СПОСОБ РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ ТЯЖЕЛОЙ ФОРМЫ ГЕРПЕСВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ У НОВОРОЖДЕННЫХ ДЕТЕЙ

Изобретение относится к медицине, а именно к неонатологии, и может быть использовано для ранней диагностики тяжелой формы инфекции, вызванной вирусом простого герпеса 1 и 2 типа (ВПГ1,2) у новорожденных детей от матерей с персистирующей герпесвирусной инфекцией.

Инфекция, вызванная ВПГ 1,2 типа, является важнейшей медико-социальной проблемой современной перинатологии, что обусловлено тяжестью течения заболевания, высокой частотой поражения ЦНС и последующей инвалидизацией детей (Иванова В.В., Иванова М.В., Левина А.С. и соавт. Современные принципы диагностики и лечения перинатальных герпес-вирусных инфекций // Рос. вестник перинатологии и педиатрии. - 2008. - №1. - С.10-18; Абрамова И.В. Клинико-лабораторные критерии диагностики внутриутробных инфекций у новорожденных: автореф. дисс… канд. мед. наук. - Саратов, 2010. - 23 с.; Dye D.W., Simmons G.T. Fatal herpes virus type I infection in a newborn // Am. J. Forensic. Med. Pathol. - 2010. - Vol.31, №1. - P.89-91). При этом актуальность проблемы обусловлена и тем, что у детей, перенесших генерализованные формы врожденной герпесвирусной инфекции, очень часто развиваются серьезные нарушения здоровья, что приводит к снижению качества жизни в целом (Долгих Т.И., Дроздова С.Г., Кадцына Т.В., и соавт. Клинико-иммунологическая характеристика герпесвирусных инфекций у детей первого года жизни // Сибирский медицинский журнал. - 2008. - Т.23, №3. - С.19-22.; Gleason Ch.A., Devaskar Sh.U. Avery's Diseases of the Newborn // Ninth Edition Chapter. - 2012. - N36. - P.445-467).

Учитывая, что реализация инфекционного процесса определяется патогенностью возбудителей инфекции и эффективностью защитных сил организма, особая роль отводится состоянию иммунной системы (Ожегов A.M., Тарасова Т.Ю., Петрова И.Н. Клинико-иммунологические особенности внутриклеточных внутриутробных инфекций у новорожденных с задержкой внутриутробного развития // Детская больница. - 2011. - №1(43). - С.31-36). Все вышеизложенное определяет необходимость разработки прогностических критериев тяжелой формы инфекции, вызванной вирусом простого герпеса 1 и 2 типа у новорожденных детей, что позволит снизить тяжесть течения врожденной инфекции, вызванной вирусом простого герпеса 1 и 2 типа, у детей на основании ранней диагностики и своевременного назначения адекватной патогенетической терапии.

На сегодняшний день ранней диагностике и прогнозированию манифестации внутриутробной инфекции посвящено значительное количество работ.

Известен способ прогнозирования внутриутробной инфекции путем определения в пуповинной крови новорожденных β2-микроглобулина (Павлютенкова Ю.А., Пустотина О.А., Екимова Е.В. с соавт. Прогностическое значение определения концентрации β2-микроглобулина в сыворотке крови беременных группы высокого инфекционного риска // «Мать и дитя»: материалы VIII всероссийского форума. - Москва. - 2006. - С.191-192). Недостатком этого способа является невозможность осуществить прогнозирование развития или же отсутствия у новорожденного конкретной нозологической патологии, т.е. отсутствует специфичность способа.

Известен способ диагностики локальных форм инфекционно-воспалительных заболеваний у доношенных новорожденных путем исследования показателей содержания в сыворотке периферической крови интерлейкина 6 (IL-6) методом иммуноферментного анализа и иммуноглобулина М (Ig M), методом радиальной иммунодиффузии при инфекционно-воспалительной патологии выявлено снижение показателей IL-6 и повышение уровня Ig М (Пинаева А.Р. Состояние цитокиновой системы и клеточного иммунитета при инфекционно-воспалительных заболеваниях у новорожденных детей: Автореф. дис.… канд. мед. наук. - М., 2002. - 23 с.). Недостатками способа является то, что исследование IL-6 и Ig M выполняется для диагностики уже развившихся неонатальных инфекций, так как Ig М вырабатывается в результате первичного иммунного ответа, а IL-6 является регулятором острофазного воспалительного ответа.

Известен способ прогнозирования локальных форм инфекционно-воспалительной патологии у доношенных новорожденных путем определения содержания CD4+CD95+ лимфоцитов в периферической крови новорожденного на 5-7 день жизни и при его значении, равном 4,5% и более, прогнозируют возникновение инфекционно-воспалительных заболеваний в неонатальном периоде с точностью 90% (Патент №2225008. Способ прогнозирования неонатальной инфекционно-воспалительной патологии / Беликова М.Э., Чаша Т.В., Сотникова Н.Ю., Кулагина Т.Г., Троицкая Е.А., Куликова Н.Ю. // Изобретения. Полезные модели. - 2004. - №6, ч.3. - С.813). К недостаткам способа можно отнести то, что он не может быть использован для прогнозирования тяжелой формы инфекции, вызванной вирусом простого герпеса 1 и 2 типа у новорожденных детей.

Известен способ диагностики генерализованной герпетической инфекции у детей первых месяцев жизни путем выявления повышения уровней IgM, IgA в сыворотке крови (Н.А. Яценко. Клинико-иммунологические аспекты врожденной герпетической инфекции у детей первых месяцев жизни, 2000, дисс. канд. мед. наук). К недостаткам способа можно отнести то, что диагностическая ценность лабораторных методов, основанных на оценке гуморального иммунитета (специфические антитела IgG и IgM класса) является низкой, в связи с особенностями антителогенеза в период ранней неонатальной адаптации. Отсутствие специфических антител нередко не означает отсутствия инфекционного процесса, т.к. исследование могло проводиться в фазе формирования иммунного ответа.

Известен способ прогнозирования генерализованной формы герпес-вирусной инфекции у детей первых месяцев жизни, инфицированных герпес-вирусами, путем исследования крови, отличающийся тем, что в сыворотке периферической крови определяют уровень субпопуляции В-лимфоцитов с рецепторами СД20+СД40 и при выявлении повышения субпопуляции В-лимфоцитов с рецепторами СД20+СД40 выше 14,8% прогнозируют развитие генерализованной формы герпес-вирусной инфекции у детей первых месяцев жизни (Патент РФ№2341797, 20.12.2008). Недостатком способа является то, что он не позволяет проводить дифференциальный диагноз между внутриутробной инфекцией и инфицированием.

Известен способ диагностики внутриутробных инфекций путем исследования уровня ИФН-γ в сыворотке периферической крови новорожденных. (Рахманкулова З.Ж. Внутриутробные инфекции у новорожденных: клинико-иммунологические механизмы, критерии прогноза, лечение. Автореф. дис.… докт. мед. наук. - Ташкент, 2012. - 44 с.). Недостатком является то, что

1) способ предполагается использовать у новорожденных в позднем неонатальном периоде и он не используется у детей в раннем неонатальном периоде.

2) Отсутствуют данные о точности, чувствительности и специфичности способа.

3) Исследование ИФН-γ выполняется для диагностики уже развившихся неонатальных инфекций.

4) Невозможно осуществить раннюю диагностику развития у новорожденного конкретной нозологической патологии (тяжелой формы инфекции, вызванной вирусом простого герпеса 1 и 2 типа).

Данный способ выбран нами за прототип.

Недостатки прототипа устраняются в заявляемом способе.

Задачей изобретения является разработка высокочувствительного способа ранней диагностики тяжелой формы герпесвирусной инфекции у новорожденных детей.

Поставленная задача решается тем, что в крови новорожденных от матерей с персистирующей герпесвирусной инфекцией на 7-10 сутки определяют уровень CD16+CD25+, IL-6 и при значениях CD16+CD25+<3,5%, IL-6>32,6 пг/мл прогнозируют тяжелую форму внутриутробной инфекции, вызванной вирусом простого герпеса 1 и 2 типа у новорожденных детей.

Технический результат - способ позволяет сократить время исследования и повысить точность индивидуального прогноза, упрощение способа, информативность.

Нами доказано, что данный способ обладает высокой точностью, чувствительностью и специфичностью.

В доступной литературе не выявлено использование определения уровня CD16+CD25+ и IL-6 в качестве скринингового маркера для ранней диагностики тяжелой формы инфекции, вызванной вирусом простого герпеса 1 и 2 типа у новорожденных детей.

NK-клетки являются одним из важнейших компонентов клеточного врожденного иммунитета, которые играют важную роль в устранении инфицированных вирусом клеток на ранней стадии инфекции, выполняют цитотоксические и цитокин-продуцирующие функции. Основным продуцентом активированных NK-клеток является интерферон-γ, который играет важную роль в развитии иммунного ответа Th1 типа и блокирует развитие Th2-типа иммунного ответа, подавляя синтез IL-4 и пролиферацию клеток Th2-фенотипа. Дефицит натуральных киллеров свидетельствует о низкой резистентности иммунной системы новорожденного к вирусной инфекции (Wilkinson G.W., Tomasec P., Stanton R.J., et al. Modulation of natural killer cells by human cytomegalovirus // J. Clin. Virol. - 2008. - N41. - P.206-212).

Важнейшая роль в развитии системного воспаления принадлежит медиаторам воспаления. Способность клеток моноцитарно-макрофагального ряда высвобождать провоспалительные молекулы является одним из патогенетических факторов в развитии локального и системного воспалительного ответа. IL-6, продуцируясь активированными макрофагами, Т-лимфоцитами, участвует в качестве кофактора при дифференцировке В-лимфоцитов, их созревании и преобразовании в плазматические клетки, секретирующие иммуноглобулины. Повышение уровня IL-6 может приводить к сдвигу дифференцировки Т-хелперов в направлении Th2, не обеспечивающих формирование эффективного противовирусного иммунного ответа (Diehl S., Rincón M. The two faces of IL-6 on Th1/Th2 differentiation // Mol Immunol. - 2002. - N39(9). - P.531-536).

В этой связи все вышеуказанное явилось основанием к исследованию уровня CD16+CD25+ и IL-6 в крови новорожденных для ранней диагностики тяжелой формы инфекции, вызванной вирусом простого герпеса 1 и 2 типа. Наши исследования позволили установить очень важные количественные величины CD16+CD25+ и IL-6, которые являются определяющими для отбора новорожденных в группу риска, а именно то, что при значениях CD16+CD25+ 3,5% и ниже и IL-6 32,6 пг/мл и выше, прогнозируют тяжелую форму инфекции, вызванной вирусом простого герпеса 1 и 2 типа у новорожденных детей. CD16+CD25+ - это активированные NK-клетки, измерение их количества проводится методом проточной цитометрии в %. IL-6 определяется методом ИФА и измеряется в пг/мл.

Способ осуществляют следующим образом.

У новорожденных от матерей с персистирующей герпевирусной инфекцией на 7-10 сутки исследуют периферическую кровь, собранную в количестве 0,5 мл в пробирки с гепарином натрия. К 20 мкл моноклональных антител CD16 (FITC) и 20 мкл CD25 (PE), (Caltag, CIUA), добавляют 100 мкл гепаринизированной крови, перемешивают на шейкере (1000 об/мин) в течение 3 секунд и инкубируют при комнатной температуре 20 минут. Затем добавляют 500 мкл лизирующего раствора и инкубируют до полного лизиса эритроцитов. Далее дважды отмывают в 1 мл РВС (фосфатно-солевой буфер) при 1500 об/мин по 3 минуты. К осадку добавляют 1 мл РВС и ресуспендируют. Учет реакции проводят на проточном цитофлюориметре, ресуспендируют. Учет реакции проводят на проточном цитофлюориметре "Beckman Coulter XL" (США). Концентрацию IL-6 в сыворотке крови новорожденных определяли с помощью набора реагентов «Протеиновый контур» (г. Санкт-Петербург).

При выявлении в сыворотке крови новорожденных CD16+CD25+ 3,5% и ниже и IL-6 32,6 пг/мл и выше прогнозируют тяжелую форму инфекции, вызванной вирусом простого герпеса 1 и 2 типа, что позволяет неонатологу своевременно назначить адекватную терапию.

Работоспособность заявляемого способа подтверждается следующими клиническими примерами.

Пример 1

Ребенок, Н-в., родился 28.06.10 г. (история болезни №9323) от женщины 30 лет, страдающей герпесом губ, с отягощенным акушерским анамнезом (первая беременность - мед. аборт, вторая беременность - искусственные роды, третья беременность - антенатальная гибель плода). Беременность протекала на фоне фетоплацентарной недостаточности, внутиутробной гипоксии плода, гестоза, угрозы прерывания, хронического пиелонефрита. Роды 3, в сроке 39 недель. Ребенок родился в тяжелом состоянии, с массой 4000 г, длиной 52 см, оценкой по шкале Апгар 5-7 баллов. Кожные покровы иктеричные, чистые. С первых суток у ребенка отмечались, геморрагические проявления в форме множественных петехий в области лица и туловища, кровоточивость из мест инъекций, гематурия, прогрессирующее увеличение печени и селезенки, темное окрашивание мочи, анемия (уровень эритроцитов - 2,3×10¹², гемоглобин - 90 г/л., билирубин 300 мкмоль/л).

На 7 сутки ребенок из роддома переведен в отделение патологии новорожденных, при поступлении в сыворотке крови проведено исследование количества CD16+CD25+ составило 3,5%, IL-6 составило 32,6 пг/мл, т.е. по нашим данным ребенок угрожаем по развитию тяжелой формы инфекции, вызванной вирусом простого герпеса. У ребенка нарастала иктеричность кожных покровов, появилось отделяемое из глаз, явления омфалита, отмечалась одышка смешанного характера, симптомы дыхательной недостаточности, крепитирующие хрипы в легких, повысилась температура до субфебрильных цифр, ребенок плохо прибавлял в массе, отмечались симптомы интоксикации в виде вялости, адинамии, срыгиваний, плохого аппетита, имела место неврологическая симптоматика в виде снижения рефлексов новорожденного, тремора конечностей, запрокидывания головы, болезненного плача.

Во время нахождения в стационаре ребенку был проведен общий анализ крови, в котором определялся лейкоцитоз, нейтрофилез, моноцитоз, тромбоцитопения. В анализе мочи - положительная реакция на желчные пигменты. При проведении биохимического анализа крови отмечалась гипербилирубинемия за счет прямой и непрямой фракции, повышенный уровень трансаминаз. УЗИ печени выявило увеличение ее размеров и изменения паренхимы. УЗИ почек выявило плотный и несколько дилатированный комплекс почек.

На ЭКГ определялась гипертрофия миокарда правого желудочка. При эхокардиоскопии - вторичный дефект межпредсердной перегородки, дефект межжелудочковой перегородки, аномальная хорда в полости левого желудочка, диастолическая дисфункция левого желудочка. Регургитация на митральном клапане.

Проведена консультация окулиста. Диагноз: дакриоцистит обоих глаз.

В анализе крови на стерильность, посевах отделяемого глаз, пупочной раны, носа рост микрофлоры не определялся. В отделяемом из зева выделен стрептококк. При ПЦР диагностике мочи обнаружена ДНК ВПГ, при ИФА-диагностике выявлено нарастание титров IgG антитела к ВПГ в динамике заболевания в течение 12 дней (с 68 у.е. до 186 у.е.). При НСГ-исследовании отмечалось повышение эхогенности мозгового вещества и перивентрикулярной области. Ребенку был поставлен диагноз: генерализованная герпетическая инфекция, внутриутробный гепатит, двусторонняя пневмония, гипоксически-ишемически-дисметаболическое поражение ЦНС, синдром угнетения, постгипоксическая кардиопатия, вторичный дефект межпредсердной и дефект межжелудочковой перегородки, дакриоцистит обоих глаз. Назначена противовирусная, антибактериальная, дезинтоксикационная терапия, интерферонотерапия, иммунотропная терапия. Таким образом, прогноз по заявляемому способу подтвердился.

Пример 2

Ребенок К-в. родился 30.03.11 г. (история болезни №7520) от женщины 27 лет. Беременность первая. Беременность протекала на фоне фетоплацентарной недостаточности. Во время беременности у женщины отмечалась герпетическая инфекция, проявляющаяся высыпаниями на губах, gerpes labialis. Роды I, в 38 недель. Ребенок родился в удовлетворительном состоянии, с массой 2850 г, длиной 51 см, вызванной вирусом простого герпеса.

С третьих суток у ребенка отмечалась желтуха, неврологическая симптоматика в виде беспокойства, тремора конечностей, гипертонус мышц. Ребенок переведен в отделение патологии новорожденных на 7 сутки жизни. При поступлении в отделение патологии новорожденных в сыворотке крови проведено исследование количества CD16+CD25+ составило 3,0%, IL-6 составило 38,9 пг/мл, т.е. по нашим данным ребенок угрожаем по развитию тяжелой формы инфекции.

Отмечались респираторно-аффективные пароксизмы. Состояние тяжелое, кожа иктеричная с цианотичным оттенком, пониженного состояния питания. В легких ослабленное дыхание. Тоны сердца приглушены, систолический шум на верхушке. Стул неустойчивый, в кале примесь слизи, зелени.

Во время нахождения в стационаре ребенку был проведен общий анализ крови, в котором определялся лимфоцитоз, моноцитоз. УЗИ печени выявило увеличение ее размеров и изменения паренхимы печени, спазм сфинктеров желчного пузыря. На ЭКГ определялась тахикардия и неполная блокада правой ножки пучка Гиса.

В анализе крови на стерильность, посевах отделяемого глаз, пупочной раны, носа рост микрофлоры не определялся. При ПЦР диагностике крови обнаружена ДНК ВПГ, при ИФА-диагностике выявлено нарастание титров IgG антитела к ВПГ в динамике заболевания в течение 10 дней (с 62 у.е. до 150 у.е.). При НСГ-исследовании отмечалось расширение межполушарной щели, нерезкая внутричерепная гипертензия. Ребенку был поставлен диагноз: генерализованная герпетическая инфекция, гипоксически-ишемическое поражение ЦНС, гипертензионный синдром, синдром пирамидной недостаточности, спастический тетрапарез, конъюгационная желтуха, гипотрофия I степени, дисбактериоз кишечника.

Назначена противовирусная, антибактериальная, дезинтоксикационная терапия, интерферонотерапия, иммунотропная терапия.

Таким образом, прогноз по заявляемому способу подтвердился.

Пример 3

Ребенок З-в. родился 15.04.10 г. (история родов №2270) у женщины 30 лет с отягощенным акушерским анамнезом (1 беременность - роды, 2 - мед. аборт), беременность которой протекала на фоне, кольпита, эрозии шейки матки. При ДНК-диагностике обнаружена ВПГ. Роды 2, в срок. Ребенок родился в удовлетворительном состоянии массой 3450, длиной 50 см, с оценкой по шкале Апгар 8-9 баллов. Кожные покровы бледно-розовые, чистые. В возрасте 7 суток, при поступлении в отделение патологии новорожденных в сыворотке крови проведено исследование количества CD16+CD25+ составило 3,8%, IL-6 составило 28,5 пг/мл, т.е. по нашим данным период новорожденности должен протекать благоприятно.

При обследовании ребенка в возрасте 1 месяца выявлено, что ребенок здоров и на первом месяце жизни ничем не болел.

Достоверность предлагаемого способа подтверждена клинико-лабораторными исследованиями. По заявляемому способу было обследовано 40 новорожденных. У 21 из них (1 группа) количество CD16+CD25+ было 3,5% и ниже, a IL-6 32,6 пг/мл и выше, что свидетельствовало о риске развития тяжелой формы инфекции, вызванной вирусом простого герпеса 1 и 2 типа и было подтверждено в процессе дальнейшего клинико-лабораторного наблюдения.

У 19 новорожденных (II группа) показатели CD16+CD25+ были выше чем 3,5%, а IL-6 - ниже 32,6 пг/мл, что предполагало благоприятное течение неонатального периода.

В первой группе процент развития тяжелой формы инфекции, вызванной вирусом простого герпеса 1 и 2 типа составил 85,7%, в сравнении с 5,3% во 2-й группе.

Результаты статистического анализа в среде пакета прикладных программ STATISTIKA 6 позволили разработать прогностическое правило формирования групп риска среди новорожденных детей с использованием метода логистической регрессии (Ребров О.Ю. "Статистический анализ медицинских данных", Москва. - Медиа сфера. - 2003). Полученное правило обеспечивает высокую точность - (88,0%), чувствительность - (85,7%) и специфичность (85,0%) метода.

Таким образом, по уровню CD16+CD25+ и IL-6 в крови новорожденных возможно проводить раннюю диагностику тяжелой формы инфекции, вызванной вирусом простого герпеса 1 и 2 типа в периоде новорожденности.

Предложенный нами способ достаточно прост, позволяет провести раннюю диагностику тяжелой формы инфекции, вызванной вирусом простого герпеса 1 и 2 типа у новорожденных детей, на основании этого назначать противовирусную и иммуномодулирующую терапию не всем новорожденным из группы риска, а дифференцирование.

Способ апробирован в родильном доме и отделении патологии новорожденных РНИИАП.

Преимущество заявляемого метода состоит в том, что на основании высокочувствительных современных лабораторных маркеров производится ранняя диагностика тяжелой формы инфекции, вызванной вирусом простого герпеса 1 и 2 типа у новорожденных детей с целью раннего назначения патогенетической терапии. В клинической практике это позволит снизить процент инвалидизации за счет своевременного формирования новорожденных группы риска и начала адекватных лечебных мероприятий. Проведенные исследования свидетельствуют о том, что заявляемый способ обладает быстротой исполнения с использованием стандартных тест-систем, может быть рекомендован для широкого клинического применения в практическом здравоохранении.