×
27.01.2015
216.013.20bf

Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОДГОТОВКИ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР В ВИДЕ СФЕРОИДОВ ДЛЯ ФОРМИРОВАНИЯ БИОИНЖЕНЕРНОЙ КОНСТРУКЦИИ ПЕРЕДНИХ СЛОЕВ ИСКУССТВЕННОЙ РОГОВИЦЫ

Вид РИД

Изобретение

Аннотация: Изобретение относится к области медицины, офтальмологии и биотехнологии. Предложен способ подготовки клеточных культур в виде сфероидов для формирования передних слоев искусственной роговицы, включающий использование кусочков лимба. Изобретение может использоваться для конструирования передних слоев искусственной роговицы с целью компенсации поврежденных тканей роговицы глаза. 1 пр.
Основные результаты: Способ подготовки клеточных культур в виде сфероидов для формирования передних слоев искусственной роговицы, включающий изолирование кусочков лимба, перенос в чашки Петри в раствор Хенкса с антибиотиками, тщательное отмывание, механическое измельчение с помощью ножниц, ферментативную диссоциацию в 0,25% растворе трипсина, центрифугирование, высевание в пластиковые чашки Петри в плотности 100000 клеток/мл в среду, из расчета на 1000 мл раствора, следующего состава: DMEM 445 мл; F12 445 мл; L-глютамин 1,5 г; пенициллин 250000 международных единиц; стрептомицин 200,0 мг; инсулин-трансферрин-селенит ×100 10 мл; сыворотка крови эмбрионов коров 100 мл, культивирование со сменой среды каждые 2-3 дня, снятие с чашек Петри после второго пассажа клеток с помощью растворов версена и 0,25%-ного трипсина, центрифугирование, высевание в концентрации 300000 клеток/мл на агарозные планшеты, помещение в лунки 12-луночных культуральных планшетов в полной ростовой среде, культивирование в термостатируемой камере прибора Cell-IQ при температуре 37°C и 5% CO, заселение тканевых матриксов 7-дневными сфероидами из стволовых эпителиоидных и мезенхимальных клеток лимбальной зоны глазного яблока, снятие клеток с подложки с использованием растворов версена и 0,25%-ного трипсина, центрифугирование, ресуспендирование, доведение до концентрации 600000 клеток в 200 мкл среды и помещение на тканевые матриксы, помещение в термостатируемую камеру прибора Cell-IQ и культивирование при температуре 37°C и 5% CO.

Изобретение относится к области медицины, в частности к офтальмологии, и может быть использовано для формирования биоинженерной конструкции передних слоев искусственной роговицы на основе тканевого матрикса и культивированных клеток лимбальной зоны глазного яблока.

Разработки в области создания биоинженерных конструкций искусственной роговицы являются одними из самых перспективных для решения проблемы дефицита донорских роговиц. Материал для создания биоинженерных конструкций тканевых матриц искусственных роговиц должен обладать прозрачностью, биосовместимостью, биоинертностью, адгезивностью, заданной стабильностью к биодеградации, иметь определенную пористость, высокую прочность на разрыв и эластичность.

Помимо выбора каркасной биополимерной конструкции, существует проблема ее заполнения клеточными элементами. Лимбальная зона глазного яблока является источником стволовых/прогениторных эпителиоидных и мезенхимальных клеток роговицы. Однако они, при длительном культивировании в монослое, меняют свой фенотип, теряют функциональные характеристики и становятся неспособными к заселению трехмерного матрикса. В настоящее время клеточные технологии находятся на этапе перехода на 3D культивирование. Технология культивирования 3D сфероидов из клеток лимбальной зоны трупного глаза человека позволяет длительно и полноценно сохранять фенотип и функциональные свойства специализированных клеток роговицы и может быть использована для создания биоинженерной конструкции передних слоев искусственной роговицы на базе тканевого матрикса из спидроина.

Авторам не известны аналоги способов подготовки клеточных культур в виде сфероидов для формирования передних слоев искусственной роговицы.

Задачей изобретения является способ подготовки клеточных культур в виде сфероидов для формирования передних слоев искусственной роговицы, созданной на основе тканевого матрикса и функционально дифференцированных клеток.

Техническим результатом, достигаемым при использовании изобретения, является возможность использования технологии 3D культивирования стромальных и эпителиоидных клеток лимбальной зоны на основе сфероидных технологий для конструирования передних слоев искусственной роговицы, с целью полной или частичной компенсации поврежденных тканей роговицы.

Технический результат достигается тем, что в способе подготовки клеточных культур в виде сфероидов для формирования передних слоев искусственной роговицы, изолированные кусочки лимба переносятся в чашки Петри диаметром 100 мм в раствор Хенкса (NaCl 80,0 г/л, KCl 4,0 г/л, MgSO4×7H2O 1,0 г/л, MgCl2×6H2O 1,0 г/л, Na2HPO4×7H2O 0,9 г/л, KH2PO4 0,6 г/л, глюкоза 10,0 г/л, CaCl2 1,4 г/л, феноловый красный 2,0 г/л) с антибиотиками (пенициллин 250000 международных единиц и стрептомицин 200,0 мг), тщательно отмываются, механически измельчаются с помощью ножниц, ферментативно диссоциируются в 0,25% растворе трипсина, центрифугируются, высеваются в пластиковые чашки Петри в высокой плотности (100000 клеток/мл) в полную ростовую среду следующего состава: DMEM 445 мл; F12 445 мл; L-глютамин 1,5 г; пенициллин 250000 международных единиц; стрептомицин 200,0 мг; инсулин-трансферрин-селенит ×100 10 мл; сыворотка крови эмбрионов коров 100 мл (из расчета на 1000 мл раствора), культивируются со сменой среды каждые 2-3 дня, после второго пассажа клетки снимаются с чашек Петри с помощью растворов версена (натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты) и 0,25%-ного трипсина, центрифугируются, высеваются в концентрации 300000 клеток/мл на агарозные планшеты, помещенные в лунки 12-луночных культуральных планшетов в полной ростовой среде, культивируются в термостатируемой камере прибора Cell-IQ (Chip Man Technologies, Финляндия) в стандартных условиях (37°C, 5% CO2), тканевые матриксы заселяются 7-дневными сфероидами, сфероиды снимаются с агарозных планшетов полной ростовой средой, пассивно осаждаются в центрифужных пробирках по 15 мл, ресуспендируются в 200 мкл той же среды, переносятся по 300 единиц на тканевые матриксы, через 30 мин в лунки планшетов с клетками добавляется полная ростовая среда до 1 мл, накрываются планшеты специальной крышкой и помещаются в термостатируемую камеру прибора Cell-IQ (Chip Man Technologies, Финляндия) и культивируются в стандартных условиях (37°C, 5% CO2).

Изобретение поясняется следующим примером.

Пример

Первичные культуры эпителиоидных и стромальных клеток получали из тканевых сегментов лимба трупного глаза человека. Изолированные кусочки лимба переносили в 100 мм чашки Петри в раствор Хенкса (NaCl 80,0 г/л, KCl 4,0 г/л, MgSO4×7H2O 1,0 г/л, MgCl2×6H2O 1,0 г/л, Na2HPO4×7H2O 0,9 г/л, KH2PO4 0,6 г/л, глюкоза 10,0 г/л, CaCl2 1,4 г/л, феноловый красный 2,0 г/л) с антибиотиками (пенициллин 250000 международных единиц и стрептомицин 200,0 мг), тщательно отмывали, механически измельчали с помощью ножниц и ферментативно диссоциировали в 0,25% растворе трипсина (ПанЭко, Россия). После фильтрации клетки центрифугировали (8 мин, g=100 см2/с) и высевали в пластиковые чашки Петри в высокой плотности (100000 клеток/мл) в полную ростовую среду (на 1000 мл раствора: DMEM 445 мл; F12 445 мл; L-глютамин 1,5 г; пенициллин 250000 международных единиц; стрептомицин 200,0 мг; инсулин-трансферрин-селенит ×100 10 мл; сыворотка крови эмбрионов коров (HyClone, США) 100 мл). Культивировали в CO2 - инкубаторе при 5% CO2 и 37°C со сменой среды каждые 2-3 дня, после второго пассажа снимали с чашек Петри с помощью растворов версена (натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты) и 0,25%-ного трипсина, центрифугировали (7 мин, g=100 см2/с) и высевали в концентрации 300000 клеток/мл на агарозные планшеты (MicrotissuesTM, США), помещенные в лунки 12-луночных культуральных планшетов (Corning, США) в полной ростовой среде. Культивировали в термостатируемой камере прибора Cell-IQ (Chip Man Technologies, Финляндия) в стандартных условиях (37°C, 5% CO2).

Для подсчета количества клеток и их жизнеспособности использовали автоматический счетчик клеток Countess (Invitrogen, США).

Для заселения тканевых матриксов использовали 7-дневные сфероиды из стволовых/прогениторных эпителиоидных и мезенхимальных клеток лимбальной зоны глазного яблока. Сфероиды снимали с агарозных планшетов полной ростовой средой, пассивно осаждали в центрифужных пробирках по 15 мл, ресуспендировали в 200 мкл той же среды, переносили по 300 единиц на тканевые матриксы. Через 30 мин в лунки планшетов с клетками добавляли полную ростовую среду до 1 мл, накрывали планшеты специальной крышкой, помещали в термостатируемую камеру прибора Cell-IQ (Chip Man Technologies, Финляндия) и культивировали в стандартных условиях (37°C, 5% CO2).

Таким образом, предлагаемое изобретение позволяет использовать технологию 3D культивирования стволовых/прогениторных эпителиоидных и мезенхимальных клеток лимбальной зоны глазного яблока на основе сфероидных технологий для конструирования передних слоев искусственной роговицы с целью полной или частичной компенсации поврежденных тканей роговицы.

Способ подготовки клеточных культур в виде сфероидов для формирования передних слоев искусственной роговицы, включающий изолирование кусочков лимба, перенос в чашки Петри в раствор Хенкса с антибиотиками, тщательное отмывание, механическое измельчение с помощью ножниц, ферментативную диссоциацию в 0,25% растворе трипсина, центрифугирование, высевание в пластиковые чашки Петри в плотности 100000 клеток/мл в среду, из расчета на 1000 мл раствора, следующего состава: DMEM 445 мл; F12 445 мл; L-глютамин 1,5 г; пенициллин 250000 международных единиц; стрептомицин 200,0 мг; инсулин-трансферрин-селенит ×100 10 мл; сыворотка крови эмбрионов коров 100 мл, культивирование со сменой среды каждые 2-3 дня, снятие с чашек Петри после второго пассажа клеток с помощью растворов версена и 0,25%-ного трипсина, центрифугирование, высевание в концентрации 300000 клеток/мл на агарозные планшеты, помещение в лунки 12-луночных культуральных планшетов в полной ростовой среде, культивирование в термостатируемой камере прибора Cell-IQ при температуре 37°C и 5% CO, заселение тканевых матриксов 7-дневными сфероидами из стволовых эпителиоидных и мезенхимальных клеток лимбальной зоны глазного яблока, снятие клеток с подложки с использованием растворов версена и 0,25%-ного трипсина, центрифугирование, ресуспендирование, доведение до концентрации 600000 клеток в 200 мкл среды и помещение на тканевые матриксы, помещение в термостатируемую камеру прибора Cell-IQ и культивирование при температуре 37°C и 5% CO.
Источник поступления информации: Роспатент

Показаны записи 171-180 из 198.
13.01.2017
№217.015.69da

Способ прогнозирования эффективности лазерной реконструкции зоны антиглаукоматозной операции непроникающего типа при ее блокаде корнем радужки

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и может быть использовано для прогнозирования эффективности лазерной реконструкции зоны антиглаукоматозной операции (АГО) непроникающего типа. Проводят УБМ зоны операции с определением акустической плотности (АП) структур путей оттока....
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002591666
Дата охранного документа: 20.07.2016
13.01.2017
№217.015.6ebf

Способ определения показаний к проведению однопортовой локальной витрэктомии

Изобретение относится к области медицины, а именно к офтальмологии. Для определения показаний к проведению однопортовой локальной витрэктомии у пациентов с регматогенной отслойкой сетчатки и наличием локального тракционного синдрома перед операцией методом биометрии определяют длину глаза в мм,...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002597568
Дата охранного документа: 10.09.2016
13.01.2017
№217.015.6edc

Способ прогнозирования безопасного положения переднекамерной факичной интраокулярной линзы модели cachet

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и может быть использовано для прогнозирования безопасного положения переднекамерной факичной интраокулярной линзы (ФИОЛ) модели Cachet. С помощью оптической когерентной томографии (ОКТ) переднего отрезка глаза определяют диаметр...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002597569
Дата охранного документа: 10.09.2016
13.01.2017
№217.015.6f6d

Способ прогнозирования анатомического результата лечения идиопатического макулярного разрыва

Изобретение относится к области медицины, а именно к офтальмологии. Для прогнозирования анатомического результата лечения идиопатического макулярного разрыва (ИМП) до операции определяют среднюю толщину сетчатки в фовеальной зоне с помощью спектральной оптической когерентной томографии. При...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002597571
Дата охранного документа: 10.09.2016
13.01.2017
№217.015.6f7d

Способ определения концентрации и объема газовой тампонады однопортовой локальной витрэктомии

Изобретение относится к области медицины, а именно к офтальмологии. Для определения концентрации и объема воздушно-газовой тампонады при однопортовой локальной витрэктомии у пациентов с регматогенной отслойкой сетчатки и наличием локального тракционного синдрома перед операцией измеряют методом...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002597567
Дата охранного документа: 10.09.2016
13.01.2017
№217.015.7055

Определение дифференцированных показаний к выбору метода лечения кератоконуса ii-iii стадий

Изобретение относится к медицине, а более конкретно к офтальмологии, и может быть использовано для проведения патогенетически обоснованного лечения кератоконуса II и III стадии по классификации Amsler. Проводят предоперационное исследование, определение характера течения заболевания и...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002596729
Дата охранного документа: 10.09.2016
13.01.2017
№217.015.7a5c

Способ определения оптимального объема однопортовой локальной витрэктомии

Изобретение относится к области медицины, а именно к офтальмологии. Для определения оптимального объема проведения однопортовой локальной витрэктомии у пациентов с регматогенной отслойкой сетчатки и наличием локального тракционного синдрома перед операцией методом обратной офтальмоскопии...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002600146
Дата охранного документа: 20.10.2016
13.01.2017
№217.015.7b13

Способ хирургического лечения пациентов с сочетанной патологией переднего отрезка глазного яблока: аниридией, помутнением роговицы различной степени выраженности, патологией хрусталика и его связочного аппарата

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и может быть использовано для хирургического лечения врожденной и травматической аниридии, сочетанной с помутнением роговицы различной степени выраженности и катарактой. С помощью фемтосекундного лазера проводят несквозной круговой...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002600149
Дата охранного документа: 20.10.2016
13.01.2017
№217.015.7b2c

Способ трансплантации десцеметовой мембраны

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и может быть использовано для хирургического лечения первичной и вторичной эндотелиальной дистрофии роговицы. Десцеметовую мембрану (ДМ) донора отсепаровывают от стромы по выполненной циркулярной насечке на 1-2 мм к центру....
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002600158
Дата охранного документа: 20.10.2016
13.01.2017
№217.015.7b56

Способ лазерного лечения резистентных форм ретинобластомы у детей

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и предназначено для лечения резистентных очагов ретинобластомы у детей, расположенных преимущественно в центральных отделах глазного дна. Воздействуют транспупиллярно на резистентные очаги диодным лазером с длиной волны 810 нм....
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002600145
Дата охранного документа: 20.10.2016
Показаны записи 171-180 из 222.
10.05.2016
№216.015.3da1

Способ хирургического лечения макулярного разрыва, осложненного отслойкой сетчатки

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и может быть использовано для хирургического лечения макулярного разрыва, осложненного отслойкой сетчатки. После витрэктомии и удаления задней гиалоидной мембраны вводят ПФОС в полость стекловидного тела до экватора, затем в 2,0-2,5 мм...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002583597
Дата охранного документа: 10.05.2016
10.05.2016
№216.015.3db7

Способ доставки лекарственных веществ к структурам заднего сегмента глазного яблока

Изобретение относится к медицине, в частности к офтальмологии, и может быть использовано для доставки лекарственных веществ к структурам заднего сегмента глазного яблока. Производят сквозной прокол оболочек глазного яблока портом 27G на расстоянии 4,0 мм от лимба в направлении к экватору...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002583599
Дата охранного документа: 10.05.2016
20.05.2016
№216.015.3fbb

Способ лечения кератоконуса и миопии высокой степени с тонкой роговицей

Изобретение относится к медицине, а именно в офтальмологии, и предназначено для лечения кератоконуса и миопии высокой степени с тонкой роговицей. Фемтосекундным лазером выполняют интрастромальный тоннель в форме кольца внутренним диаметром 3-5 мм, наружным 7-9 мм на глубине 250-350 мкм. В...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002584087
Дата охранного документа: 20.05.2016
10.06.2016
№216.015.461f

Эластичная диафрагмирующая интраокулярная линза

Изобретение относится к области медицины, а именно к области офтальмохирургии. Внутри оптической части эластичной диафрагмирующей интраокулярной линзы расположено светорассеивающее кольцо шириной 0,5-1,5 мм, внутренний диаметр которого совпадает с внешним диаметром центральной прозрачной...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002586248
Дата охранного документа: 10.06.2016
20.06.2016
№216.015.48af

Композиция для ингибирования и комплексного лечения интраоперационного макулярного отека

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и предназначено для ингибирования и комплексного лечения интраоперационного макулярного отека. Фармацевтическая композиция включает натриевую соль кератансульфата, натриевую соль хондроитинсульфата, фосфатидилхолин и физиологический...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002587779
Дата охранного документа: 20.06.2016
20.08.2016
№216.015.4c19

Способ герметизации глазного яблока при витреоретинальных вмешательствах

Изобретение относится к офтальмохирургии и может быть использовано при герметизации глазного яблока с помощью «портов» при витреоретинальных вмешательствах. Прокалывают склеру троакаром с портом под углом 15° по отношению к склере, продвигают троакар в склере на глубину режущей части троакара,...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002594981
Дата охранного документа: 20.08.2016
20.08.2016
№216.015.4eae

Способ прогнозирования атрофической миопической макулопатии

Изобретение относится к области медицины, в частности к офтальмологии. Для прогнозирования риска формирования атрофической миопической макулопатии выполняют оптическую когерентную томографию макулярной зоны глазного дна. При наличии сочетания одновременного снижения двух показателей: 1) толщины...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002595001
Дата охранного документа: 20.08.2016
27.08.2016
№216.015.4f3a

Лакримальный обтуратор

Изобретение относится к области медицины. Лакримальный обтуратор выполнен толщиной от 450 до 600 мкм и состоит из центральной части длиной 2,4-2,6 мм и шириной 0,4-0,6 мм, которая с одного конца заострена, а с другого переходит в перемычку длиной 1,3-1,4 мм и шириной 0,15-0,25 мм, симметрично...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002595501
Дата охранного документа: 27.08.2016
27.08.2016
№216.015.5133

Способ определения оптимального уровня вакуума и частоты резов витреотома для хирургического лечения витреофовеолярного тракционного синдрома

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и может быть использовано для определения оптимального уровня вакуума для хирургического лечения витреофовеолярного тракционного синдрома. Методом оптической когерентной томографии у пациентов с витреофовеолярным тракционным синдромом...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002596058
Дата охранного документа: 27.08.2016
12.01.2017
№217.015.58f9

Способ комбинированного хирургического лечения вторичной глаукомы при посттравматической аниридии

Изобретение относится к области медицины, а именно к офтальмологии, и может быть использовано для лечения вторичной глаукомы при посттравматической аниридии после проведения оптико-реконструктивных хирургических вмешательств с имплантацией иридо-хрусталиковой диафрагмы. Выполняют...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002588396
Дата охранного документа: 27.06.2016
+ добавить свой РИД