×
27.01.2015
216.013.20bf

Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОДГОТОВКИ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР В ВИДЕ СФЕРОИДОВ ДЛЯ ФОРМИРОВАНИЯ БИОИНЖЕНЕРНОЙ КОНСТРУКЦИИ ПЕРЕДНИХ СЛОЕВ ИСКУССТВЕННОЙ РОГОВИЦЫ

Вид РИД

Изобретение

Аннотация: Изобретение относится к области медицины, офтальмологии и биотехнологии. Предложен способ подготовки клеточных культур в виде сфероидов для формирования передних слоев искусственной роговицы, включающий использование кусочков лимба. Изобретение может использоваться для конструирования передних слоев искусственной роговицы с целью компенсации поврежденных тканей роговицы глаза. 1 пр.
Основные результаты: Способ подготовки клеточных культур в виде сфероидов для формирования передних слоев искусственной роговицы, включающий изолирование кусочков лимба, перенос в чашки Петри в раствор Хенкса с антибиотиками, тщательное отмывание, механическое измельчение с помощью ножниц, ферментативную диссоциацию в 0,25% растворе трипсина, центрифугирование, высевание в пластиковые чашки Петри в плотности 100000 клеток/мл в среду, из расчета на 1000 мл раствора, следующего состава: DMEM 445 мл; F12 445 мл; L-глютамин 1,5 г; пенициллин 250000 международных единиц; стрептомицин 200,0 мг; инсулин-трансферрин-селенит ×100 10 мл; сыворотка крови эмбрионов коров 100 мл, культивирование со сменой среды каждые 2-3 дня, снятие с чашек Петри после второго пассажа клеток с помощью растворов версена и 0,25%-ного трипсина, центрифугирование, высевание в концентрации 300000 клеток/мл на агарозные планшеты, помещение в лунки 12-луночных культуральных планшетов в полной ростовой среде, культивирование в термостатируемой камере прибора Cell-IQ при температуре 37°C и 5% CO, заселение тканевых матриксов 7-дневными сфероидами из стволовых эпителиоидных и мезенхимальных клеток лимбальной зоны глазного яблока, снятие клеток с подложки с использованием растворов версена и 0,25%-ного трипсина, центрифугирование, ресуспендирование, доведение до концентрации 600000 клеток в 200 мкл среды и помещение на тканевые матриксы, помещение в термостатируемую камеру прибора Cell-IQ и культивирование при температуре 37°C и 5% CO.

Изобретение относится к области медицины, в частности к офтальмологии, и может быть использовано для формирования биоинженерной конструкции передних слоев искусственной роговицы на основе тканевого матрикса и культивированных клеток лимбальной зоны глазного яблока.

Разработки в области создания биоинженерных конструкций искусственной роговицы являются одними из самых перспективных для решения проблемы дефицита донорских роговиц. Материал для создания биоинженерных конструкций тканевых матриц искусственных роговиц должен обладать прозрачностью, биосовместимостью, биоинертностью, адгезивностью, заданной стабильностью к биодеградации, иметь определенную пористость, высокую прочность на разрыв и эластичность.

Помимо выбора каркасной биополимерной конструкции, существует проблема ее заполнения клеточными элементами. Лимбальная зона глазного яблока является источником стволовых/прогениторных эпителиоидных и мезенхимальных клеток роговицы. Однако они, при длительном культивировании в монослое, меняют свой фенотип, теряют функциональные характеристики и становятся неспособными к заселению трехмерного матрикса. В настоящее время клеточные технологии находятся на этапе перехода на 3D культивирование. Технология культивирования 3D сфероидов из клеток лимбальной зоны трупного глаза человека позволяет длительно и полноценно сохранять фенотип и функциональные свойства специализированных клеток роговицы и может быть использована для создания биоинженерной конструкции передних слоев искусственной роговицы на базе тканевого матрикса из спидроина.

Авторам не известны аналоги способов подготовки клеточных культур в виде сфероидов для формирования передних слоев искусственной роговицы.

Задачей изобретения является способ подготовки клеточных культур в виде сфероидов для формирования передних слоев искусственной роговицы, созданной на основе тканевого матрикса и функционально дифференцированных клеток.

Техническим результатом, достигаемым при использовании изобретения, является возможность использования технологии 3D культивирования стромальных и эпителиоидных клеток лимбальной зоны на основе сфероидных технологий для конструирования передних слоев искусственной роговицы, с целью полной или частичной компенсации поврежденных тканей роговицы.

Технический результат достигается тем, что в способе подготовки клеточных культур в виде сфероидов для формирования передних слоев искусственной роговицы, изолированные кусочки лимба переносятся в чашки Петри диаметром 100 мм в раствор Хенкса (NaCl 80,0 г/л, KCl 4,0 г/л, MgSO4×7H2O 1,0 г/л, MgCl2×6H2O 1,0 г/л, Na2HPO4×7H2O 0,9 г/л, KH2PO4 0,6 г/л, глюкоза 10,0 г/л, CaCl2 1,4 г/л, феноловый красный 2,0 г/л) с антибиотиками (пенициллин 250000 международных единиц и стрептомицин 200,0 мг), тщательно отмываются, механически измельчаются с помощью ножниц, ферментативно диссоциируются в 0,25% растворе трипсина, центрифугируются, высеваются в пластиковые чашки Петри в высокой плотности (100000 клеток/мл) в полную ростовую среду следующего состава: DMEM 445 мл; F12 445 мл; L-глютамин 1,5 г; пенициллин 250000 международных единиц; стрептомицин 200,0 мг; инсулин-трансферрин-селенит ×100 10 мл; сыворотка крови эмбрионов коров 100 мл (из расчета на 1000 мл раствора), культивируются со сменой среды каждые 2-3 дня, после второго пассажа клетки снимаются с чашек Петри с помощью растворов версена (натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты) и 0,25%-ного трипсина, центрифугируются, высеваются в концентрации 300000 клеток/мл на агарозные планшеты, помещенные в лунки 12-луночных культуральных планшетов в полной ростовой среде, культивируются в термостатируемой камере прибора Cell-IQ (Chip Man Technologies, Финляндия) в стандартных условиях (37°C, 5% CO2), тканевые матриксы заселяются 7-дневными сфероидами, сфероиды снимаются с агарозных планшетов полной ростовой средой, пассивно осаждаются в центрифужных пробирках по 15 мл, ресуспендируются в 200 мкл той же среды, переносятся по 300 единиц на тканевые матриксы, через 30 мин в лунки планшетов с клетками добавляется полная ростовая среда до 1 мл, накрываются планшеты специальной крышкой и помещаются в термостатируемую камеру прибора Cell-IQ (Chip Man Technologies, Финляндия) и культивируются в стандартных условиях (37°C, 5% CO2).

Изобретение поясняется следующим примером.

Пример

Первичные культуры эпителиоидных и стромальных клеток получали из тканевых сегментов лимба трупного глаза человека. Изолированные кусочки лимба переносили в 100 мм чашки Петри в раствор Хенкса (NaCl 80,0 г/л, KCl 4,0 г/л, MgSO4×7H2O 1,0 г/л, MgCl2×6H2O 1,0 г/л, Na2HPO4×7H2O 0,9 г/л, KH2PO4 0,6 г/л, глюкоза 10,0 г/л, CaCl2 1,4 г/л, феноловый красный 2,0 г/л) с антибиотиками (пенициллин 250000 международных единиц и стрептомицин 200,0 мг), тщательно отмывали, механически измельчали с помощью ножниц и ферментативно диссоциировали в 0,25% растворе трипсина (ПанЭко, Россия). После фильтрации клетки центрифугировали (8 мин, g=100 см2/с) и высевали в пластиковые чашки Петри в высокой плотности (100000 клеток/мл) в полную ростовую среду (на 1000 мл раствора: DMEM 445 мл; F12 445 мл; L-глютамин 1,5 г; пенициллин 250000 международных единиц; стрептомицин 200,0 мг; инсулин-трансферрин-селенит ×100 10 мл; сыворотка крови эмбрионов коров (HyClone, США) 100 мл). Культивировали в CO2 - инкубаторе при 5% CO2 и 37°C со сменой среды каждые 2-3 дня, после второго пассажа снимали с чашек Петри с помощью растворов версена (натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты) и 0,25%-ного трипсина, центрифугировали (7 мин, g=100 см2/с) и высевали в концентрации 300000 клеток/мл на агарозные планшеты (MicrotissuesTM, США), помещенные в лунки 12-луночных культуральных планшетов (Corning, США) в полной ростовой среде. Культивировали в термостатируемой камере прибора Cell-IQ (Chip Man Technologies, Финляндия) в стандартных условиях (37°C, 5% CO2).

Для подсчета количества клеток и их жизнеспособности использовали автоматический счетчик клеток Countess (Invitrogen, США).

Для заселения тканевых матриксов использовали 7-дневные сфероиды из стволовых/прогениторных эпителиоидных и мезенхимальных клеток лимбальной зоны глазного яблока. Сфероиды снимали с агарозных планшетов полной ростовой средой, пассивно осаждали в центрифужных пробирках по 15 мл, ресуспендировали в 200 мкл той же среды, переносили по 300 единиц на тканевые матриксы. Через 30 мин в лунки планшетов с клетками добавляли полную ростовую среду до 1 мл, накрывали планшеты специальной крышкой, помещали в термостатируемую камеру прибора Cell-IQ (Chip Man Technologies, Финляндия) и культивировали в стандартных условиях (37°C, 5% CO2).

Таким образом, предлагаемое изобретение позволяет использовать технологию 3D культивирования стволовых/прогениторных эпителиоидных и мезенхимальных клеток лимбальной зоны глазного яблока на основе сфероидных технологий для конструирования передних слоев искусственной роговицы с целью полной или частичной компенсации поврежденных тканей роговицы.

Способ подготовки клеточных культур в виде сфероидов для формирования передних слоев искусственной роговицы, включающий изолирование кусочков лимба, перенос в чашки Петри в раствор Хенкса с антибиотиками, тщательное отмывание, механическое измельчение с помощью ножниц, ферментативную диссоциацию в 0,25% растворе трипсина, центрифугирование, высевание в пластиковые чашки Петри в плотности 100000 клеток/мл в среду, из расчета на 1000 мл раствора, следующего состава: DMEM 445 мл; F12 445 мл; L-глютамин 1,5 г; пенициллин 250000 международных единиц; стрептомицин 200,0 мг; инсулин-трансферрин-селенит ×100 10 мл; сыворотка крови эмбрионов коров 100 мл, культивирование со сменой среды каждые 2-3 дня, снятие с чашек Петри после второго пассажа клеток с помощью растворов версена и 0,25%-ного трипсина, центрифугирование, высевание в концентрации 300000 клеток/мл на агарозные планшеты, помещение в лунки 12-луночных культуральных планшетов в полной ростовой среде, культивирование в термостатируемой камере прибора Cell-IQ при температуре 37°C и 5% CO, заселение тканевых матриксов 7-дневными сфероидами из стволовых эпителиоидных и мезенхимальных клеток лимбальной зоны глазного яблока, снятие клеток с подложки с использованием растворов версена и 0,25%-ного трипсина, центрифугирование, ресуспендирование, доведение до концентрации 600000 клеток в 200 мкл среды и помещение на тканевые матриксы, помещение в термостатируемую камеру прибора Cell-IQ и культивирование при температуре 37°C и 5% CO.
Источник поступления информации: Роспатент

Показаны записи 41-50 из 198.
10.09.2014
№216.012.f286

Способ микроинвазивной непроникающей глубокой склерэктомии при открытоугольной глаукоме

Изобретение относится к офтальмологии и может быть применимо для хирургического лечения открытоугольной глаукомы. Выкраивают под конъюнктивальным лоскутом поверхностный склеральный лоскут с заходом в прозрачные слои роговицы, поверхностный склеральный лоскут имеет форму трапеции, с большим...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002527908
Дата охранного документа: 10.09.2014
10.09.2014
№216.012.f289

Способ осуществления тоннельного разреза для факоэмульсификации

Изобретение относится к офтальмохирургии и может быть применимо для осуществления тоннельного разреза для факоэмульсификации. Вход в переднюю камеру осуществляют бесступенчато под углом 15-30 градусов путем прокола шириной 1,8-2 мм, затем расширяют прокол конъюнктивально-тенонового комплекса в...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002527911
Дата охранного документа: 10.09.2014
20.09.2014
№216.012.f560

Роговичный сегмент для лечения кератэктазий различного генеза

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологической хирургии, и может быть использовано для лечения кератэктазий различного генеза методом полимерной кератопластики с имплантацией роговичных сегментов (PC). Для этого РС выполняют как единое целое из оптически прозрачного...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002528649
Дата охранного документа: 20.09.2014
20.09.2014
№216.012.f561

Способ хирургического замещения множественных, тотальных и обширных кожных дефектов век, распространяющихся на окружающие зоны лица

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии и пластической хирургии, и может быть использовано для хирургического замещения множественных, тотальных и обширных кожных дефектов век, распространяющихся на окружающие зоны лица. Для этого иссекают патологически измененные и рубцовые...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002528650
Дата охранного документа: 20.09.2014
27.09.2014
№216.012.f856

Способ фиксации мягкой интраокулярной линзы при отсутствии капсулярной поддержки

Изобретение относится к офтальмологии и может быть применимо для фиксации моноблочной S-образной мягкой интраокулярной линзы. Перед имплантацией по меридиану на 6-и часах проводится дополнительный парацентез 1,1 мм. После имплантации один опорный элемент линзы ущемляется в операционной ране,...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002529411
Дата охранного документа: 27.09.2014
27.09.2014
№216.012.f9ce

Офтальмологический ирригационный раствор

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и представляет собой ирригационный раствор, включающий хлорид натрия, одно- и двузамещенный фосфат натрия, гликозаминогликаны, глюкозу или ее производные, водорастворимую целлюлозу или ее производные, нейраминовую кислоту,...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002529787
Дата охранного документа: 27.09.2014
10.10.2014
№216.012.fd8e

Способ микроинвазивной непроникающей глубокой склерэктомии при открытоугольной гаукоме

Изобретение относится к медицине, а именно к хирургической офтальмологии, и может быть использовано для хирургического лечения открытоугольной глаукомы. Для этого проводят конъюнктивальный разрез у лимба на расстоянии 2 мм от него, длиной 2 мм. Выкраивают поверхностный склеральный лоскут. Затем...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002530756
Дата охранного документа: 10.10.2014
10.10.2014
№216.012.fd92

Способ проведения микроинвазивной непроникающей глубокой склерэктомии

Изобретение относится к офтальмологии и может быть применимо для проведения микроинвазивной непроникающей глубокой склерэктомии. Конъюнктивальный разрез формируют Г-образной формы, начиная его по нормали к лимбу на 11 часах длиной 1 мм, далее продлевают его вдоль лимба длиной 2-3 мм....
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002530760
Дата охранного документа: 10.10.2014
20.10.2014
№216.012.fefd

Способ лечения вторичной глаукомы, вызванной эмульгированием силикона

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологической хирургии, и может быть использовано для лечения вторичной глаукомы, вызванной эмульгированием силикона после проведения субтотальной витрэктомии с введением силиконового масла при отслойки сетчатки. Для этого формируют...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002531133
Дата охранного документа: 20.10.2014
20.10.2014
№216.012.feff

Способ прогнозирования максимальной величины суточных колебаний внутриглазного давления у пациентов с глазными проявлениями псевдоэксфолиативного синдрома

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и предназначено для прогнозирования максимальной величины суточных колебаний внутриглазного давления (ВГД) у пациентов с глазными проявлениями псевдоэксфолиативного синдрома (ПЭС). Определяют стадию ПЭС на глазу. Измеряют уровень ВГД и...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002531135
Дата охранного документа: 20.10.2014
Показаны записи 41-50 из 222.
10.08.2014
№216.012.e8c5

Устройство для ирригации

Изобретение относится к области офтальмохирургии. Инструмент офтальмомикрохирургический содержит корпус с ирригационным отверстием. Торцевая поверхность дистальной части корпуса снабжена по крайней мере тремя упорами, симметричными относительно продольной оси. Причем два из них лежат под...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002525382
Дата охранного документа: 10.08.2014
20.08.2014
№216.012.e938

Способ медикаментозного расширения ригидного зрачка перед проведением факоэмульсификации

Изобретение относится к медицине, в частности к офтальмологии, и может быть использовано для медикаментозного расширения ригидного зрачка в хирургическом лечении катаракты перед проведением факоэмульсификации. Для этого в область лимба на границе непрозрачной и прозрачной части роговицы...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002525512
Дата охранного документа: 20.08.2014
20.08.2014
№216.012.e9a8

Способ пластики экстраокулярных мышц с усилением методом компрессии

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологической хирургии, и может быть использовано при лечении косоглазия. Для этого проводят конъюнктивальный разрез. Выделяют прямую глазодвигательную мышцу для усиления. Участок этой мышцы, подвергаемый пластике, отсепаровывают. Затем...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002525624
Дата охранного документа: 20.08.2014
20.08.2014
№216.012.e9b7

Способ формирования опорно-двигательной культи для ношения глазного косметического протеза после энуклеации у детей дошкольного и младшего школьного возраста

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии и пластической хирургии. Удаляют глазное яблоко, осуществляют имплантацию орбитального имплантата с фиксацией выступающего цилиндра к мягким тканям в области вершины орбиты. Фиксируют прямые глазодвигательные мышцы к эндопротезу,...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002525639
Дата охранного документа: 20.08.2014
20.08.2014
№216.012.e9c9

Инструмент для проведения офтальмомикрохирургических операций

Изобретение относится к области медицинской технике. Инструмент для проведения офтальмомикрохирургических операций содержит рукоятку и рабочую часть. Рабочая часть выполнена в виде двух поверхностей с огибающей одной стороны в виде кривой наискорейшего спуска и с противоположной стороны кривой...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002525657
Дата охранного документа: 20.08.2014
20.08.2014
№216.012.ecfc

Способ хирургической коррекции пресбиопии в сочетании с простым гиперметропическим астигматизмом с сохранением асферичности поверхности роговицы

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и может быть использовано для коррекции пресбиопии в сочетании с простым гиперметропическим астигматизмом с сохранением асферичности поверхности роговицы. Для этого на роговицу глаза воздействуют излучением эксимерного лазера с длиной...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002526476
Дата охранного документа: 20.08.2014
27.08.2014
№216.012.ee86

Способ кератопротезирования сосудистых неравномерных бельм

Изобретение относится к офтальмологии и может быть применимо для кератопротезирования сосудистых неравномерных бельм. Выкраивают лоскут аутослизистой с губы округлой формы, превышающий диаметр роговицы на 4 мм. Перемещают лоскут аутослизистой с губы на поверхность бельма, предварительно удалив...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002526881
Дата охранного документа: 27.08.2014
10.09.2014
№216.012.f1f9

Вискоэластичный раствор для контрастирования задней гиалоидной мембраны

Изобретение относится к области медицины, а именно к офтальмологии, и предназначено для применения в хирургии стекловидного тела. Вискоэластичный раствор для контрастирования задней гиалоидной мембраны содержит краситель, метилцеллюлозу, гиалуроновую кислоту, поливинилпирролидон низкой...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002527767
Дата охранного документа: 10.09.2014
10.09.2014
№216.012.f24b

Искусственный имплантат

Изобретение относится к области офтальмомикрохирургии. Искусственный имплантат глаза содержит оптическую часть, состоящую из трех последовательно соединенных между собой оптических элементов. Первый оптический элемент представляет собой первую плосковыпуклую линзу. Второй оптический элемент...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002527849
Дата охранного документа: 10.09.2014
10.09.2014
№216.012.f284

Способ определения оптической силы интраокулярной линзы с внутрикапсульной фиксацией, имплантируемой в авитреальный глаз

Изобретение относится к области офтальмохирургии. Способ включает измерение длины глаза, радиуса кривизны передней поверхности роговицы, рефракции роговицы и константы А интраокулярной линзы. Дополнительно измеряют акустическую плотность стекловидного тела, а оптическую силу интраокулярной...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002527906
Дата охранного документа: 10.09.2014
+ добавить свой РИД