УГЛЕРОДНЫЙ СОРБЕНТ С АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫМИ И АНТИМИКОТИЧЕСКИМИ СВОЙСТВАМИ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ

Изобретение относится к технологии получения углеродных сорбентов с антибактериальными и антимикотическими свойствами на основе пористых углеродных материалов. Предназначено для применения в медицине и ветеринарии.

В связи с экологическим неблагополучием окружающей среды и развитием различных инфекционных заболеваний в настоящее время остро стоит проблема сохранения здоровья человека. Поэтому разработка эффективных сорбционных материалов с биоспецифическими свойствами по-прежнему актуальна. Данные материалы могут использоваться в методах сорбционной детоксикации организма: гемосорбции, энтеросорбции, аппликационной сорбции (вульнеросорбции). Известно, что углеродные материалы проявляют высокую сорбционную активность в отношении патогенных микроорганизмов низкой и средней молекулярной массы и вырабатываемых ими токсинов.

Для регулирования адсорбционной способности углеродного сорбента, повышения эффективности биоспецифического действия сорбента необходимо химическое модифицирование его поверхности. В качестве модификаторов применяют биосовместимые нетоксичные вещества, проявляющие активность в отношении патогенной микрофлоры различной природы. Высокое биоспецифическое взаимодействие разрабатываемых материалов с патологическими белками, с клетками патогенных микроорганизмов достигается за счет свойств функциональных групп модификатора и пористой структуры углеродного сорбента.

За последние годы возрос интерес к полимерным материалам, применяемым в качестве модификаторов. Это связано с разработкой пролонгированных лекарственных препаратов на основе полимерных носителей [Landfester К. Miniemulsions for nanoparticle synphesis // Top Curr Chem. - 2003. - Vol.227. - P.75-124; Magdalena Stevanovic′, Ines Bracko, Marina Milenkovic Multifunctional PLGA particles containing poly(L-glutamic acid)-capped silver nanoparticles and ascorbic acid with simultaneous antioxidative and prolonged antimicrobial activity // Acta Biomaterialia 10 (2014) 151-162].

Из полимеров медицинского назначения получают хирургические нити, пленочные материалы как покрытия на раны и ожоги, нетканые материалы, ортопедические термопластичные импланты, пластины, винты, штифты и др. Так, известны композиции и способы получения активированной полимерной наночастицы для целенаправленной доставки лекарственного средства, где наночастица включает биосовместимый полимер, представляющий собой один или несколько сложных полиэфиров, выбранных из группы, содержащей полимолочную кислоту, полигликолевую кислоту, сополимер молочной и гликолевой кислот и их комбинации (патент РФ 2473331).

Гликолевая кислота входит в состав композиций для ухода за полостью рта (патент РФ 2460512) и для изготовления барьерных покрытий в виде несущей полимерной пленки (патент РФ 2435811). Кроме того, гликолевая кислота - антисептическое и дезинфицирующее средство (патент РФ 2359704), используется в косметологии при пилинге для омоложения кожи (патент РФ 2253437).

С целью создания новых материалов проведена модификация полисахарида хитозана прививкой гликолевой кислоты с ее последующей поликонденсацией при термообработке без использования каталитических количеств тяжелых металлов (Богомолова Т.Б., Козлова Н.В., Чвалун С.Н. Модификация хитозана прививкой гликолевой кислоты с ее последующей поликонденсацией в процессе термообработки // Высокомолекулярные соединения, серия Б, 2009. Т.51. №9. С.1695-1703). Данные пленки, синтезированные из сополимера хитозана и полигликолевой кислоты, представляют интерес для медицины в качестве разделительных мембран.

Выбор гликолевой кислоты (ГК) в качестве модификатора обусловлен ее свойствами, отвечающими требованиям медицины: нетоксичность; наличие гидроксильных групп, способных вступать в реакцию поликонденсации с образованием биологически активного полимера (олигомера) с противовоспалительными, антибактериальными свойствами; хорошая растворимость в водных растворах; близкое подобие по химическому составу с биополимерами (например, белками).

Наиболее близким к предлагаемому сорбенту является углеродный сорбент с антибактериальными свойствами в виде гранул округлой формы, который содержит поливинилпирролидон в количестве 4,5-5,5%, характеризуется удельной адсорбционной поверхностью менее 50 м²/г и общим объемом пор менее 0,30 см³/г (патент РФ 2481848, прототип).

Способ получения углеродного сорбента с антибактериальными свойствами включает пропитку гранул углеродного гемосорбента раствором модификатора и высушивание продукта и отличается тем, что пропитку гранул проводят 0,2-1,0% раствором инициатора в N-винилпирролидоне при pH 7,0-7,5, остаточном давлении 15-20 мм рт.ст. и соотношении гемосорбент:раствор инициатора в N-винилпирролидоне 1:1,4-2,0 в течение 15-30 минут с последующим подъемом температуры до 65-75°C, выдержкой при этой температуре в течение 0,5-8 часов в инертной атмосфере и отмывкой в воде от остаточного мономера при комнатной температуре в течение 0,5-2 часов.

Целью изобретения является разработка углеродного сорбента с выраженными антибактериальными и антимикотическими свойствами.

Предлагаемый способ получения углеродного сорбента с антибактериальными и антимикотическими свойствами включает пропитку гранул углеродного гемосорбента 10-50% водным раствором гликолевой кислоты (заполнение пор по влагоемкости, статические условия) в течение 7-9 часов при комнатной температуре, соотношение гемосорбент:раствор ГК составляет 1:1. Затем проводится сушка в течение часа при 100-110°C. Поликонденсация гликолевой кислоты на углеродном сорбенте протекает в 2 этапа: при температуре 185-205°C в течение 1 часа и при температуре 215-235°C - не менее 5 часов.

Предлагаемый модифицированный углеродный сорбент с антибактериальными и антимикотическими свойствами представляет собой гранулы округлой формы, содержит полигликолид в количестве не менее 5%, характеризуется удельной адсорбционной поверхностью не более 250 м²/г и общим объемом пор не более 0,50 см³/г.

Отличительными признаками данного изобретения являются:

- использование в качестве исходного материала углеродного гемосорбента с развитой удельной адсорбционной поверхностью 300-400 м²/г и суммарным объемом пор не менее 0,4 см³/г (ВНИИТУ-1);

- модифицирование поверхности углеродного гемосорбента водным раствором гликолевой кислоты с ее последующей поликонденсацией при термообработке. Процесс модифицирования проводится в несколько стадий:

- пропитка гранул углеродного гемосорбента 10-50% водным раствором гликолевой кислоты в статических условиях в течение 7-9 часов при комнатной температуре, соотношении гемосорбент:раствор ГК 1:1;

- сушка сорбента, пропитанного водным раствором гликолевой кислоты, в течение часа при 100-110°C;

- поликонденсация гликолевой кислоты на углеродном сорбенте в 2 стадии: при температуре 185-205°C в течение 1 часа, при температуре 215-235°C - не менее 5 часов, на песчаной бане.

Модифицирование углеродного гемосорбента по предлагаемому способу модификатором - гликолевой кислотой - с ее последующей поликонденсацией, изменяет как химическую природу поверхности углеродной матрицы, так и его пористую структуру. Результаты, иллюстрирующие изменения параметров пористой структуры и химического состава образцов углеродного сорбента, полученных по прототипу и после модифицирования раствором гликолевой кислоты, в соответствии с примерами настоящего изобретения, приведены в таблице 1.

Основные текстурные характеристики - удельная адсорбционная поверхность, суммарный объем пор и распределение пор по размерам - определены по изотермам адсорбции-десорбции азота, полученным на приборе «Gemini 2380». Расчет величины адсорбционной удельной поверхности проведен по уравнению БЭТ.

На фиг.1(а) представлен ЯМР ¹³С спектр полимера гликолевой кислоты в твердой фазе (получен на спектрометре "Advance-400"). Сигнал с химическим сдвигом 167 м.д. принадлежит карбоксильному углероду полимера. Метиленовые углероды полимера поглощают в области ~60 м.д. Неразрешенный сигнал с химическим сдвигом ~64 м.д. отвечает одной из концевых групп CH₂ полимера, а именно ОСН2СООН. Выбранные условия модифицирования позволяют получить олигомеры (гексамеры) гликолевой кислоты.

На фиг.1(б) представлен ЯМР ¹³С спектр гликолевой кислоты после десорбции с модифицированного сорбента при контакте с 0,9% NaCl в течение 3 часов (1) и 24 часов (2). Согласно результатам после контакта с модифицированным сорбентом в течение суток в раствор переходит менее 0,1% гликолевой кислоты (слабые узкие синглетные пики в области 8 и 4 м.д, относящиеся к гликолевой кислоте, на фоне огромного и широкого пика воды), что доказывает прочное закрепление модификатора (гликолевой кислоты) в пористой структуре сорбента.

Для исследуемых образцов получены термогравиметрические кривые на приборе DTG-60 Н «Shimadzu»: на фиг.2(а) - термограммы немодифицированного сорбента; на фиг.2(б) - сорбента, модифицированного гликолевой кислотой с ее последующей поликонденсацией. В отличие от немодифицированного, для образца сорбента, модифицированного гликолевой кислотой с ее последующей поликонденсацией, присутствует экзоэффект в диапазоне температур 250-320°C. По литературным данным присутствие данного пика на термограмме объясняется разложением и деструкцией нанесенного полимера гликолевой кислоты (Matthias Epple, Oliver Herzberg // J. Appl Biomater. 1998. 43. P 83-88).

Таким образом, комплексом физико-химических методов установлено, что процесс модифицирования углеродного гемосорбента гликолевой кислотой с последующей поликонденсацией приводит к образованию полигликолида на углеродной поверхности. Это обуславливает антибактериальные и антимикотические свойства полученного углеродного сорбента.

Проведены стендовые микробиологические испытания исследуемых образцов модифицированного гемосорбента в Центральной научно-исследовательской лаборатории Государственного бюджетного учреждения высшего профессионального образования Омской государственной медицинской академии Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ЦНИЛ ОмГМА).

Антибактериальные свойства исследуемых образцов изучали по отношению к тест-микроорганизмам грамположительных, грамотрицательных бактерий и к смеси этих культур, предварительно исследованных на устойчивость к антибиотикам в течение времени.

В работе использованы грамположительные тест-микроорганизмы (Staphylococcus aureus, стафилококк золотистый) и грамотрицательные тест-микроорганизмы (Pseudomonas aeruginosa, синегнойная палочка; Klebsiella pneumonia, клебсиелла пневмонии, Escherichia coli, кишечная палочка). Кроме того, исследована смесь испытуемых культур. Все штаммы, выделенные из клинического материала, антибиотикорезистентны.

Антимикотические (противогрибковые) свойства исследуемых образцов изучены по отношению к патогенным дрожжеподобным грибам. Испытуемые грибковые культуры рода Candida: Candida albicans и Candida krusei.

Идентификацию микроорганизмов проводили на тест-системах производства PLIVA - Lachema Diagnostica (Чехия) в компьютерной программе «МИКРОБ Автомат».

Все исследуемые смеси испытуемых культур готовили смешением равных объемов приготовленных рабочих концентраций микробных клеток с перемешиванием. Перемешивание смеси культур осуществляли на вортекс-встряхивателе ELMI.

Рабочее разведение для опыта: бактериальные клетки ~10³ КОЕ (колоний образующих единиц) в 1 мл, культуры рода Candida - 280-360 КОЕ в 1 мл. Контролем служили посевы рабочих разведений испытуемых культур.

Концентрацию микробных клеток устанавливали на приборе для определения мутности суспензий Densi-La-Meter (PLIVA-Lachema, Италия).

Для оценки антибактериального действия углеродных сорбентов использовали метод прямого посева на питательные среды.

Стерилизацию сорбентов перед проведением стендовых медико-биологических испытаний проводили насыщенным паром при избыточном давлении 0,11±0,02 МПа и температуре (121±1)°C в автоклаве.

Пример 1 (прототип)

Навеску гемосорбента массой 1 г пропитывают 1,0% раствором инициатора в N-винилпирролидоне при соотношении гемосорбент:раствор 1,0:1,5 и проводят полимеризацию при температуре 68°C в течение 2 часов в инертной среде с последующей отмывкой и сушкой. Основные характеристики данного образца приведены в табл.1.

Для сорбента, модифицированного данным способом, проводят адсорбцию бактериальных клеток и грибковых микроорганизмов.

К модифицированному сорбенту (в объеме 0,5 мл) добавляют 1 мл микробной взвеси (тест-микроорганизмы), встряхивают на вортекс-встряхивателе (для удаления пузырьков воздуха) и выдерживают в течение суток. Проводят по три параллельных испытания для каждого вида микробных клеток и для смеси микроорганизмов (грамположительные, грамотрицательные бактерии, дрожжеподобные грибы).

По истечении данного времени контакта сорбента с патогенной культурой (24 ч) отбирают надосадочную жидкость в количестве 50 мкл. Затем засевают на стерильные пластины чашек Петри с питательной средой - ГМФ агар (мясопептонный агар) для бактерий, для грибов - «Сабуро».

Засеянные чашки Петри с посевами помещают в CO₂-инкубатор 15АС вверх дном и инкубируют: бактерии при температуре 37±1°C в течение 24±2 часов, дрожжеподобные грибы - 48-72 часа.

Подсчет выросших колоний проводят по трафарету визуально в 5-ти полях по 1 см² с перерасчетом на площадь чашки (диаметр 90 мм). Результат оценивают по количеству колониеобразующих единиц (КОЕ) на поверхности, сопоставляя с контролем (концентрацию устанавливают на приборе для определения мутности). Результат выражают числом колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл исследуемой пробы.

Сорбент, модифицированный данным способом, проявляет антибактериальную активность по отношению к грамположительным бактериям Staphylococcus aureus при времени контакта не менее 6 часов, к грамотрицательным бактериям Ps. aeruginosa, Kleb. Pneumonia - не менее 3 часов, Е. Coli - не менее 6 часов, не проявляет антимикотические свойства по отношению к дрожжеподобным грибам рода Candida. Показано, что по истечении 24 часов количество грибов сопоставимо с контролем (табл.2).

Пример 2

Навеску гемосорбента массой 3 г пропитывают 10% водным раствором ГК при соотношении гемосорбент: раствор ГК 1:1 в течение 8 часов при комнатной температуре, затем сушат пропитанный сорбент в течение 1 часа при температуре 105°C. После сушки проводят поликонденсацию ГК на углеродном сорбенте в две стадии: при температуре 195±5°C в течение 1 часа и при температуре 225±5°C последующие 5 часов, на песчаной бане. Основные характеристики данного образца приведены в табл.1.

Для сорбента, модифицированного данным способом, проводят адсорбцию бактериальных клеток и грибковых микроорганизмов по примеру 1.

Данный модифицированный углеродный сорбент обладает антибактериальным действием по отношению к грамположительным и грамотрицательных монокультурам и их смесям. Антибактериальное действие данного образца отмечается уже после первого часа контакта с микрофлорой. Установлено, что полученный сорбент проявляет и антимикотические свойства по отношению к патогенным дрожжеподобным грибам рода Candida: после взаимодействия с Candida albicans не менее 3 часов рост микроорганизмов на чашках Петри отсутствовал, с Candida krusei - не менее 1 часа (табл.2).

Пример 3

Аналогичен примеру 2, но пропитку проводят в течение 4 часов.

Пример 4

Аналогичен примеру 2, но соотношение гемосорбент:раствор ГК 1,0:0,5.

Пример 5

Аналогичен примеру 2, но поликонденсацию ГК на углеродном сорбенте проводят в одну стадию при температуре 195±5°C в течение 1 часа.

Пример 6

Аналогичен примеру 2, но поликонденсацию ГК на углеродном сорбенте проводят в одну стадию при температуре 175±5°C в течение 5 часов.

Пример 7

Аналогичен примеру 2. Поликонденсацию ГК на углеродном сорбенте проводят в две стадии: при температуре 195±5°C в течение 1 часа и при температуре 225±5°C последующие 2 часа.

Пример 8

Аналогичен примеру 2, но навеску гемосорбента пропитывают 25% водным раствором ГК.

Пример 9

Аналогичен примеру 2, но навеску гемосорбента пропитывают 50% водным раствором ГК.

Как следует из примеров и таблиц, углеродный сорбент, модифицированный гликолевой кислотой с последующей поликонденсацией, обладает антибактериальным действием по отношению к грамположительным и грамотрицательных монокультурам, их смесям. Антибактериальное действие данного образца отмечается уже после первого часа контакта с микрофлорой. Впервые установлены антимикотические свойства углеродного сорбента, модифицированного гликолевой кислотой с последующей поликонденсацией, по отношению к антибиотикорезистентным штаммам патогенных дрожжеподобных грибов рода Candida: Candida albicans и Candida krusei.

Таким образом, разработанный способ модифицирования углеродного сорбента позволяет получить материалы, проявляющие не только антибактериальные, но и антимикотические свойства. Предлагаемый углеродный сорбент представляет интерес для сорбционной медицины при лечении заболеваний: грибковый сепсис (в качестве гемосорбента); грибковые поражения желудочно-кишечного тракта (в качестве энтеросорбента); гнойно-септические заболевания, связанные с накоплением патогенных культур в акушерстве и гинекологии (в качестве аппликаторов).