемая группа изобретений относится к биотехнологии и касается рекомбинантного штамма E.coli с аспартазной активностью, а также способа синтеза L-аспарагиновой кислоты из фумарата аммония с использованием клеток этого штамма в качестве биокатализатора.

L-аспарагиновая кислота является широко востребованным органическим соединением, используемым, прежде всего, для синтеза искусственного подсластителя - аспартама, а также для изготовления лекарственных препаратов и кормовых добавок.

Основным способом получения L-аспарагиновой кислоты в настоящее время является биокаталитический синтез из фумаровой кислоты и аммония с помощью фермента аспартазы (аспартат-аммиак-лиазы).

Альтернативой этой технологии является химический синтез аспарагиновой кислоты из малеиновой кислоты и аммиака. Важнейшим недостатком химического способа является отсутствие стереоселективности и, как следствие, получение в результате синтеза смеси D и L-изомеров аспарагиновой кислоты, разделение которых является дорогостоящим процессом.

В качестве биокатализаторов L-аспарагиновой кислоты используются бактериальные штаммы разных видов, преимущественно бактерий E.coli, с аспартазной активностью в виде свободных или иммобилизованных клеток (1). Для повышения аспартазной активности штаммов используют широкий арсенал генетических методов, в том числе мутагенез (2) и клонирование гена аспартазы в составе плазмидных векторов (3). Однако во всех случаях для появления аспаратазной активности клетки выращивают в питательных средах с добавлением дорогостоящих индукторов синтеза аспаратазы.

Известен способ биокаталитического синтеза L-аспарагиновой кислоты с помощью биокатализатора - клеток мутантного штамма E.coli ВКПМ 7188, обладающих аспартазной активностью (2). Способ является недостаточно эффективным из-за невысокой аспартазной активности штамма. Кроме того, L-аспарагиновая кислота, получаемая с помощью этого способа, содержит до 5% яблочной кислоты - побочного продукта, снижающего качество аспарагиновой кислоты. Образование яблочной кислоты связано с присутствием в штамме фумаразной активности.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ получения L-аспарагиновой кислоты, в котором в качестве биокатализатора используют штамм E.coli PUaspE2 (3), содержащий ген аспаратазы в составе плазмидного вектора. Недостатком способа является сложность культивирования штамма, связанная с необходимостью вносить на определенной стадии роста дорогостоящий индуктор синтеза аспартазы изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид (ИПТГ).

Задача заявляемой группы изобретений - создание рекомбинантного штамма E.coli, синтезирующего аспартазу конститутивно, т.е. в отсутствие в среде индуктора, и разработка биокаталитического способа синтеза L-аспарагиновой кислоты с использованием клеток этого штамма в качестве биокатализатора.

Задача решена путем:

- конструирования рекомбинантного штамма бактерий Е.coli ВКПМ В-11864, обладающего конститутивной аспартазной активностью, полученного путем введения в штамм E.coli ВКПМ 7188 плазмиды, содержащей ген aspA под контролем промотора pEftu из Corynebacterium glutamicum АТСС13032;

- разработки способа синтеза L-аспарагиновой кислоты, с использованием в качестве биокатализатора заявляемого штамма бактерий Е.coli ВКПМ В-11864.

Заявляемый штамм Е.coli ВКПМ В-11864, содержащий плазмиду pAsp 161-3, с геном aspA, под контролем промотора pEftu из С.glutamicum АТСС13032, обладает конститутивной аспартазной активностью и способностью синтезировать L-аспарагиновую кислоту. При смешивании водных растворов фумаровой кислоты и биокатализатора на основе клеток Е.coli ВКПМ В-11864 происходит синтез L-аспарагиновой кислоты.

Характеристика заявляемого штамма

Штамм Е.coli ВКПМ В-11864 является производным штамма Е.coli ВКПМ В-7188 (2) и обладает следующими морфологическими и культуральными свойствами. Культура представлена грамотрицательными, факультативно анаэробными палочковидными подвижными клетками, со слегка закругленными концами, размером 0,4-0,8×1-3 мкм. Реакция Фогес-Проскауэра отрицательная, реакция с метиловым красным положительная. Культура отрицательна по признакам образования H₂S и гидролиза мочевины. Штамм оксидазоотрицательный, каталазоположительный. Клетки хорошо растут на простых богатых питательных средах, например МПА и LB (4). Оптимальная температура роста 37°C, оптимальный pН 7,2. Колонии на плотных питательных средах (МПА, LB) (4) беловатые блестящие, размером 2-3 мм, края ровные, спор не образует. Штамм Е.coli ВКПМ В-11864 дополнительно содержит маркер устойчивости к ампицилину.

Получение биомассы заявляемого штамма

Для получения биомассы клеток заявляемого штамма с аспартазной активностью штамм выращивают при 28-30°C в течение 12-15 часов на обычных для E.coli средах: полноценных (LB) либо синтетических, содержащих в качестве источника углерода глюкозу или ацетат в концентрациях 0.1-1%, а в качестве источника азота аммонийные, нитратные соли или дрожжевой экстракт в концентрациях 0.4-2%. Полученные клетки отделяют от культуральной жидкости центрифугированием при 3-4 тыс. об/мин, ресуспендируют в 10 мМ фосфатном буфере pН 7,0-8,0 до концентрации 20-40 г по сухой массе/л и хранят в таком виде при 4°C.

Аспартазную активность штамма определяют по скорости синтеза L-аспарагиновой кислоты следующим образом: к 1 мл 1 М раствора фумарата аммония прибавляют 0,5 мл этой клеточной суспензии, предварительно активированных микробных клеток и инкубируют смесь 10 минут при 37°C. Количество L-аспарагиновой кислоты в образцах определяют спектрофотометрическим методом при длине волны 510 нм. Активность клеток выражают в мкМ L-аспарагиновой кислоты, образующейся за 1 мин при 37°C.

Активирование микробных клеток перед получением L-аспарагиновой кислоты проводят инкубированием суспензии клеток в 1М растворе фумарата аммония при 37°C в течение 16-18 ч. Цель активирования - увеличение проницаемости клеточной мембраны для фумарата и аспартата.

Отличительная особенность заявляемого штамма, содержащего ген aspA в составе плазмиды под контролем промотора pEftu из С.glutamicum АТСС13032, состоит в его способности синтезировать фермент аспартазу конститутивно, в отсутствие в среде индуктора (табл.1).

При тех же условиях культивирования (среда LB) штамм E.coli PUaspE2 (ближайший аналог) обладает аспартазной активностью (17,5 мкМ аспарагиновой кислоты/мин мг клеток), сравнимой с активностью заявляемого штамма. Однако такой уровень активности штамма E.coli PUaspE2 наблюдают только при добавлении индуктора (ИПТГ) в среду культивирования (3).

Способ в общем виде

Заявляемый способ синтеза L-аспарагиновой кислоты осуществляют путем смешивания следующих водных растворов: фумарата аммония в концентрациях 1 М - 1,5 М (рН 8,0-8,5), содержащего 0,001М MgCl₂ и суспензии биокатализатора в концентрациях 0,4-4 мг/мл в термостатируемом реакторе с системой перемешивания и последующей инкубации при температуре 30-37°C в течение 1-6 часов. В качестве биокатализатора в заявляемом способе используют биомассу клеток штамма Е.coli ВКПМ В-11864 в нативном или иммобилизованном виде. Содержание целевого продукта - L-аспарагиновой кислоты - определяют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Изобретение включает следующую иллюстрацию.

Фиг 1. Структура плазмиды pAspl61-3.

Amp - ген устойчивости к ампицилину; Asp - ген aspA; Prom - промоторная область р Eftu из Corynebacterium glutamicum АТСС13032; Rep - репликон.

Пример 1. Конструирование плазмиды, содержащей ген аспартазы aspA под контролем промотора pEftu из Corynebacterium slutamicum АТСС13032

Гибридную плазмиду, содержащую ген аспартазы aspA под контролем промотора pEftu, получают путем встраивания фрагментов, содержащих ген aspA (1423 п.о. фрагмент) и промотор pEftu (239 п.о. фрагмент) в правильной ориентации по сайту Sma I в плазмиду pTZ19R, согласно общепринятым методикам (5). 1423 п.о. - фрагмент, содержащий ген aspA, получен с помощью ПЦР, при использовании в качестве матрицы геномной ДНК штамма Escherichia coli ВКПМ В-7188 и праймеров AN226 (tttccatggcaaacaacattcgtatcgaagaagatctgttgg), AN287 (gtggtggtgatggtgatggcctgctttgtaagccgggtgcatc), структура которых рассчитана на основе сиквенса U14003 (GeneBank). 239 п.о. - фрагмент, содержащий промотор pEftu, получен с помощью ПЦР, при использовании в качестве матрицы геномной ДНК штамма Corynebacterium glutamicum АТСС13032 и праймеров AN 253 (ggg teg acg ata tct ggc cgt tac cct gcg aat g) и AN269 (ctt cga tac gaa tgt tgt ttg аса ttg tat gtc etc ctg gac ttc), структура которых была рассчитана на основе сиквенса NC_006958(GeneBank).

Гибридную плазмиду правильной конструкции отбирают в клетках E.coli XL 1-Blue среди клонов, обладающих аспартазной активностью. Структуру плазмиды подтверждают секвенированием. Один из вариантов гибридной плазмиды, содержащий ген аспартазы aspA под контролем промотора pEftu, обозначен как pAsp 161-3.

Пример 2. Конструирование заявляемого штамма

Заявляемый штамм Escherichia coli ВКПМ В-11864 получен путем введения ДНК плазмиды pAsp 161-3, изолированной из клеток E.coli XL1-Blue (pAspl61-3), в клетки Е. coli ВКПМ В-7188 с помощью электропорации. Среди трансформантов, выросших на среде LB с ампициллином, обнаружен клон, проявляющий максимальную аспартазную активность при культивировании в пробирках на среде следующего состава (г/л воды деионизированной): Na₂HPO₄∗12H₂O - 15,0; KН₂РО₄ - 2,0; CH₃COONa - 7; Дрожжевой экстракт - 20; MgSO₄∗7H₂O - 0,25; фумарат натрия - 3, pH - 6,5-7,0 (далее среда МФС). Этот клон депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) как Escherichia coli ВКПМ В-11864.

Пример 3. Наработка биомассы заявляемого штамма

Наработку биомассы Е.coli ВКПМ В-11864 осуществляют в 750-мл колбах, содержащих 100 мл среды МФС, содержащей 100 мг/мл ампициллина, в которые вносят по 1 мл культуры, предварительно выращенной в пробирках на среде LB, содержащей 100 мг/мл ампициллина, в течение ночи при 37°C. Колбы культивируют 2 часа при 37°C, затем снижают температуру до 30°C и продолжают культивирование в течение 8 часов с постоянным перемешиванием. Затем биомассу штамма Е.coli ВКПМ В-11864 отделяют центрифугированием при 5 тыс. об/мин и хранят при +4°C. Аспартазная активность клеток E.coli ВКПМ 11864 составляет 31 мкм аспарагиновой кислоты/мин/ мг клеток по сухой массе.

Пример 4. Синтез L-аспарагиновой кислоты с использованием свободных клеток заявляемого штамма

Синтез L-аспарагиновой кислоты проводят в стеклянном реакторе объемом 100 мл путем смешивания субстрата - 1,5М раствора фумарата аммония (pH 8), содержащего 0,001М MgCl₂ и суспензии активированного биокатализатора в концентрации 0.4 мг/мл, полученного как указано в примере 3. Процесс проводят при 37°C в течение 4 час. Концентрацию L-аспарагиновой и яблочной кислот в реакционной смеси определяют с помощью ВЭЖХ. Концентрация L-аспарагиновой кислоты в полученном образце составляет 198 г/л, конверсия - 99%. Содержание яблочной кислоты составило 0,1%.

Пример 5. Синтез L-аспарагиновой кислоты с использованием иммобилизованных клеток заявляемого штамма

Биомассу клеток штамма E.coli ВКПМ В-11864 в количестве 7 г, полученную как в примере 3, суспензируют в 27,3 г раствора аспарагината натрия с концентрацией 20%, pH 7,5. Смесь охлаждают до 5°C и к охлажденной смеси добавляют последовательно 6,15 г акриламида, 0,36 г N,N′-метилен-бис-акриламида, 1,0 г 5% водного раствора N,N,N′,N′-тетраметилэтилендиамина и 0,2 г 5% водного раствора персульфата аммония. Полученный гель измельчают, промывают деионизованной водой, затем 1,5М раствором фумарата аммония (pH 8). Синтез L-аспарагиновой кислоты проводят в стеклянном реакторе объемом 200 мл путем смешивания субстрата - 1,5М раствора фумарата аммония (pH 8) с 0,001М MgCl₂ и 12,5 г гранул иммобилизованного биокатализатора. Процесс проводят при 37°C в течение 3 час. Концентрация L-аспарагиновой кислоты в полученном образце составляет 197 г/л, конверсия - 98,5%. Содержание яблочной кислоты составило 0,1%.

Таким образом, заявляемый штамм E.coli ВКПМ В-11864, по сравнению с ближайшим аналогом, обеспечивает более эффективное получение L-аспарагиновой кислоты за счет более высокой аспартазной активности этого биокатализатора и конститутивного синтеза аспартазы, что делает ненужным использование индуктора. Кроме того, заявляемый штамм обеспечивает снижение содержания в растворах L-аспарагиновой кислоты побочного продукта - яблочной кислоты.

Список источников информации

1. TOMOHIRO MIZOBATA AND YASUSHI KAWATA (2007) ASPARTASES: MOLECULAR STRUCTURE, BIOCHEMICAL FUNCTION AND BIOTECHNOLOGICAL APPLICATIONS In Industrial Enzymes (eds. J. Polaina and A.P. MacCabe) Springer, 549-565.

2. RU 2174558.

3. US 6,214,589.

4. Ф. Герхардт и др. Методы общей бактериологии в 3 т., Мир, 1984.

5. J. Sambrook, E.F. Fritsch, Т. Maniatis, Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Pr., 1989.