Результат интеллектуальной деятельности: ПОТЕНЦИАЛ КАЛЕБИНА А В КАЧЕСТВЕ СРЕДСТВА ПРОТИВ ОЖИРЕНИЯ

[Параграф 001] Эта заявка является не предварительной заявкой, поданной на основе предварительной заявки 61/431157 от 10 января 2011 года.

Область техники

[Параграф 002] Настоящее изобретение в целом относится к лекарственным средствам для лечения ожирения. А именно, оно относится к потенциалу калебина A в качестве средства против ожирения.

Предшествующий уровень техники

[Параграф 003] Ожирение является наиболее распространенным нарушением обмена веществ в промышленно развитых странах, и оно становится все более серьезной проблемой в развивающихся странах. Ожирение рассматривают как глобальную эпидемию, а люди с избыточным весом и страдающие ожирением (индекс массы тела (ИМТ) от 25 и выше) входят в группу повышенного риска развития различных хронических физических отклонений и психологических проблем, таких как психические расстройства, нарушение питания и низкая самооценка. Ожирение связано с различными заболеваниями, такими как сердечно-сосудистые заболевания, сахарный диабет, остеоартрит, одышка, препятствующая сну, и рак. По мнению Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ), ожирение является одной из 10 основных причин предотвратимой смерти во всем мире.

[Параграф 004] При ожирении происходит увеличение жировой ткани из-за появления новых жировых клеток (адипоцитов) в результате процесса адипогенеза и/или отложения возросшего количества цитоплазматических триглицеридов в каждой клетке. Жировая клетка по мере развития вырабатывает липидные капли, которые сливаются в одну большую массу. В конечном итоге, в результате усилившегося адипогенеза и скопления комков адипоцитов под кожей развивается целлюлит.

[Параграф 005] Результаты исследования адипогенеза позволяют надеяться, что воздействие на этот процесс в организме человека может привести к снижению тяжести ожирения и диабета. На молекулярном уровне были найдены некоторые маркеры, представляющие собой мишени для лечения ожирения, такие как лептин, адипонектин, фактор некроза опухоли-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α) и др.

[Параграф 006] Несмотря на то что известны лекарственные препараты для лечения этого расстройства, существует постоянная потребность в поиске безопасных природных подходов к контролю ожирения и связанных с ним социально-экономических последствий.

[Параграф 007] Известно, что калебин A (Calebin A) защищает нервные клетки от β-амилоидного инсульта (Park SY et al, J Nat Prod. 2002 Sep; 65(9): 1227-31), вызывает апоптоз и модулирует активность киназ семейства МАРК (митоген-активируемые протеинкиназы, mitogen-activated protein kinase) в клетках рака желудка человека, устойчивых к лекарственным препаратам (Li Y et al, Eur J Pharmacol. 2008 Sep 4; 591(1-3): 252-8). В работе Zeng Y et al. (Chem Pharm Bull (Tokyo) 2007 Jun; 55(6): 940-3) обсуждаются два новых производных калебина, 4″-(4′′′-гидроксифенил-3′′′-метокси)-2″-оксо-3″-бутенил-3-(4′-гидроксифенил)-пропеонат и 4″-(4′′′-гидроксифенил)-2″-оксо-3″-бутенил-3-(4′-гидроксифенил-3′-метокси)-пропеонат.

[Параграф 008] Настоящее изобретение раскрывает потенциал калебина A в отношении предотвращения накопления жира в ходе терминальной дифференцировки адипоцитов (жировые клетки) и применение этого препарата для лечения ожирения. Настоящее изобретение раскрывает потенциал калебина A в отношении возможности благоприятно модулировать биохимические маркеры, связанные с ожирением. Важные биомодуляторные свойства калебина A включают ингибирование синтеза лептина, усиление экспрессии адипонектина и подавление местного (адипоциты) и системного воспаления, вызванного провоспалительными цитокинами, такими как фактор некроза опухоли (TNF-α), интерлейкин-6 (interleukin-6, IL-6) и интерлейкин-1 (interleukin-1β, IL-1β).

[Параграф 009] Таким образом, главная задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы раскрыть потенциал калебина A в качестве средства против ожирения.

[Параграф 0010] Настоящее изобретение выполняет вышеупомянутую главную задачу и раскрывает дополнительные, связанные с ней преимущества.

Краткое описание изобретения

[Параграф 0011] Настоящее изобретение раскрывает потенциал калебина A в отношении ингибирования адипогенеза, и его применение для лечения ожирения. Настоящее изобретение раскрывает потенциал калебина A в отношении благоприятного модулирования биохимических маркеров, связанных с ожирением у млекопитающих. Важные биомодуляторные свойства калебина A включают ингибирование синтеза лептина, усиление экспрессии адипонектина и подавление местного (адипоциты) и системного воспаления, вызванного провоспалительными цитокинами, такими как фактор некроза опухоли (TNF-α), интерлейкин-6 (IL-6) и интерлейкин-1 (IL-1β).

[Параграф 0012] Другие характеристики и преимущества настоящего изобретения станут очевидными из последующего более подробного описания, дополненного сопутствующими фигурами, которые иллюстрируют путем примеров принципов настоящего изобретения.

Краткое описание фигур

[Параграф 0013] На Фиг.1 приведено графическое представление степени ингибирования адипогенеза, вызванного калебином A в концентрациях 0,5, 1,0 и 2,0 мкг/мл, по результатам анализа методом окрашивания масляным красным O.

[Параграф 0014] На Фиг.2 приведено графическое представление степени ингибирования синтеза лептина адипоцитами человека, вызванного калебином A в концентрациях 0,5, 1,0 и 2,0 мкг/мл. Значение P *: <0.01; **: <0.001.

[Параграф 0015] На Фиг.3 приведено графическое представление степени усиления экспрессии адипонектина адипоцитами человека, вызванного калебином A в концентрациях 0,5, 1,0 и 2,0 мкг/мл. Значение P *: <0.01.

[Параграф 0016] На Фиг.4 и 5 приведено, соответственно, графическое представление степени ингибирования экспрессии TNF-α (значение P *: <0.01; **: <0,001) и экспрессии IL-6 (значение P *: <0,01) адипоцитами человека, вызванного калебином A в концентрациях 0,5, 1,0 и 2,0 мкг/мл.

[Параграф 0017] На Фиг.6 приведено графическое представление влияния множественных доз калебина A на экспрессию TNF-α и IL-1β в сыворотке швейцарских мышей-альбиносов, получавших этот препарат. Количество животных = 6 на группу, P-значение: * <0.01; ** <0.001 тест Стьюдента.

[Параграф 0018] На Фиг.7 приведено графическое представление влияния множественных доз калебина A на экспрессию IL-1β в сыворотке швейцарских мышей-альбиносов, получавших этот препарат. Количество животных = 6 на группу, P-значение: * <0.01; ** <0.001 тест Стьюдента.

Подробное описание изобретения

[Параграф 019] Настоящее изобретение раскрывает потенциал калебина A в отношении предотвращения накопления жира в ходе терминальной дифференцировки адипоцитов (жировые клетки) и применение этого препарата для лечения ожирения. Настоящее изобретение раскрывает потенциал калебина A в отношении благоприятного модулирования биохимических маркеров, связанных с ожирением. Важные биомодуляторные свойства калебина A включают ингибирование синтеза лептина, усиление экспрессии адипонектина и подавление местного (адипоциты) и системного воспаления, вызванного провоспалительными цитокинами, такими как фактор некроза опухоли (TNF-α), интерлейкин-6 (IL-6) и интерлейкин-1 (IL-1β).

[Параграф 0020] В наиболее предпочтительном воплощении настоящее изобретение относится к способу ингибирования адипогенеза, который включает стадию, в ходе которой адипоциты приводят в контакт с эффективным количеством калебина A. Другими словами, настоящее изобретение относится к способу предотвращения накопления жира в ходе терминальной дифференцировки адипоцитов млекопитающих (Фиг.1).

[Параграф 0021] В другом предпочтительном воплощении настоящее изобретение относится к способу ингибирования экспрессии лептина в адипоцитах, где указанный способ включает стадию, в ходе которой адипоциты приводят в контакт с эффективным количеством калебина A (Фиг.2).

[Параграф 0022] В другом предпочтительном воплощении настоящее изобретение относится к способу усиления экспрессии адипонектина в адипоцитах, где указанный способ включает стадию, в ходе которой адипоциты приводят в контакт с эффективным количеством калебина A (Фиг.3).

[Параграф 0023] В другом предпочтительном воплощении настоящее изобретение относится к способу ингибирования экспрессии провоспалительного цитокина TNF-α в адипоцитах, где указанный способ включает стадию, в ходе которой адипоциты приводят в контакт с эффективным количеством калебина A (Фиг.4).

[Параграф 0024] В еще одном предпочтительном воплощении настоящее изобретение относится к способу подавления экспрессии провоспалительного цитокина интерлейкина-6 в адипоцитах, где указанный способ включает стадию, в ходе которой адипоциты приводят в контакт с эффективным количеством калебина A (Фиг.5).

[Параграф 0025] В конкретном воплощении адипоциты, о которых идет речь выше, представляют собой адипоциты человека.

[Параграф 0026] В еще одном предпочтительном воплощении настоящее изобретение относится к способу снижения вызванной ожирением системной экспрессии провоспалительных цитокинов у млекопитающих, где вышеуказанный способ включает стадию введения эффективного количества калебина A пациенту, который в этом нуждается. Конкретные воплощения предполагают использование в качестве провоспалительных цитокинов, о которых идет речь в данном параграфе, фактора некроза опухоли α (TNF-α), интерлейкина-6 (IL-6) и интерлейкина-1β (IL-1β) (Фиг.6 и 7).

[Параграф 0027] В еще одном предпочтительном воплощении настоящее изобретение относится к способу контроля ожирения, где указанный способ включает стадию введения эффективного количества калебина A пациенту, которому необходим этот препарат.

[Параграф 0028] В еще одном предпочтительном воплощении пациент представляет собой млекопитающее.

[Параграф 0029] В еще одном предпочтительном воплощении пациент представляет собой человека.

[Параграф 0030] Потенциальное терапевтическое значение калебина A в качестве молекулы, имеющей активность против ожирения, может быть понятно из примеров, описанных ниже.

Пример I

Острая пероральная токсичность калебина A

[Параграф 0031] В таблице I приведен список параметров, которые измерялись для оценки острой пероральной токсичности калебина A.

[Параграф 0032] Результаты

Пероральное введение калебина A в количестве до 2000 мг/кг не вызывало смертность у мышей в течение двух недель наблюдения.

Пример II

Окрашивание раствором масляного красного O адипогенных культур и определение лептина, адипонектина, TNF-α и IL-6 методом иммуноферментного анализа (ИФА).

[Параграф 0033] Терминальная дифференцировка адипоцитов сопровождается накоплением большого количества липидов в больших цитоплазматических везикулах. Общепринятым аналитическим способом оценки адипоцитарной дифференцировки в культуре клеток является метод окрашивания масляным красным O (Oil-Red O, ORO). ORO является жирорастворимым ярко-красным красителем, который позволяет надежно определить адипоцитарную дифференцировку (адипогенез).

Принцип работы

[Параграф 0034] Масляный красный O (растворитель красный 27, Судан красный 5B, С.I. 26125, и C₂₆H₂₄N₄O) является лизохромным (жирорастворимый краситель) диазокрасителем, который используется для окрашивания нейтральных триглицеридов и липидов на замороженных срезах и некоторых липопротеинов на парафиновых срезах. Он представляет собой порошок красного цвета с максимальным поглощением при 518 (359) нм. Масляный красный O является одним из представителей семейства судановых красителей. Аналогичные красители включают Судан III, Судан IV, и Судан черный B. Процедуру окрашивания необходимо выполнять на свежих образцах, поскольку фиксация спиртом удаляет липиды. Масляный красный O в большинстве случаев заменил Судан III и Судан IV, так как он позволяет получать более глубокий красный цвет, в результате чего окраску гораздо проще увидеть.

[Параграф 0035] Масляный красный O является жирорастворимым красителем. Жирорастворимые красители гораздо лучше растворяются в липидных веществах тканей/клеток, чем в обычных водно-спиртовых растворителях для красителей. Следовательно, этот краситель глубоко прокрашивает клетки.

Методика

[Параграф 0036] Клетки 3T3-L1 высеивают в количестве примерно 60×104 и культивируют в течение 48-72 часов до достижения 70-80% степени смыкания монослоя. Через 48 ч добавляют 200 мкл свежеприготовленной AIM (среда, индуцирующая адипогенез, adipogenesis induction medium). Через 72 ч в ячейки добавляют по 200 мкл АРМ (среда для прогрессирования адипогенеза, adipogenesis progression medium), и добавляют в лунки тестируемые соединения в различных концентрациях. Клетки инкубируют в течение 48 часов во влажной атмосфере (37°C), состоящей из 5% CO₂ и 95% воздуха. Супернатант собирают и хранят для определения лептина, адипонектина, IL-6 и TNF-α методом ИФА. Клетки фиксируют, добавляя 100 мкл 10% формалина, после чего проводят окрашивание красителем ORO. Оптическую плотность (optical density, OD) измеряют при 492 нм в микропланшетном ридере. Результаты выражают в виде значений половины максимальной ингибирующей концентрации (IC₅₀) с помощью программного обеспечения GraphPad Prism.

[Параграф 0037] Степень ингибирования адипогенеза рассчитывают следующим образом,

Где C означает поглощение красителя Масляного красного O в дифференцирующихся/недифференцированных клетках, и

T означает поглощение Масляного красного O в дифференцирующихся/недифференцированных клетках, обработанных тестируемым соединением. Определение лептина, адипонектина, IL-6 и TNF-α осуществляют в соответствии с руководством пользователя от R&D Systems.

[Параграф 0038] Ссылки

1. Wu Z, Xie Y, Morrison RF, Bucher NLR, Farmer SR 1998. PPAR γ induces the Insulin-dependent Glucose Transporter GLUT4 in the absence of C/EBP□ during the conversion of 3T3 fibroblasts into adipocytes. J Clin Invest. 101: 22-32.

2. A pre-adipose 3T3 cell variant highly sensitive to adipogenic factors & to human growth hormone. LA Salazar-Olivo, F Castro-Munozledo & W Kuri-Harcuch. Department of Cell Biology, Centro de Investigation y de Estudios Avanzados del I.P.N., Mexico D.F., Mexico. Journal of Cell Science, Vol 108, Issue 5 2101-2107.

3. A Nuclear Receptor Atlas: 3T3-L1 Adipogenesis. Mingui Fu, Tingwan Sun, Angie L. Bookout, Micheal Downes, Ruth T. Yu, Ronald M. Evans and David J. Mangelsdorf. Molecular Endocrinology 19(10): 2437-2450.

4. Aimee D, Kohn etal, JBC, Vol 271, No.49, pp-31372-31378.

Результаты

[Параграф 0039] На Фиг.1 приведено графическое представление степени ингибирования адипогенеза, вызванного калебином A в концентрациях 0,5, 1,0 и 2,0 мкг/мл, равной, соответственно, 32,43%, 38,59% и 35,8%, исследованной методом окрашивания Масляным красным O.

[Параграф 0040] На Фиг.2 приведено графическое представление степени ингибирования синтеза лептина (34,92%, 41,04% и 39,48% соответственно) адипоцитами человека, вызванного калебином A в концентрациях 0,5, 1,0 и 2,0 мкг/мл. Значение влияния калебина A на ингибирование синтеза лептина адипоцитами человека и корреляция с регуляцией ожирения вытекает из следующих фактов (Заметки о патофизиологии эндокринной системы Университета штата Колорадо, Notes on Pathophysiology of the Endocrine System, Colorado State University).

[Параграф 0041] Лептин является белковым гормоном, который экспрессируется преимущественно в адипоцитах. Он оказывает важное влияние на регуляцию массы тела, обмен веществ и репродуктивную функцию. Белок кодируется геном ожирения (ob), молекулярная масса белка составляет около 16 килоДальтон (кДа). При нормальных концентрациях лептина его биологическая функция заключается в основном в том, чтобы оказывать влияние на гипоталамические центры головного мозга, которые контролируют голод, аппетит, регуляцию температуры тела и энергетический метаболизм. Таким образом, лептин у человека, не страдающего ожирением, может вызвать потерю веса за счет двух важных механизмов: (i) ослабление голода и сокращение потребления продуктов питания, наиболее вероятно, путем ингибирования нейропептида Y, который регулирует пищевое поведение, и (ii) путем увеличения энергетических затрат за счет повышения температуры тела, потребления кислорода и потери массы жировой ткани. Тем не менее, избыточная секреция лептина в случае ожирения или в экспериментальных моделях индуцированного ожирения ведет к нарушению функций гипоталамических центров таким образом, что пациент, страдающий ожирением, не может достичь насыщения и, как правило, переходит в режим чрезмерного потребления пищи. Поэтому становится крайне важным добиться эффективного сокращения избыточного уровня лептина при ожирении, и калебин A является многообещающим препаратом в этом направлении, как показано на Фиг.2.

[Параграф 0042] На Фиг.3 приведено графическое представление степени ингибирования экспрессии адипонектина (27,12%, 34,06% и 32,8% соответственно) адипоцитами человека, вызванного калебином A в концентрациях 0,5, 1,0 и 2,0 мкг/мл. Адипонектин является цитокином, который синтезируется почти исключительно адипоцитами и экспрессируется на довольно высоком уровне у худых и здоровых людей. С другой стороны, у людей, страдающих ожирением, снижен уровень адипонектина, при этом они подвержены ишемической болезни сердца (ИБС), сахарному диабету и гипертонии.

[Параграф 0043] Ссылки

1. Tamar. R. Aprahamian and Flora Sam, "Adiponectin in Cardiovascular Inflammation and Obesity, Int J Inflam. 2011; 2011: 376909;

2. Hotta K, Funahashi T, Arita Y, et al. Plasma Концентрацияs of a novel, adipose-specific protein, adiponectin, in type 2 diabetic patients. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 2000; 20(6): 1595-1599;

3. Iwashima Y, Katsuya T, Ishikawa K, et al. Hypoadiponectinemia is an independent risk factor for hypertension. Hypertension. 2004; 43(6): 1318-1323;

4. Kumada M, Kihara S, Sumitsuji S, et al. Association of hypoadiponectinemia with coronary artery disease in men. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 2003; 23(1): 85-89 and

5. Lindsay RS, Funahashi T, Hanson RL, et al. Adiponectin and development of type 2 diabetes in the Pima Indian population. The Lancet. 2002; 360(9326): 57-58.

[Параграф 0044] На Фиг.3 показано, что калебин A эффективно увеличивает уровень адипонектина в адипоцитах человека и тем самым является перспективным лекарственным средством для лечения ожирения.

[Параграф 0045] На фиг.4 и 5 представлена степень ингибирования TNF-α (36,03%, 40,81% и 45,47% соответственно) и IL-6 (21,31%, 32,37% и 31,7% соответственно), вызванного калебином A в концентрациях 0,5, 1,0 и 2,0 мкг/мл. В работе Bastard JP et al, "Recent Advances in the relationship between obesity, inflammation and insulin resistance", Eur Cytokine Netw. 2006 Mar; 17(1): 4-12 сообщается, что ожирение связано со слабым воспалением белой жировой ткани (WAT - white adipose tissue). Авторы также отмечают, что при ожирении для WAT характерна повышенная экспрессия провоспалительных молекул, таких как TNF-α и IL-6, которые оказывают воздействие не только на WAT, но также и на другие системы органов тела. На фиг.4 и 5 показано, что калебин A эффективно снижает экспрессию TNF-α и IL-6 в адипоцитах и может оказаться полезным для модулирования воздействия местного и системного воспаления при ожирении.

Пример III

Модуляция системного воспаления с помощью калебина A

[Параграф 0046] Авторы настоящего изобретения также приводят дополнительные доказательства, подтверждающие способность калебина A ингибировать внутриклеточный TNF и внеклеточный IL-1β в системе нейтрофилов мышей (таблица II, таблица III). Нейтрофилы выделяют с помощью метода разделения на градиенте плотности гистопака и тестируют на их способность синтезировать TNF-α in vitro после стимуляции липосахаридами (ЛПС). Клетки инкубировали в темноте с антителами против мышиного TNF-α, меченными фикоэритрином, затем промывали стерильным фосфатно-солевым буфером PBS (phosphate buffered saline) и ресуспендировали в PBS (pH 7.4), после чего клетки анализировали непосредственно в проточном цитометре (BDLSR; Becton Dickinson). Флюоресцентный триггер был установлен на параметр PE (FL1) изолированной популяции нейтрофилов (10000 событий). В этом исследовании в качестве стандартного ингибитора TNF-α использовали ролипрам (Rolipram) в концентрации 100 мкг/мл. Компенсацию флюоресценции, анализ данных и представление данных проводили с использованием программного обеспечения Cell Quest Pro (Becton Dickinson).

[Параграф 0047] Ссылки

1. Clara, В., R.С. Arancha, G.M. Andre′s, P. Atanasio, A. Julia, and O. Alberto. 2003. A new method for detecting TNF-α-secreting cells using direct immunofluorescence surface membrane stainings. J. Immuno. Methods 264: 77-87.

2. Khurshid A. Bhat, Bhahwal A. Shah, Kuldeep K. Gupta, Anjali Pandey, Sarang Bani, Subhash C. Taneja. Semi-synthetic analogs of pinitol as potential inhibitors of TNF-α cytokine expression in human neutrophils. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 19 2009, 1939-1943.

[Параграф 0048] Авторы настоящего изобретения также приводят данные по исследованию способности калебина A уменьшать экспрессию внеклеточного TNF-α, IL-1β [Фиг.6] и IL-6 [Фиг.7] в сыворотке мышей, которым вводили препарат (модели in vivo). Самцов швейцарских мышей-альбиносов в возрасте 6-8 недель содержали при 22±2°C при режиме освещенности свет/темнота 12/12 ч. Мышам перорально вводили тестируемые лекарственные препараты в определенных дозах (масса/объем) в течение 6 дней, с последующим внутривенным введением 1 мг/кг ЛПС в соответствии с методикой, описанной в работе Brieva A, Guerrero А, Alonso-Lebrero J L and Pivel JP. 2001. Inmunoferon, a glycoconjugate of natural origin, inhibits LPS-induced TNF-α production and inflammatory responses. International Immunopharmacology 1, 1979-1987. В каждой группе было по шесть мышей, при этом каждый эксперимент повторяли три раза. Количество TNF-α, IL-1β и IL-6 определяли с помощью коммерческих наборов ИФА (R&D Systems) в сыворотке мышей, которым вводили тестируемые препараты, через 90 мин после введения ЛПС. Ролипрам в количестве 30 мг/кг использовали в качестве стандартного лекарственного средства.

[Параграф 0049] На фиг.6 и 7 показано, что калебин A эффективно снижает уровни TNF-α, IL-1β и IL-6, что свидетельствует о том, что данное соединение является полезным агентом для модулирования эффектов местного и системного воспаления при ожирении.

[Параграф 0050] Следует отметить, что хотя настоящее изобретение описано в рамках предпочтительного воплощения, но специалистам в данной области техники очевидно, что объем настоящего изобретения не ограничивается только этим воплощением. Напротив, объем настоящего изобретения следует интерпретировать только в сочетании с прилагаемой формулой изобретения.