ШТАММ БАКТЕРИЙ Serratia ficaria ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ РОСТА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ И ЗАЩИТЫ ОТ ФИТОПАТОГЕННЫХ ГРИБОВ

Изобретение относится к области сельскохозяйственной микробиологии, в частности к штамму Serratia ficaria TP (депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУПГосНИИГенетика, коллекционный номер ВКПМ В-11403), обладающему выраженными антагонистическими, фитостимулирующими и фунгицидными свойствами, который может быть использован для получения биопрепарата для стимуляции роста сельскохозяйственных растений и защиты от фитопатогенных грибов.

Известен штамм Trichoderma harzianum BKM F-2477 Д (см. патент РФ №2094991, 1997 г.), используемый для разработки средств защиты стеблей огурца и томата от фитопатогенов в условиях закрытого грунта.

Недостатками использования данного штамма является низкая степень защиты от заболеваний на стеблях растений в отдельных очагах из-за низкой плотности популяции антагониста на стеблях и не превышающей 20-45 шт./см². Поэтому наблюдается незначительное ингибирование развития патогенов (возбудителей аскохитоза, белой и серой гнилей) на стеблях растений, что вызывает их гибель.

Известен штамм Bacillus subtilis (см. патент РФ №2083109, 1997 г.), используемый для защиты от корневых гнилей зерновых, а также обработке плодов косточковых при хранении.

Недостатками использования данного штамма является недостаточная эффективность в отношении ряда возбудителей, вызываемых фитопатогенными микроорганизмами.

Известен штамм Agrobacterium radiobacter (см. патент РФ №2051586, 1996 г.), стимулирующий прорастание семян томата, а также их дальнейшее развитие.

Недостатками данного штамма является его способность легко приобретать вирулентные свойства и вызывать раковые заболевания двудолевых растений после переноса в его клетки онкогенной Ti-плазмиды из близкородственных вирулентных штаммов Agrobacterium tumefaciens.

Наиболее близким к предлагаемому штамму является штамм микроорганизмов Bacillus mycoides var. В.А. ВНИИСХМ №Д138 и Azotobacter vinelandii var. НП ВНИИСХМ №Д24 (Патент РФ №2302114, 2007 г.), используемый в качестве биологического средства борьбы с возбудителями болезней растений и стимуляции их роста, и может быть использовано в сельском хозяйстве.

Существенными недостатками известного способа культивирования является узкая область его антагонистического действия на патогенные микроорганизмы.

Техническая задача - выделение штамма с антагонистическими, фитостимулирующими и фунгицидными свойствами.

Технический результат - стимуляция роста и защита сельскохозяйственных растений от фитопатогенов с помощью предлагаемого штамма. Он достигается тем, что в качестве средства для стимуляции и защиты сельскохозяйственных растений предлагается штамм бактерий Serratia ficaria ВКПМ В-11403. Штамм был выделен при высеве на питательные среды (Мясопептонный агар (МПА), картофельный и томатный агары) и в последующем в чистую культуру методом последовательных пересевов по общепринятой методике (Практикум по микробиологии / Под ред. Н.С. Егорова. Учебное пособие. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1976. - 306 с.; Пономарева Т.С. Микроорганизмы ассоциированные с растениями сем. Пасленовых (на примере томата сорта «Королевский» / Естественные науки АГУ. - 2012).

Филогенетическое положение штамма проведено на основании секвенирования гена 16S рРНК в ФГУПГосНИИГенетика.

Штамм Serratia ficaria TP депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов 07.10.2013, коллекционный номер ВКПМ В-11403. Справка о депонировании штамма прилагается.

Штамм Serratia ficaria ВКПМ В-11403 характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

1. Культурально-морфологические признаки

Грамотрицательные палочки. Клетки - прямые или слегка изогнутые. Палочки располагаются одиночно. При росте на МПА штамм образует колонии круглой формы с волнистым краем, выпуклым профилем, блестящие, непрозрачные, слизистые, светло-белого цвета. На средах, богатых органикой (МПА, картофельно-минеральный агар Одоевского), колонии штамма могут окрашиваться в светло-желтый цвет. Палочки имеют длину 5,95 мкм, а ширину 0,85 мкм.

2 Физиолого-биохимические признаки

Штамм каталазоположительный, в качестве единственного источника углерода использует глюкозу, сахарозу, глицерин, незначительно лактозу и маннит. Способен разжижать желатин, гидролизовать казеин. Обладает лецитазной активностью. Способен образовывать нитриты при использовании нитратных форм азота.

Штамм способен к росту на картофельно-минеральном агаре Одоевского, МПА, РПБ, бобовом отваре, Чапека, средах Эшби и Бейеринка с различными источниками углевода и т.д.

Генетические особенности штамма: штамм не нуждается в факторах роста, стабилен и не является генетически модифицированным.

3. Условия культивирования

Для наращивания биомассы его культивируют при температуре 28°C на картофельном отваре.

4. Хранение штамма

Для хранения штамма используют метод периодических пересевов (3-4 раза в год) на МПА. Культивирование после пересева ведут при температуре 28°C в течение 3-4 дней, затем культуру хранят в холодильнике при температуре 4°C. Штамм хранится в коллекции лаборатории Агроэкологии кафедры «Гидробиология и общая экология», а также во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов. Для исследования использовалась суспензия Serratia ficaria TP с титром клеток 10⁹, обладающая наибольший фитостимулирующий активностью.

Применение штамма

Пример 1. Изучение фунгицидной активности штамма

Фунгицидная активность штамма изучена методом укола между бактериальным изолятом Serratia ficaria ВКПМ В-11403 и плесневыми грибами, выделенными с поверхности томата и взятыми (Alternaris sp., Penicillium restrictum и Penicillium citrinum) из коллекции НИЛ «Микробиологического мониторига» АГТУ (Fusarium graminiarum, Fusarium chlamydosporum, Gliocladium sp., Verticillium sp.).

В чашку Петри с засеянным газоном плесневых грибов делали уколами посев бактериального штамма. Каждый посев делали в четырех проворностях. Контролем служила дистиллированная вода.

В таблице 1 показан диаметр зоны ингибирования между исследованным изолятом Serratia ficaria ВКПМ В-11403 и плесневыми грибами.

Анализ полученных данных показал, что один и тот же изолят обладает разной фунгицидной активностью к фитопатогенам, так спектр зон ингибирования фитопатогенных микроорганизмов колеблется в пределах от 15 до 32 мм. Наименьшие показатели диаметра зоны ингибирования отмечены по отношению к наибольшим показателям диаметра зоны ингибирования Penicillium citrinum и составляют 15,1 мм, по отношению к Fusarium graminiarum составляют 16,3 мм, Fusarium chlamydosporum - 17,4 мм, Penicillium restrictum - 24,0 мм (при микрокопировании отмечен лизис мицелия и усиленное спороношение). Наибольшие показатели диаметра зоны ингибирования отмечены по отношению к ингибированию роста фитопатогенных грибов под влиянием изолята ТР3 к Verticillium sp. и составляют 26,5 мм, Alternaris sp. - 31,5 мм (при микрокопировании был отмечен аутолизис мицелия) и Gliocladium sp. составляет 32,5 мм. (при микрокопировании было отмечено усиленное спороношение гриба).

Пример 2. Исследование фитотоксичности и фитостимуляции суспензии штамма Serratia ficaria ВКПМ В-11403

Для исследования фитотоксичности и фитостимуляции суспензию штамма Serratia ficaria ВКПМ В-11403 культивировали на картофельном агаре при непрерывном перемешивании на качалке (120 об/мин). Температура культивации составила 28°C. Суспензия имела титр клеток 10⁹ КОЕ/мл.

Для возможного использования суспензии Serratia ficaria ВКПМ В-11403 с фунгицидными свойствами изучали ее токсичность и фитостимулирующую активность для растений. Используемые семена томатов сорта «Новичок», перца «Сладкий подарок», баклажана «Черный принц», кабачка «Черный красавец», семена тыквы «Биг мун» были отобраны в соответствии с ГОСТ РФ 50260-92.

В таблице 2 представлены данные по фитотоксичности суспензии штамма Serratia ficaria ВКПМ В-11403 в виде процентного прорастания семян по отношению к контролю (дистиллированная вода).

Из таблицы 2 можно заключить, что наибольшие значения прорастания семян отмечены при обработке томата, тыквы и кабачка и составляют соответственно (%) 98,5; 97,3; 97,8.

В лаг-фазу прирост проростков составил по сравнению с контролем 70%. В эксподенциальную фазу роста происходила фитостимуляция семян кабачков по сравнению с контролем и составила 130-146%. В стационарную фазу роста фитостимуляция составила по сравнению с контролем 194%.

В таблице 3 показаны данные фитостимуляции семян при обработке исследуемым изолятом.

Таким образом, суспензия изолята Serratia ficaria TP активизировала физиологические процессы семян сельскохозяйственных культур.

Пример 3. Исследование фитостимулирующий активности Serratia ficaria ВКПМ В-11403 в открытом грунте

Исследование проводили в открытом грунте на территории фермерского хозяйства ГНУ ВНИИОБ г. Камызяк Астраханской области на семенах томата «Новичок». Образцы растений размещали на 1-рядковых делянках с междурядьями 2,6 метра. Расстояние между растениями в ряде 0,8-1 метр. Продолжительность эксперимента 3 месяца.

Бактериальный штамм Serratia ficaria ВКПМ В-11403 использовался в виде биомассы, наращенной на картофельном отваре с титром 10⁹ КОЕ/мл с последующим разведением суспензии 1:100.

Полевые испытания включали растения, выращенные в грунте без внесения удобрений и пестицидов, с бактеризацией семян суспензией изолята. Контролем служили семена томатов, выращивающиеся в открытом грунте без внесения удобрений и пестицидов.

Для каждого варианта опыта использовались 100 растений.

Семена томатов (по 300 штук для каждого варианта опыта) перед посевом предварительно замачивались в суспензии штамма Serratia ficaria ВКПМ В-11403 с титром клеток 10⁹ КОЕ/мл, а контрольные семена - в воде.

Через дне недели после появления всходов (фаза 2-4 настоящего листа) измеряли биомассу и отмечали фазы развития растений, симптомы альтернариоза и титр микроорганизмов рода Alternaria в ризосфере почвы. В таблице 4 и 5 представлены результаты полевых испытаний.

Из таблицы 4 видно, что растения, обработанные суспензией Serratia ficaria ВКПМ В-11403, в развитии опережают контрольные растения.

Из таблицы 5 видно, что в контроле количество растений с признаками заболеваний составило 11%, а в опыте 0%, что свидетельствует о высокой антагонистической активности изолята.

Из таблицы 6 видно, что количество урожайных кустов в контроле составило 36,1%, в опыте составило 39,1%. Урожайность томатов в контроле составила 0,339 кг/куст, а при обработке суспензией составила 0,631 кг/куст.

Таким образом, заявленный штамм обладает фитостимулирующими свойствами и подавляет развитие фитопатогенных грибов.

Источники информации

1. Патент РФ №2094991, 1997.

2. Патент РФ №2083109, 1997.

3. Патент РФ №2302114, 2007 (прототип).