БИОСЕНСОР

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[001] Биосенсор представляет собой аналитическое устройство для обнаружения молекулы-мишени, например биомолекулы. Большинство биосенсоров являются оптическими биосенсорами. Оптический биосенсор может включать в себя металл, способный поглощать свет и создавать электронные волны на поверхности металла. Электронные волны могут возникать под определенным углом и с определенной длиной волны падающего света, поэтому они находятся в сильной зависимости от поверхности металла. При соединении биомолекулы с металлом может появляться поддающийся измерению сигнал.

[002] Некоторые биосенсоры являются электрохимическими биосенсорами. Электрохимический биосенсор обычно использует катализатор в качестве зонда. Однако область применения подобного электрохимического биосенсора ограничена ввиду слабости сигнала. Для точного обнаружения представляющих интерес молекул-мишеней необходимы новые биосенсоры с высоким соотношением сигнал-шум.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[003] На фиг. 1A показан иллюстративный вариант осуществления датчика для обнаружения биомолекулы.

[004] На фиг. 2 показана блок-схема иллюстративного варианта осуществления способа обнаружения биомолекулы.

[005] На фиг. 3A-3F показан иллюстративный вариант осуществления способа получения двух электродов в датчике для обнаружения биомолекулы.

[006] На фиг. 4А представлен график иллюстративного варианта осуществления, демонстрирующий токи, обнаруживаемые при различных концентрациях при разведении пробы пациента, инфицированного вирусом папилломы человека 16 (HPV16), и контрольной пробы.

[007] На фиг. 4В представлено изображение проводящей области электрода, в том числе моноклональное антитело анти-HPV HR, конъюгированное с бифенил-4-карбальдегидом, сканированное при помощи проводящей атомно-силовой микроскопии с приложенным смещенным напряжением (около 0,01 вольт).

[008] На фиг. 4С представлен график иллюстративного варианта осуществления, демонстрирующий токи, обнаруживаемые при различных концентрациях при разведении пробы пациента, инфицированного энтеровирусом 71 (EV71), и контрольной пробы.

[009] На фиг. 4D представлен график иллюстративного варианта осуществления, демонстрирующий токи, обнаруживаемые при различных концентрациях при разведении пробы пациента, инфицированного лейкоцитарным хемотаксическим фактором-2, и контрольной пробы.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0010] Некоторые варианты осуществления данного раскрытия сущности изобретения могут в целом относиться к датчикам для обнаружения мишени. Один пример датчика может включать в себя электрод, обработанный первой молекулой с электронной проводимостью, и зонд, конъюгированный со второй молекулой с электронной проводимостью. Зонд соединяют с первым электродом и конфигурируют для связывания с мишенью. Первая и вторая молекулы с электронной проводимостью могут различаться (быть различными).

[0011] Некоторые дополнительные варианты осуществления данного раскрытия сущности изобретения могут в целом относиться к способам обнаружения мишени. Один пример способа может включать в себя контактирование датчика, как описано выше, с пробой, предположительно содержащей мишень. При связывании мишени с зондом генерируется сигнал. Обнаружение сигнала свидетельствует о наличии мишени в пробе.

[0012] Дополнительные варианты осуществления данного раскрытия сущности изобретения могут в целом относиться к зонду, например антителу, конъюгированному с молекулой с электронной проводимостью. Подобная молекула антитела может быть использована в датчике, как описано здесь. Приводимое в качестве примера антитело конъюгируют с пиридиновым соединением, полиацетиленовым полимером, азоловым соединением, полианилиновым полимером или их производным соединением. Также обеспечивают электрод, содержащий зонд, конъюгированный с молекулой с электронной проводимостью, например антитело, конъюгированное с пиридиновым соединением, полиацетиленовым полимером, азоловым соединением, полианилиновым полимером или их производным соединением.

[0013] Вышеизложенная сущность изобретения приведена исключительно для наглядности и ни в коем случае не носит ограничительный характер. В дополнение к описанным выше иллюстративным аспектам, вариантам осуществления и характеристикам, исходя из чертежей и приведенного ниже подробного описания, становятся очевидными дополнительные аспекты, варианты осуществления и характеристики изобретения.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[0014] В нижеследующем подробном описании делается ссылка на прилагаемые чертежи, являющиеся частью настоящего раскрытия сущности изобретения. Приведенные на чертежах идентичные символы, как правило, обозначают идентичные элементы, если иное не вытекает из контекста. Иллюстративные варианты осуществления, изложенные в подробном описании, чертежи и пункты формулы изобретения не подразумевают каких-либо ограничений. Можно использовать прочие варианты осуществления и вносить прочие изменения, не отступая от существа или объема изобретения, предусмотренного настоящим раскрытием сущности. Имеется полное понимание того, что аспекты настоящего раскрытия сущности изобретения, в целом описанные в настоящем раскрытии сущности и проиллюстрированные фигурами, можно располагать, заменять, комбинировать и конфигурировать в самых различных вариантах, все из которых явно предусмотрены настоящим раскрытием сущности изобретения и являются его частью.

[0015] В настоящем раскрытии сущности изобретения термин «молекула с электронной проводимостью» в целом относится к соединению, проводящему электроны. Молекула с электронной проводимостью может обеспечить участок перекрывающихся p-орбиталей, которые позволяют делокализовать π-электроны по соседним выровненным p-орбиталям. Электрическую проводимость молекулы с электронной проводимостью можно исследовать при помощи проводящей атомно-силовой микроскопии. В некоторых вариантах осуществления электрическая проводимость молекулы с электронной проводимостью, используемой в чипе для биосенсора, как описано в настоящем раскрытии сущности, составляет приблизительно от 1 мкОм^-1 до 10 мкОм^-1 при приложенном напряжении около 0,01 вольт.

[0016] Термин «зонд» в целом относится к соединению, способному связываться с представляющей интерес мишенью (например, с биомолекулой). Например, связывание зонда с мишенью может осуществляться с аффинностью приблизительно от 100 до 500 пиконьютонов. Неограничивающие примеры зондов включают в себя антитела, фрагменты антител, которые сохраняют способность к связыванию с представляющей интерес мишенью, нуклеиновые кислоты (например, ДНК, РНК, аптамеры), аптамеры, антигены и ферменты.

[0017] Термин «мишень» в целом относится к любой молекуле, обнаруживаемой при помощи биосенсора, как описано здесь. Мишень может включать в себя, помимо прочего, биомолекулу. Примеры мишеней, обнаруживаемых в биосенсорах, описанных здесь, включают в себя, помимо прочего, биомолекулы (например, вирус, белки, нуклеиновые кислоты и углеводы), а также другие виды малых молекул, например липиды, гаптены и токсины.

[0018] Описанные здесь зонды могут содержать молекулу с электронной проводимостью. Поведение переноса электронов зонда может быть индуцировано перекрывающимися p-орбиталями, создаваемыми молекулой с электронной проводимостью. В результате, при связывании мишени с зондом изменение электрического поля, связанное со связыванием мишени и зонда, может усиливаться.

[0019] В некоторых вариантах осуществления сенсор для обнаружения биомолекулы включает в себя первый электрод, первый зонд и первую и вторую молекулы с электронной проводимостью. Первый зонд узнает представляющую интерес мишень в пробе и связывается с ней. В некоторых вариантах осуществления первая и вторая молекулы с электронной проводимостью отличаются друг от друга. Первый электрод обрабатывают первой молекулой с электронной проводимостью. Первая молекула с электронной проводимостью может образовать первую химическую связь с первым электродом. Первая химическая связь может быть ковалентной связью. В некоторых вариантах осуществления первый зонд может образовывать химическую связь с первым электродом, например ковалентную связь.

[0020] В некоторых вариантах осуществления первый зонд обрабатывают второй молекулой с электронной проводимостью. В некоторых вариантах осуществления вторую молекулу с электронной проводимостью конъюгируют с первым зондом, например ковалентно соединяют с первым зондом напрямую или через линкерную молекулу. В некоторых вариантах осуществления первый зонд может образовывать вторую химическую связь с первой молекулой с электронной проводимостью. Поэтому первый зонд может быть присоединен к первому электроду через первую химическую связь и вторую химическую связь и также может содержать присоединенную вторую молекулу с электронной проводимостью.

[0021] Первый зонд может образовывать с подлежащей обнаружению сенсором мишенью взаимосвязь «замок и ключ». Например, первым зондом может быть ДНК, РНК, белок, антитело, фрагмент антитела, аптамер, антиген или фермент. В некоторых вариантах осуществления первый зонд представляет собой антитело, а мишень представляет собой антиген, с которым антитело связывается. Когда первый образец, потенциально включающий в себя мишень, вводится в датчик и затем протекает через первый электрод, первое электрическое поле, связанное с первым электродом, изменяется в ответ на связывание мишени с первым зондом. Первый сигнал получают на основе изменения первого электрического поля. Датчик может содержать процессор, сконфигурированный для обнаружения первого сигнала. В некоторых вариантах осуществления обнаружение первого сигнала свидетельствует о наличии мишени в первой пробе. При обработке первого зонда второй молекулой с электронной проводимостью, например путем присоединения второй молекулы с электронной проводимостью к первому зонду, увеличивается проводимость первого зонда. Поэтому при связывании мишени с зондом изменение электрического поля, ассоциирующееся со связыванием, обнаруживается гораздо быстрее. В определенных вариантах осуществления датчик содержит первый канал потока, контактирующий с первым электродом, и через данный канал протекает первая проба, предположительно содержащая мишень, и в нем генерируется сигнал при связывании мишени с первым зондом.

[0022] В некоторых вариантах осуществления сенсор включает в себя второй электрод, содержащий третью молекулу с электронной проводимостью и второй зонд. Второй зонд конфигурируют таким образом, чтобы он не связывался с мишенью, подлежащей обнаружению сенсором. В некоторых вариантах осуществления аффинность связывания второго зонда с мишенью составляет менее 50 пиконьютонов. Вторая молекула с электронной проводимостью может быть одной и той же или отличаться от первой или второй молекулы с электронной проводимостью. В одном из вариантов осуществления третья молекула с электронной проводимостью идентична первой молекуле с электронной проводимостью.

[0023] В некоторых вариантах осуществления третья молекула с электронной проводимостью образует третью химическую связь со вторым электродом. Химическая связь может быть ковалентной связью. В некоторых вариантах осуществления второй зонд может образовывать химическую связь со вторым электродом. Химическая связь может быть ковалентной связью.

[0024] В некоторых вариантах осуществления второй зонд содержит четвертую молекулу с электронной проводимостью, которая может быть одной и той же или отличаться от первой или второй молекулы с электронной проводимостью, а также может быть одной и той же или отличаться от третьей молекулы с электронной проводимостью. В одном из вариантов осуществления третью молекулу с электронной проводимостью присоединяют, например посредством ковалентной связи, ко второму электроду через третью химическую связь, второй зонд присоединяют, например посредством ковалентной связи, к третьей распознающей молекуле через четвертую химическую связь. Четвертая молекула с электронной проводимостью может присоединяться, например посредством ковалентной связи, ко второму зонду. Например, второй зонд может быть присоединен к первому электроду через третью химическую связь и четвертую химическую связь, а также содержать присоединенную четвертую молекулу с электронной проводимостью.

[0025] Второй зонд может образовывать отношения по типу «замок и ключ» с отличной от мишени биомолекулой, подлежащей обнаружению сенсором. В некоторых неограничивающих вариантах осуществления вторым зондом может быть ДНК, РНК, белок, антитело, фрагмент антитела, аптамер, антиген или фермент. В некоторых вариантах осуществления второй зонд представляет собой антитело, распознающее антиген, отличный от подлежащей обнаружению мишени.

[0026] В некоторых вариантах осуществления сенсор содержит первый канал потока, контактирующий с первым электродом, и второй канал потока, контактирующий со вторым электродом. Сенсор может быть сконфигурирован таким образом, чтобы первая проба, предположительно содержащая представляющую интерес мишень, параллельно протекала по первому каналу потока и второму каналу потока, или же сенсор альтернативно может быть сконфигурирован таким образом, чтобы первая проба протекала через первый и второй каналы потока в разное время. Первый сигнал возникает в первом канале потока, как описано выше. Второе электрическое поле, связанное со вторым электродом, изменяется под влиянием первой пробы. Второй сигнал возникает на основе изменений второго электрического поля. Первый сигнал и второй сигнал могут быть обнаружены процессором и записаны для дальнейшей обработки.

[0027] В некоторых вариантах осуществления вторую пробу, по существу не содержащую представляющую интерес мишень, вводят в сенсор через первый электрод и второй электрод соответственно. Третий сигнал создается в первом канале потока под влиянием второго образца, протекающего через первый электрод. Четвертый сигнал создается во втором канале потока под влиянием второго образца, протекающего через второй электрод. На основе отношения первой разницы между первым сигналом и третьим сигналом ко второй разнице между вторым сигналом и четвертым сигналом сенсор определяет наличие мишени в первой пробе. В некоторых вариантах, представляющую интерес мишень обнаруживают путем сравнения отношения к предварительно установленному значению, причем, где отношение выше предварительно установленного значения, указывает на то, что представляющая интерес мишень присутствует в пробе.

[0028] В некоторых вариантах осуществления обеспечивают биосенсор, содержащий как минимум два электрода, где один электрод содержит по меньшей мере один зонд и одну молекулу с электронной проводимостью, а другой электрод содержит по меньшей мере один зонд и две молекулы с электронной проводимостью.

[0029] В одном из вариантов осуществления обеспечивают биосенсор, содержащий: (а) первый электрод, содержащий первый зонд, описанный в настоящем раскрытии сущности изобретения, а также первую молекулу с электронной проводимостью, как описано здесь, где первый зонд конфигурируют для связывания с представляющей интерес мишенью в пробе; и (b) второй электрод, содержащий вторую молекулу с электронной проводимостью и второй зонд, содержащий третью молекулу с электронной проводимостью, где зонд не связывается с представляющей интерес мишенью и где первая молекула с электронной проводимостью идентична или отличается от второй или третьей молекулы с электронной проводимостью. Такой биосенсор может быть применен в способе обнаружения представляющей интерес мишени, как описано здесь.

[0030] В некоторых вариантах осуществления первая, вторая, третья и/или дополнительная четвертая молекула с электронной проводимостью может быть ароматическим соединением, пиридиновым соединением, полиацетиленовым полимером, тиофеновым соединением, азоловым соединением, полианилиновым полимером или одним из их производных соединений. Некоторые образцы молекул с электронной проводимостью включают в себя, в том числе 3-(тиофен-2-ил)пропионовый альдегид, 3-фенилпропионовый альдегид, 3-(1-пиррол-2-ил)пропионовый альдегид, 3-(пиридин-2-ил)пропионовый альдегид, (Е)-4-фенилбут-3-энал, (Е)-4-(4-(Е)-стирилфенил)бут-3-энал, (Е)-4-(пиридин-2-ил)бут-3-энал, (Е)-4-(5-((Е)-2-(пиридин-2-ил)винил)пиридин-2-ил)бут-3-энал, (Е)-гепта-4,6-диенал, (Z)-гепта-4,6-диенал, (Е)-4-(циклогекс-2-энилиден)бутанал, 2-(нафталин-2-ил)ацетальдегид, 5″-формаль-5-карбоксил-2,2′,5′,2″-тритиофен, р-4′-формаль-4-карбоксил-1,1′-дибензол, 5′-(метил)тиол-5-формаль-2,2′-дитиолфен и один из их производных.

[0031] В некоторых вариантах осуществления раскрывают способ обнаружения мишени. Способ включает в себя контактирование какого-либо из вышеописанных сенсоров с первой пробой, предположительно содержащей мишень, и обнаружение первого сигнала при связывании мишени с первым зондом, как описано выше. В некоторых вариантах осуществления обнаружение первого сигнала свидетельствует о наличии мишени в первой пробе. Необязательно, обнаруживают второй, третий и четвертый сигналы, как описано выше, и первый, второй, третий и четвертый сигналы обрабатывают с целью определения наличия мишени в первой пробе.

[0032] В некоторых вариантах осуществления способ включает в себя обработку первого электрода первой молекулой с электронной проводимостью, конъюгирование первого зонда со второй молекулой с электронной проводимостью и присоединение первого зонда к первому электроду. Первый зонд конфигурируют для связывания с мишенью.

[0033] Способ может дополнительно включать в себя обработку второго электрода при помощи той же первой молекулы с электронной проводимостью и присоединение второго зонда ко второму электроду. Второй зонд конфигурируют таким образом, чтобы он не связывался с мишенью.

[0034] Способ может дополнительно включать в себя введение первой пробы, потенциально содержащей мишень, для параллельного протекания через первый электрод и второй электрод с целью получения первого сигнала и второго сигнала соответственно. Способ может дополнительно включать в себя введение второй пробы, практически не содержащей мишень, для параллельного протекания через первый электрод и второй электрод с целью получения третьего сигнала и четвертого сигнала. Способ может дополнительно включать в себя определение наличия мишени в первой пробе на основе количественного анализа первого, второго, третьего и четвертого сигналов, как описано выше.

[0035] Фиг. 1A представляет собой иллюстративный вариант сенсора 100 для обнаружения представляющей интерес мишени. Сенсор 100 включает в себя резервуар с буферным раствором 101, насос 103, разделитель 105, первую пробоотборную петлю 130, вторую пробоотборную петлю 140, биочип 120, резервуар для отходов 109 и процессор 108. Первую пробоотборную петлю 130 и вторую пробоотборную петлю 140 конфигурируют для хранения пробы, в том числе потенциальной мишени, подлежащей обнаружению сенсором. После включения сенсора насос 103 закачивает буферный раствор, хранящийся в резервуаре для буферного раствора 101, для промывки первой пробоотборной петли 130 и второй пробоотборной петли 140. Затем проба смешивается с буферным раствором и протекает через биочип 120 из первого канала 111 и второго канала 113. Биочип 120 включает комплект первого электрода 121 и комплект второго электрода 122. В конце концов, образец собирается в резервуар для отходов 109 после того, как он протекает через биочип 120.

[0036] Первый зонд может быть присоединен к комплекту первого электрода 121, и первый зонд конфигурируют для связывания с мишенью, подлежащей обнаружению сенсором 100. Второй зонд может быть присоединен к комплекту второго электрода 122, и второй зонд конфигурируют таким образом, чтобы зонд не связывался с мишенью, подлежащей обнаружению сенсором 100.

[0037] При протекании пробы через комплект первого электрода 121 и комплект второго электрода 122 электрические поля комплекта первого электрода 121 и комплекта второго электрода 122 могут меняться соответственно. Сигналы, отражающие изменения электрического поля комплекта первого электрода 121 и комплекта второго электрода 122, могут впоследствии отправляться процессору 108 посредством проводов 123 и 124 для дальнейшей обработки. Процессор 108 конфигурируют на определение наличия в пробе мишени, подлежащей обнаружению сенсором.

[0038] На фиг. 2 показана блок-схема иллюстративного варианта осуществления способа 200 для обнаружения биомолекулы. Способ 200 включает этапы 201, 203 и 205. На этапе 201 электрод обрабатывается первой молекулой с электронной проводимостью. Первая молекула с электронной проводимостью может образовывать ковалентную связь с электродом. Электрод может быть из металла, например золота, платины, меди и т.д. Некоторые примерные первые молекулы с электронной проводимостью включают, в том числе 3-(тиофен-2-ил)пропионовый альдегид, 3-фенилпропионовый альдегид, 3-(1-пиррол-2-ил)пропионовый альдегид, 3-(пиридин-2-ил)пропионовый альдегид, (Е)-4-фенилбут-3-энал, (Е)-4-(4-(Е)-стирилфенил)бут-3-энал, (Е)-4-(пиридин-2-ил)бут-3-энал, (Е)-4-(5-((Е)-2-(пиридин-2-ил)винил)пиридин-2-ил)бут-3-энал, (Е)-гепта-4,6-диенал, (Ζ)-гепта-4,6-диенал, (Е)-4-(циклогекс-2-энилиден)бутанал, 2-(нафталин-2-ил)ацетальдегид, 5″-формаль-5-карбоксил-2,2′,5′,2″-тритиофен, р-4′-формаль-4-карбоксил-1,1′-дибензол, 5′-(метил)тиол-5-формаль-2,2′-дитиолфен и одно из их производных.

[0039] На этапе 203 зонд конъюгируют со второй молекулой с электронной проводимостью. Зондом может быть ДНК, РНК, белок, антитело, антиген или фермент. Вторая молекула с электронной проводимостью может отличаться от первой молекулы с электронной проводимостью. Некоторые примеры вторых молекул с электронной проводимостью включают в себя, в том числе 3-(тиофен-2-ил)пропионовый альдегид, 3-фенилпропионовый альдегид, 3-(1-пиррол-2-ил)пропионовый альдегид, 3-(пиридин-2-ил)пропионовый альдегид, (Е)-4-фенилбут-3-энал, (Е)-4-(4-(Е)-стирилфенил)бут-3-энал, (Е)-4-(пиридин-2-ил)бут-3-энал, (Е)-4-(5-((Е)-2-(пиридин-2-ил)винил)пиридин-2-ил)бут-3-энал, (Е)-гепта-4,6-диенал, (Z)-гепта-4,6-диенал, (Е)-4-(циклогекс-2-энилиден)бутанал, 2-(нафталин-2-ил)ацетальдегид, 5″-формаль-5-карбоксил-2,2′,5′,2″-тритиофен, р-4′-формаль-4-карбоксил-1,1′-дибензол, 5′-(метил)тиол-5-формаль-2,2′-дитиолфен и одно из их производных.

[0040] На этапе 205 зонд присоединяют к электроду. Зонд может образовывать ковалентную связь с первой молекулой с электронной проводимостью. Зонд соединяется с электродом через ковалентную связь между зондом и первой молекулой с электронной проводимостью и через ковалентную связь между первой молекулой с электронной проводимостью и электродом.

[0041] На фиг. 3A-3F показан иллюстративный вариант осуществления способа получения двух электродов в сенсоре для обнаружения биомолекулы. На фиг. 3А первый золотой электрод 301 обрабатывают 5′-(метил)тиол-5-формаль-2,2′-дитиолфеном. 5′-(метил)тиол-5-формаль-2,2′-дитиолфен используют в качестве молекулы с электронной проводимостью и образует первую ковалентную связь с обрабатываемым первым золотым электродом 301′. Это обеспечивает электропроводность обрабатываемого первого золотого электрода 301′. В некоторых вариантах осуществления обрабатываемый первый золотой электрод 301′ располагают в первом канале сенсора.

[0042] На фиг. 3В второй золотой электрод 302 обрабатывают 5′-(метил)тиол-5-формаль-2,2′-дитиолфеном. 5′-(метил)тиол-5-формаль-2,2′-дитиолфен используют в качестве молекулы с электронной проводимостью и образует вторую ковалентную связь с обрабатываемым вторым золотым электродом 302′. Это обеспечивает электропроводность обрабатываемого второго золотого электрода 302′. В некоторых вариантах осуществления обрабатываемый второй золотой электрод 302′ располагают во втором канале сенсора.

[0043] На фиг. 3С антитело анти-HPV HR 303 обрабатывают дифенил-4-карбальдегидом, так что дифенил-4-карбальдегид соединяется с обрабатываемым антителом анти-HPV HR 303′. Дифенил-4-карбальдегид используют в качестве молекулы с электронной проводимостью. Это обеспечивает электропроводность обрабатываемого антитела анти-HPV HR 303′.

[0044] На фиг. 3D антитело против кофеина 304 обрабатывают дифенил-4-карбальдегидом, так что дифенил-4-карбальдегид соединяется с обрабатываемым антителом против кофеина 304′. Дифенил-4-карбальдегид используют в качестве молекулы с электронной проводимостью. Это обеспечивает электропроводность обрабатываемого антитела против кофеина 304′.

[0045] На фиг. 3Е обработанное антитело анти-HPV HR 303′ связывают с обработанным первым золотым электродом 301′. В некоторых вариантах осуществления аминогруппа обработанного антитела анти-HPV HR 303′ может образовывать третью ковалентную связь с 5′-(метил)тиол-5-формаль-2,2′-дитиолфеном. Обработанное антитело анти-HPV HR 303′ связывают с обработанным первым золотым электродом 301′ через первую и третью ковалентные связи.

[0046] На фиг. 3F обработанное антитело против кофеина 4′ связывают с обработанным вторым золотым электродом 302′. В некоторых вариантах осуществления аминогруппа обработанного антитела против кофеина 304′ может образовывать четвертую ковалентную связь с 5′-(метил)тиол-5-формаль-2,2′-дитиолфеном. Обработанное антитело против кофеина 304′ связывают с обработанным вторым золотым электродом 302′ через вторую и четвертую ковалентные связи.

[0047] [Пример 1] Бескорпусный чип сенсора, в том числе два комплекта золотых электродов, закрепляют в сенсоре Vsensor® V11A3 (производства компании «Vsense Biotech.Ltd», Тайбэй, Тайвань). В сенсоре первый канал потока пересекает комплект первого золотого электрода, а второй канал потока пересекает комплект второго золотого электрода. После включения сенсора насос сливает забуференный фосфатом физиологический раствор из резервуара для буферного раствора. Буфер PBS имеет значение pH 7,2 и протекает через чип сенсора со скоростью 20 мкл/мин. Затем молекулу с электронной проводимостью, 10 ммоль раствора 5′-(метил)тиол-5-формаль-2,2′-дитиолфена вводили в сенсор и промывали PBS-буфером. Затем раствор 5′-(метил)тиол-5-формаль-2,2′-дитиолфена и PBS-буфер протекает через комплект первого золотого электрода и комплект второго золотого электрода в течение 5 минут. И, наконец, комплект первого золотого электрода и комплект второго золотого электрода промывали PBS-буфером в течение еще 15 минут.

[0048] В PBS-буфере готовили раствор моноклонального антитела анти-HPV HR (200 мкг/мл) («Abcam», ab75574, Кембридж, Великобритания). К раствору антитела добавляли раствор дифенил-4-карбальдегида (10 ммоль), еще одной молекулы с электронной проводимостью («MerckSchuchardt OHG», 8.41238.0010, Гогенбрунн, Германия), в соотношении 50% этанола/50% воды. После тщательного перемешивания получали раствор конъюгированного моноклонального антитела анти-HPV HR.

[0049] В PBS-буфере (забуференном фосфатом физиологическом растворе) получали раствор моноклонального антитела против кофеина (200 мкг/мл) («Abcam», ab5221, Кембридж, Великобритания). К раствору антитела добавляли раствор дифенил-4-карбальдегида (10 ммоль), другой молекулы с электронной проводимостью (MerckSchuchardt OHG, 8.41238.0010, Гогенбрунн, Германия), в соотношении 50% этанола/50% воды. После тщательного перемешивания получали раствор конъюгированного моноклонального антитела против кофеина.

[0050] Затем в сенсор вводили (при инжекции) раствор связанного моноклонального антитела анти-HPV HR через первую пробоотборную петлю, который впоследствии протекает через комплект первого золотого электрода. Затем комплект первого золотого электрода промывали PBS-буфером в течение 10 минут. Скорость потока PBS-буфера составляет 20 мкл/мин. Затем комплект первого золотого электрода снова промывали PBS-буфером в течение еще 10 минут при поддержании скорости потока PBS-буфера 20 мкл/мин.

[0051] В сенсор вводили раствор конъюгированного моноклонального антитела против кофеина через вторую пробоотборную петлю, который впоследствии протекает через комплект второго золотого электрода. Затем комплект второго золотого электрода промывали PBS-буфером в течение 10 минут. Скорость потока PBS-буфера составляла 20 мкл/мин. Затем комплект второго золотого электрода снова промывали PBS-буфером в течение еще 10 минут при поддержании скорости потока PBS-буфера 20 мкл/мин.

[0052] Пробу, полученную от пациента, инфицированного вирусом папилломы человека 16 (HPV16), разбавляли до концентрации 0,1%, 1%, 2%, 5% и 10%. Разбавленные пробы последовательно вводили (при инжекции) в сенсор. Каждая разбавленная проба параллельно протекала через комплект первого золотого электрода и комплект второго золотого электрода.

[0053] Авторы изобретения неоднократно использовали один и тот же чип для изучения каждого из вариантов разведения пробы пациента. Это достигали путем вымывания связанного HPV16 кислым глициновым буфером (0,1 М, pH 2,5).

[0054] В качестве контрольной использовали пробу, полученную от здорового человека. Контрольную пробу также разбавляли до концентрации 0,1%, 1%, 2%, 5% и 10%. Разбавленные контрольные пробы последовательно вводили (при инжекции) в сенсор. Каждая разбавленная контрольная проба параллельно протекает через комплект первого золотого электрода и комплект второго золотого электрода. Авторы изобретения также использовали кислый глициновый буфер для промывки чипа между двумя операциями введения.

[0055] Токи, определяемые сенсором под действием каждой операции введения, показаны на фиг. 4А. Как видно из фиг. 4А, для проб пациента, инфицированного HPV16, были обнаружены относительно высокие токи при концентрации пробы пациента 1%, 2%, 5% и 10% соответственно. Для определения наличия антигена HPV16 в разбавленных пробах использовали отношение текущего значения (точка а - точка b)/(точка с - точка d).

[0056] На фиг. 4В показано изображение проводящей области электрода, включающего моноклональное антитело анти-HPV HR, связанное с бифенил-4-карбальдегидом, сканированное при помощи проводящей атомно-силовой микроскопии с приложенным смещенным напряжением (около 0,01 вольт). На изображении показан профиль электропроводности на поверхности электрода. Данные по оси X измеряются в мкм, данные по оси Y также измеряются в мкм. Более яркие участки означают относительно высокую электропроводность (например, около 99,98 наноампер). Более темные участки означают относительно низкую электропроводность (например, 0 наноампер).

[0057] [Пример 2] Бескорпусный чип сенсора, включающий два комплекта золотых электродов, закрепляется в сенсоре Vsensor® V11A3 (производства компании «Vsense Biotech.Ltd», Тайбей, Тайвань). В сенсоре первый канал потока пересекает комплект первого золотого электрода, а второй канал потока пересекает комплект второго золотого электрода. После включения сенсора насос сливает PBS-буфер из резервуара для буферного раствора. PBS-буфер имеет значение рН 7,2 и протекает через чип сенсора со скоростью 20 мкл/мин. Затем молекулу с электронной проводимостью, 10 ммоль раствора 5′-(метил)тиол-5-формаль-2,2′-дитиолфена вводят в сенсор и промывают PBS-буфер. Затем раствор 5′-(метил)тиол-5-формаль-2,2′-дитиолфена и PBS-буфера протекает через комплект первого золотого электрода и комплект второго золотого электрода в течение 5 минут. И, наконец, комплект первого золотого электрода и комплект второго золотого электрода промывают забуференным фосфатом физиологическим раствором в течение еще 15 минут.

[0058] В PBS-буфере готовят раствор моноклонального антитела анти-EV71 (200 мкг/мл) (компания «Millipore», 3321, Биллерика, Массачусетс, США). К раствору антитела добавляется раствор дифенил-4-карбальдегида (10 ммоль), еще одной молекулы с электронной проводимостью (компания «MerckSchuchardt OHG», 8.41238.0010, Гогенбрунн, Германия), в соотношении 50% этанола/50% воды. После тщательного перемешивания создается раствор связанного моноклонального антитела анти-EV71.

[0059] В PBS-буфере готовят раствор моноклонального антиакросомного белка (200 мкг/мл) (компания «Abcam», ab4569, Кембридж, Великобритания). Раствор дифенил-4-карбальдегида (10 ммоль), еще одна молекула с электронной проводимостью (компания «MerckSchuchardt OHG», 8.41238.0010, Гогенбрунн, Германия), в соотношении 50% этанола/50% воды добавляется к раствору антиакросомного белка. После тщательного перемешивания получают раствор связанного антиакросомного белка.

[0060] Затем в сенсор вводят раствор связанного моноклонального антитела анти-EV71 через первую пробоотборную петлю, который впоследствии протекает через комплект первого золотого электрода. Затем комплект первого золотого электрода промывают PBS-буфером в течение 10 минут. Скорость потока забуференного фосфатом физиологического раствора составляет 20 мкл/мин. Затем комплект первого золотого электрода снова промывают забуференным фосфатом физиологическим раствором в течение еще 10 минут при поддержании скорости потока забуференного фосфатом физиологического раствора 20 мкл/мин.

[0061] В сенсор вводят раствор конъюгированного антиакросомного белка через вторую пробоотборную петлю, который впоследствии протекает через комплект второго золотого электрода. Затем комплект второго золотого электрода промывают забуференным фосфатом физиологическим раствором в течение 10 минут. Скорость потока забуференного фосфатом физиологического раствора составляет 20 мкл/мин. Затем комплект второго золотого электрода снова промывают забуференным фосфатом физиологическим раствором в течение еще 10 минут при поддержании скорости потока забуференного фосфатом физиологического раствора 20 мкл/мин.

[0062] Пробу пациента, инфицированного EV71, разбавляли до концентрации 0,1%, 1%, 2%, 5% и 10%. Разбавленные образцы последовательно вводят в сенсор. Каждый разбавленный образец параллельно протекает через комплект первого золотого электрода и комплект второго золотого электрода.

[0063] Авторы изобретения неоднократно использовали один и тот же чип для изучения каждого из вариантов слабой концентрации пробы пациента. Это достигали путем вымывания связанного EV71 при помощи кислого глицинового буфера (0,1 М, pH 2,5).

[0064] В качестве контрольной используют пробу здорового человека. Контрольную пробу также разбавляют до концентрации 0,1%, 1%, 2%, 5% и 10%. Разбавленные контрольные пробы последовательно вводят в сенсор. Каждая разбавленная контрольная проба параллельно протекает через комплект первого золотого электрода и комплект второго золотого электрода. Авторы изобретения также использовали кислый глициновый буфер для промывки чипа между двумя операциями введения.

[0065] Токи, определяемые сенсором под действием каждой операции введения, показаны на фиг. 4С. Как видно из фиг. 4С, для проб пациента, инфицированного EV71, были обнаружены относительно высокие токи при концентрации пробы пациента 0,1%, 1%, 2%, 5% и 10% соответственно. Для определения наличия антигена EV71 в разбавленных образцах было использовано отношение текущего значения (точка а - точка b)/(точка с - точка d).

[0066] [Пример 3] Бескорпусный чип сенсора, включающий два комплекта золотых электродов, закрепляли в сенсоре Vsensor® V11A3 (производства компании «Vsense Biotech.Ltd», Тайбей, Тайвань). В сенсоре первый канал потока пересекает комплект первого золотого электрода, а второй канал потока пересекает комплект второго золотого электрода. После включения сенсора насос сливает забуференный фосфатом физиологический раствор из резервуара для буферного раствора. Забуференный фосфатом физиологический раствор обладает значением pH 7,2 и протекает через чип сенсора со скоростью 50 мкл/мин. Затем молекула с электронной проводимостью, 10 ммоль раствора р-4′формаль-4-карбоксил-1,1′-дибензола (СНО-(С₆Н₄)₂-СООН), вводили в сенсор через пробоотборную петлю и промывали забуференным фосфатом физиологическим раствором. Затем раствор р-4′формаль-4-карбоксил-1,1′-дибензола (СНО-(С₆Н₄)₂-СООН) и забуференного фосфатом физиологического раствора протекает через комплект первого золотого электрода и комплект второго золотого электрода в течение 18 минут. И, наконец, комплект первого золотого электрода и комплект второго золотого электрода промывали забуференным фосфатом физиологическим раствором в течение еще 15 минут. Затем смесь из 400 ммоль хлористого этилена и 100 ммоль нормальной человеческой сыворотки (объем хлористого этилена/объем нормальной человеческой сыворотки = 1/1) вводится и протекает через сенсорный чип в течение 15 минут со скоростью потока 20 мкл/мин.

[0067] В ацетатном буфере (pH 4,8) создавали раствор моноклонального антитела анти-Lect2 (200 мкг/мл) (компания «Santa Cruz», sc-99036, Санта-Круз, Калифорния, США). К раствору антитела добавляли раствор дифенил-4-карбальдегида (10 ммоль), еще одной молекулы с электронной проводимостью (компания «MerckSchuchardt OHG», 8.41238.0010, Гогенбрунн, Германия), в соотношении 50% этанола/50% воды. После тщательного перемешивания создавали раствор связанного моноклонального антитела анти-Lect2.

[0068] В забуференном фосфатом физиологическом растворе создавали раствор моноклонального антиакросомного белка (200 мкг/мл) (компания «Abcam», ab4569, Кембридж, Великобритания). Раствор дифенил-4-карбальдегида (10 ммоль) (компания «MerckSchuchardt OHG», 8.41238.0010, Гогенбрунн, Германия), в соотношении 50% этанола/50% воды добавляется к раствору антиакросомного белка. После тщательного перемешивания создавали раствор связанного антиакросомного белка.

[0069] Затем в сенсор вводили раствор конъюгированного моноклонального антитела анти-Lect2 через первую пробоотборную петлю, который впоследствии протекает через комплект первого золотого электрода. Затем комплект первого золотого электрода промывали забуференным фосфатом физиологическим раствором в течение 10 минут. Скорость потока забуференного фосфатом физиологического раствора составляла 20 мкл/мин. Затем комплект первого золотого электрода снова промывали забуференным фосфатом физиологическим раствором в течение еще 10 минут при поддержании скорости потока забуференного фосфатом физиологического раствора 20 мкл/мин.

[0070] В сенсор вводили раствор связанного антиакросомного белка через вторую пробоотборную петлю, который впоследствии протекает через комплект второго золотого электрода. Затем комплект второго золотого электрода промывали забуференным фосфатом физиологическим раствором в течение 10 минут. Скорость потока забуференного фосфатом физиологического раствора составляла 20 мкл/мин. Затем комплект второго золотого электрода снова промывали забуференным фосфатом физиологическим раствором в течение еще 10 минут при поддержании скорости потока забуференного фосфатом физиологического раствора 20 мкл/мин.

[0071] Пробу пациента со злокачественной гепатомой, содержащую биомаркер Lect2, разбавляли до концентрации 0,1%, 1%, 2%, 5% и 10%. Разбавленные пробы последовательно вводили в сенсор. Переключатель канала потока контролирует параллельное протекание каждой разбавленной пробы через комплект первого золотого электрода и комплект второго золотого электрода.

[0072] Авторы изобретения неоднократно использовали один и тот же чип для изучения каждого из вариантов слабой концентрации пробы пациента. Это достигается путем вымывания связанного Lect2 при помощи кислого глицинового буфера (0,1 М, pH 2,5).

[0073] В качестве контрольной используют пробу здорового человека. Контрольную пробу также разбавляют до концентрации 0,1%, 1%, 2%, 5% и 10%. Разбавленные контрольные пробы последовательно вводят в сенсор. Каждая разбавленная контрольная проба параллельно протекает через комплект первого золотого электрода и комплект второго золотого электрода. Авторы изобретения также использовали кислый глициновый буфер для промывки чипа между двумя операциями введения.

[0074] Токи, определяемые сенсором под действием каждой операции введения, показаны на фиг. 4D. Как видно из фиг. 4D, для проб пациента со злокачественной гепатомой, содержащих молекулы биомаркера Lect2, были обнаружены относительно высокие токи при концентрации пробы пациента 0,1%, 1%, 2%, 5% и 10% соответственно. Для определения наличия антигена HPV16 в разбавленных образцах было использовано отношение текущего значения (точка а - точка b)/(точка с - точка d).

[0075] Хотя вышеупомянутое изобретение описано достаточно подробно посредством иллюстраций и примеров в целях обеспечения понимания, специалистам в соответствующей области техники очевидно, что можно вносить определенные изменения, не отступая от сущности и объема настоящего изобретения. Поэтому описание не следует толковать как ограничение объема изобретения.

[0076] Все публикации, патенты и патентные заявки, упомянутые в настоящем раскрытии сущности изобретения, включены в него посредством ссылки во всей своей полноте во всех отношениях и в той же степени, как если бы по каждой отдельной публикации, патенту или патентной заявке отдельно указывалось, что она включается посредством ссылки.