Результат интеллектуальной деятельности: ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕНЫЙ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЙ ЗОНД PR-SOW ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ КОКЦИДИОИДОМИКОЗА Coccidioides posadasii

Изобретение относится к биотехнологии, молекулярной биологии и может быть использовано в медицине для выявления генетического материала возбудителя кокцидиоидомикоза Coccidioides posadasii как для диагностики в практическом здравоохранении и службе Роспотребнадзора, так и для научных исследований.

Кокцидиоидомикоз относят к особо опасным микозам, возбудителями которого являются диморфные грибы рода Coccidioides spp. С. posadasii имеет значительно более широкое географическое распространение, включая юго-западную часть США, Центральную и Южную Америку, по сравнению С.immitis, который эндемичен для Калифорнии (США). Метод полимеразной цепной реакции является прямым методом выявления ДНК данных микромицетов и обладает высокой специфичностью и чувствительностью. В основе метода ПЦР лежит природный процесс репликации ДНК - комплементарное достраивание ДНК матрицы, осуществляемое с помощью фермента ДНК-полимеразы.

Процесс удвоения нуклеиновых кислот можно использовать для получения копий коротких участков ДНК, специфичных для конкретных микроорганизмов, т.е. осуществлять целенаправленный поиск таких специфических участков, что и является целью генодиагностики для выявления возбудителя кокцидиоидомикоза.

Для эффективного проведения ПЦР необходимы праймеры - синтетические олигонуклеотиды определенного размера, специфические для каждого типа возбудителей. Праймеры комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что достраивание новой цепи ДНК протекает только между ними. В результате ПЦР происходит многократное увеличение числа копий (амплификация) специфического участка гена при помощи фермента ДНК-полимеразы. Выбор специфического фрагмента и подбор праймеров играет важнейшую роль в специфичности проведения амплификации, что сказывается на качестве проведения анализа исследуемых микромицетов.

Использование специальных флуоресцентных меток при детекции результатов позволяет отказаться от стадии электрофореза, что снижает риск перекрестной контаминации продуктами ПЦР и, соответственно, уменьшает число ложноположительных результатов. Поскольку регистрация результатов проводится непосредственно в процессе реакции амплификации, весь анализ можно проводить в одной-двух комнатах лаборатории силами одного сотрудника. Этот подход позволяет проводить автоматическую интерпретацию полученных результатов и снимает проблему субъективной оценки электрофореграмм. Существует несколько флуоресцентных технологий, различающихся по способам генерации репортерной флуоресценции. В данной заявке используются зонды с комплементарными концевыми последовательностями по типу «молекулярных маяков» (molecular beacons).

Наиболее близким аналогом являются олигонуклеотидные зонды, разработанные для выявления продуктов амплификации в режиме реального времени R. Bialek с соавторами в 2004 году. Авторы используют 2 зонда с резонансным переносом энергии (LightCycler assay). Принцип метода основан на переносе энергии с одного флуорофора, находящегося на 3'-конце первого зонда, ко второму флуорофору, находящемуся на 5'-конце второго зонда. Излучение детектируется при одновременном связывании обоих зондов с ДНК-матрицей. В качестве ДНК-мишеней для выявления возбудителя кокцидиоидомикоза был выбран участок гена, кодирующего антиген, обогащенный пролином (Ag2/PPvA) [PCR Assays for Identification of Coccidioides posadasii Based on the Nucleotide Sequence of the Antigen 2/Proline-Rich Antigen/Bialek R., Kern J., Herrmannetall T. et al. // J. Clinical. Microdiol. - 2004. - Vol.42, №2. - Р.778-783.].

Целью настоящего изобретения является разработка олигонуклеотидного зонда для флуоресцентной детекции результатов анализа методом полимеразной цепной реакции при идентификации С.posadasii в режиме реального времени.

Цель достигается конструированием специфичного олигонуклеотида, имеющего структуру «шпильки» с флуорофором и гасителем флуоресценции на концах и обладающего комплементарностью к продукту реакции амплификации с праймерами CpSOW82s/CpSOWS2as (патент №2346045):

PR-SOW 5'(ROX)-CGCGGAGATGACTGTCGAGTGGCGCG-(BHQ2)3',

где ROX - карбокси-Х-родамин, флуоресцентный краситель, длина волны поглощения которого составляет 580 нм, а длина волны флуоресценции - 605 нм. BHQ2 - гаситель флуоресценции с диапазоном гашения 550-650 нм.

Характеристика олигонуклеотидного зонда и ДНК-мишени для его гибридизации.

Основываясь на данных, представленных в базе GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information), был подобран олигонуклеотид, обладающий активностью гибридизационного зонда по типу «молекулярного маяка» к фрагменту генома возбудителя кокцидиоидомикоза, фланкированному праймерами CpSOW82s/CpSOWS2as. Данный зонд обеспечивает флуоресцентную детекцию продукта амплификации фрагмента гена гликопротеина внешней стенки сферул SOWgp82 (spherule outer wall glycoprotein) С. posadasii.

В качестве положительного контроля эксперименты проводили на типовом штамме С. posadasii 36 Silveira, используя для выделения ДНК обеззараженные суспензии микромицета в концентрациях от 1×10⁶ артроспор/мл до 1×10¹ артроспор/мл. Подсчет клеток проводили в камере Горяева. Апробация гибридизационного зонда была осуществлена на наборе штаммов возбудителя кокцидиоидомикоза коллекционного центра МЖК ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора.

Чувствительность реакции амплификации с флуоресцентно-меченым зондом PR-SOW оценивалась при исследовании проб ДНК, выделенных из десятикратных разведений чистых культур возбудителя кокцидиоидомикоза, и составила - 1×10²-1×10⁴ клеток/мл.

Для обнаружения возбудителя кокцидиоидомикоза методом ПЦР оценена возможность использования сконструированного олигонуклеотидного зонда для анализа биологического материала (кровь, искусственно контаминированная клетками С. posadasii). Показано, что использование разработанного зонда при постановке реакции амплификации позволяет выявлять ДНК возбудителей кокцидиоидомикоза с чувствительностью 1×10⁴ клеток/мл.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. Методика конструирования флуоресцентно-меченого олигонуклеотидного зонда PR-SOW для идентификации ДНК возбудителя кокцидиоидомикоза С. posadasü методом ПЦР с флуоресцентной детекцией.

На основе теоретического изучения нуклеотидной последовательности фрагмента гена SOWgp82 возбудителя кокцидиоидомикоза, фланкированной праймерами CpSOW82s/CpSOWS2as и имеющей длину 300 п.н., сконструирован гибридизационный зонд размером 26 п.н. (таблица 1).

Полученный олигонуклеотид был проанализирован с помощью компьютерной программы Vector NTI Express v. 1.1.2 (Life Technologies, США) на предмет образования вторичных структур с праймерами CpSOW82s/CpSOWS2as, а также с использованием ресурса BLAST на web-сервере Национального Центра Биотехнологической Информации (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) для установления гомологии между ним и нуклеотидными последовательностями близкородственных возбудителей особо опасных микозов и гетерологичных микроорганизмов, присутствующих в базах данных (EMBL, GenBank, DDBJ). На момент проведения компьютерного анализа гомологии выявлено не было.

Пример 2. Детекция специфических фрагментов ДНК с помощью разработанного зонда PR-SOW для идентификации ДНК возбудителя кокцидиоидомикоза методом ПЦР в режиме реального времени.

В состав реакционных смесей, помимо анализируемой ДНК, входили комплементарные специфическому фрагменту олигонуклеотидные зонды, меченые флуорофором ROX и гасителем флуоресценции (BHQ2), а также праймеры CpSOW82s/CpSOWS2as, дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, буферный раствор и фермент Год-полимераза. Праймеры и зонд для внутреннего контроля использовали при проверке тест-систем на специфичность и при анализе способов выделения ДНК. В качестве отрицательного контроля в пробирку вместо образца вносили такой же объем дистиллированной воды.

Амплификацию продолжительностью 45 циклов проводили в объеме 25 мкл с использованием «горячего старта».

Анализ продуктов ПЦР осуществляли в режиме реального времени на приборе «Rotor-Gene 6000» («Corbett Research», Австралия). Регистрацию результатов проводили в табличной и графической форме с помощью компьютерных программ. Результаты оценивали по наличию или отсутствию пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, что определяется значением порогового цикла «Ct» в соответствующей графе в таблице результатов (рис.1).

Пример 3. Определение чувствительности и специфичности реакции амплификации в режиме реального времени с помощью разработанного флуоресцентно-меченого олигонуклеотидного зонда PR-SOW для идентификации ДНК возбудителя кокцидиоидомикоза.

Чувствительность реакции амплификации с разработанным гибридизационным зондом оценивалась при исследовании проб ДНК, выделенных из десятикратных разведений клеток чистых культур возбудителя кокцидиоидомикоза.

Обеззараживание исследуемых проб производили добавлением раствора мертиолята натрия до конечной концентрации 0,1% и прогреванием в течение 40 мин при температуре 56°С и инкубированием при комнатной температуре 24 ч. Выделение ДНК из чистых культур микромицетов выполняли с помощью метода гуанидинтиоцианат-фенольной экстракции с переосаждением ДНК изопропанолом (Sandhu G.S. et al., 1995). Постановку реакции ПЦР осуществляли как описано в примере 2. При тестировании коллекции грибных культур С. posadasii ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора с использованием разработанного флуоресцентно-меченого олигонуклеотидного зонда PR-SOW продукт амплификации детектировался с ДНК всех штаммов возбудителя кокцидиоидомикоза с чувствительностью 1×10²-1×10⁴ клеток/мл. С другими видами близкородственных грибов и гетерологичных микроорганизмов в реакции ПЦР с разработанными праймерами в 100% случаев получен отрицательный результат (рис.1).

В качестве примера на рисунке 1 показана диаграмма результатов реакции амплификации в режиме реального времени при определении чувствительности сконструированных праймеров с ДНК штаммов возбудителя кокцидиоидомикоза С. posadasii 36 Silveira (графики представлены в порядке убывания концентрации слева направо: 1х10⁵ клеток/мл, 1х10⁴ клеток/мл, 1х10³ клеток/мл).

Таким образом, разработанный гибридизационный зонд может быть использован для идентификации возбудителя кокцидиоидомикоза и позволяет в короткий срок с высокой чувствительностью и специфичностью детектировать ДНК С.posadasii в чистой культуре и биологическом материале.

Олигонуклеотидный зонд с комплементарными концевыми последовательностями по типу «молекулярного маяка», обеспечивающий флуоресцентную детекцию при идентификации возбудителя кокцидиоидомикоза Coccidioides posadasii методом полимеразной цепной реакции с олигонуклеотидными праймерами CpSOW82s/CpSOWS2as (патент №2346045), комплементарными фрагменту гена гликопротеина внешней стенки сферул SOWgp82 (spherule outer wall glycoprotein) С. posadasii имеет следующую структуру:

PR-SOW 5'(ROX)-CGCGGAGATGACTGTCGAGTGGCGCG-(BHQ2)3',

где ROX - карбокси-Х-родамин, флуоресцентный краситель, длина волны поглощения которого сотавляет 580 нм, а длина волны флуоресценции - 605 нм. BHQ2 - гаситель флуоресценции с диапазоном гашения 550-650 нм.