БИОКАТАЛИЗАТОР, СПОСОБ ЕГО ПРИГОТОВЛЕНИЯ И СПОСОБ ПЕРЕЭТЕРИФИКАЦИИ РАСТИТЕЛЬНЫХ МАСЕЛ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭТОГО БИОКАТАЛИЗАТОРА

Изобретение направлено на разработку биокатализаторов с активностью термостабильной липазы, предназначенных для процессов переэтерификации с участием растительных масел, а также способов их приготовления. Изобретение может быть использовано для получения ценных продуктов масложировой промышленности, таких как специализированные жиры - важнейшие ингредиенты маргариновой продукции и спредов, а также эквивалентов и заменителей ценных масел какао и молочных жиров - необходимых компонентов кондитерских изделий и мороженного. Изобретение может быть использовано также для получения компонентов биодизеля, получаемого в процессе переэтерификации растительных масел с низкомолекулярными спиртами/эфирами.

В настоящее время для приготовления биокатализаторов с активностью липазы используют носители силикатной природы - диоксид кремния (SiO₂), природные минералы (кизельгур), отличающиеся химической и микробиологической инертностью, а также высокой механической прочностью.

Известен способ приготовления биокатализатора [Salis A.; Meloni D., Ligas S., Casula M.F., Monduzzi M., Solinas V., Dumitriu E. // Langmuir. 2005. V. 21. No. 12. P. 5511-5516] путем физической адсорбции липазы из микроорганизма Mucor javanicus с последующей кросс-сшивкой глутаровым диальдегидом на мезопористом диоксиде кремния. Биокатализатор проявляет практически одинаковую активность в реакции гидролиза триглицеридов, в том числе триолеина (аналога оливкового масла), равную 80 Единиц Активности (ЕА)/г. Недостатком способа является использование токсичных сшивающих реагентов (диальдегида), а также высокая стоимость мезопористого силикатного носителя с узким распределением пор по размерам, синтезированного путем гидролиза тетраэтил орто-силиката в присутствии поверхностно-активных сополимеров (Pluronic®). Поскольку биокатализатор получен в виде тонкодисперсного порошка, то его невозможно использовать в проточном реакторе с неподвижным слоем из-за быстрого уплотнения слоя и высокого гидродинамического сопротивления.

Известен способ приготовления биокатализатора путем включения дрожжевых автолизатов в наноуглерод-силикатные матрицы [RU 24515466, С12Р 19/00, 27.05.2012]. Биокатализатор предназначен для процесса инверсии сахарозы и получения инвертного сиропа, содержащего глюкозу и фруктозу, и отличается высокой стационарной активностью. Недостатком данного биокатализатора является отсутствие ферментативной активности в реакциях гидролиза и переэтерификации с участием растительных масел.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ приготовления биокатализатора путем включения липазы из Pseudomonas cepacia в силикатный матрицу, полученную путем гидролиза различных производных силанов в присутствии липазы [Noureddini H., Gao X., Joshi S., Wagner P.R. // J. Amer. Oil Chem. Soc. 2002. 79(1), 33-40]. Данный способ осуществляется следующим образом. Сначала к водному раствору липазы добавляют производные силана (тетраметоксисилан или бутилметокси-силан) и катализатор (фторид натрия). При гидролизе силанов образуется гидрогель диоксида кремния, содержащий липазу, который затем сушат, и ксерогель диоксида кремния растирают в порошок. Порошок промывают дистиллированной водой при интенсивном перемешивании для того, чтобы удалить токсичные примеси - непрореагировавший силан, метанол, силиканол, растворимые олигомеры. После отмывки влажную пасту снова сушат, затем снова растирают в порошок и используют в качестве биокатализатора в периодическом процессе гидролиза триглицеридов, например соевого масла. Активность биокатализатора составляет 20-80 ЕА/г при 40°C. Недостатком данного способа является использование для приготовления биокатализаторов токсичных и дорогостоящих реагентов (производных силанов), получение биокатализатора в виде тонкодисперсного порошка, который быстро набухает в реакционных условиях, что не позволяет использовать такой биокатализатор в проточном реакторе с неподвижным слоем. Недостатком также можно считать использование фермента, предварительно выделенного и очищенного, что повышает стоимость биокатализатора.

Изобретение решает задачу приготовления биокатализаторов с высокой активностью термостабильной липазы в виде механически прочных гранул для процессов, осуществляемых как в периодическом, так и в непрерывном режимах, в том числе, для процесса переэтерификации растительных масел.

Задача решается составом биокатализатора для переэтерификации растительных масел на основе липазы и носителя - силикатной матрицы, в котором в качестве ферментативно-активной субстанции он содержит частично разрушенные клетки или клеточные лизаты рекомбинантного штамма rE. coli/lip, продуцирующего термостабильную липазу, в качестве носителя - наноуглерод-силикатные матрицы, содержащие наноструктурированный углерод, в качестве влагоудерживающего агента вещества углеводной природы, и имеет следующий состав, в мас. % сухих веществ:

клетки или клеточные лизаты rE. coli/lip - 20-40,

наноструктурированный углерод (углеродные нанотрубки УНТ) - 5-10,

влагоудерживающий агент углеводной природы, а именно,

мальтодекстрин - 10-20 или высокомолекулярный полисахарид - 1-2.

диоксид кремния - до 100.

В состав биокатализатора входит ксерогель диоксида кремния в качестве матрицы для включения (иммобилизации) ферментативно-активного компонента, а также структурообразователя и связующего, позволяющего получать биокатализатор в виде механически прочных гранул. В качестве ферментативно-активного компонента биокатализатора используют частично разрушенные клетки или клеточные лизаты рекомбинантного штамма-продуцента термостабильной липазы из Thermomyces lanuginosus, без предварительного выделения фермента из штамма-продуцента и дополнительной его очистки. Рекомбинантные штаммы-продуценты термостабильной липазы (обознач. rE. coli/lip) конструируют методами генетической инженерии путем клонирования химически синтезированного гена липазы в составе экспрессирующего вектора в клетках специализированного штамма кишечной палочки Е. coli. Частично разрушенные клетки rE. coli/lip получают в процессе замораживания-размораживания. Клеточные лизаты rE. coli/lip получают путем обработки клеточной биомассы ферментами лизоцимом, ДНКазой, РНКазой А и ультразвуком.

Биокатализатор также содержит в составе наноструктурированный углерод, влагоудерживающий агент углеводной природы - олигосахарид (мальтодекстрин), полисахарид - карбоксиметил-целлюлозу (КМЦ), или гуммиарабик, или крахмал. Мальтодекстрин - это олигосахарид с числом мономерных (глюкозных) звеньев 25-30. Целлюлоза и ее производные, а также крахмал - это полисахариды, молекула которых содержит от 600 до 9000 глюкозных остатков. Гуммиарабик (ГУМ) - это также полисахарид со сложной арабиногалактановой структурой, он растворяется в воде, образуя растворы со сравнительно низкой вязкостью. КМЦ, ГУМ и крахмал являются высокомолекулярными полисахаридами растительного происхождения.

Наноструктурированный углерод представляет собой тонкодисперный порошок, полученный в результате высокотемпературного пиролиза этилена на Co, Fe-катализаторах и содержащий углеродные нанотрубки (УНТ) диаметром 9-11 нм и 21-22 нм с удельной поверхностью 280-320 и 100 140 м²/г, соответственно. Тонкодисперный порошок содержит УНТ в виде агрегатов размером 100-150 мкм.

Задача решается также способом приготовления биокатализатора, который включает стадии смешения клеток или лизатов рекомбинантного штамма-продуцента rE. coli/lip с наноструктурированным углеродом, влагоудерживающим агентом и гидрогелем диоксида кремния до однородного состояния. Затем полученную массу сушат в течение 5-20 ч при температуре не выше 40°C и фракционируют.

В результате получают гранулы биокатализатора размером 0.1-2 мм, которые имеют состав, в мас.% сухих веществ: клетки/лизаты rE. Coli/lip - 20-40, УНТ - 5-10, мальтодекстрин - 10-20, полисахарид (КМЦ, или ГУМ, или крахмал) - 1-2, SiO₂ - до 100.

Для приготовления биокатализаторов используют гидрогель диоксида кремния, полученный путем золь-гель технологии через образование коагеля в результате взаимодействия силиката натрия или силиката калия (в виде жидкого стекла) с аммонийными солями серной, или азотной, или угольной кислоты, как описано в [RU 2372403, C12N 11/14, 10.11.2009]. Гидрогель диоксида кремния содержит 10-12 мас.% сухих веществ в пересчете на SiO₂. При высушивании гидрогеля получают ксерогель диоксида кремния с величиной удельной поверхности, равной 200-250 м²/г. Гидрогель и ксерогель диоксида кремния абсолютно инертны, отличаются высокой химической и микробиологической устойчивостью, хранятся годами в плотно закрытой таре при комнатной температуре без потери первоначальных свойств.

Задача решается способом приготовления биокатализатора с активностью термостабильной липазы путем включения клеток или лизатов рекомбинантного штамма-продуцента rE. coli/lip в силикатные и наноуглерод-силикатные композитные матрицы. Ксерогель диоксида кремния используют в качестве структурообразователя и основного связующего компонента. Мальтодекстрин или КМЦ, или ГУМ, или крахмал используют в качестве влагоудерживающего агента. Наноструктурированный углерод используют как компонент с выраженной гидрофобностью, эффективно адсорбирующий как ферментативно-активную субстанцию (клетки или лизаты rE. coli/lip), так гидрофобные молекулы субстратов триглицеридов растительных масел, что увеличивает их концентрацию внутри биокатализатора, где иммобилизована ферментативно-активная субстанция. Все компоненты (SiO₂-гидрогель, клетки или клеточные лизаты, УНТ, влагоудерживающий агент) тщательно смешивают до получения однородной пастообразной массы, затем полученную смесь сушат при температуре не выше 40°C (в большинстве случаев, при комнатной температуре и влажности воздуха 20-30%), измельчают и фракционируют для получения твердых, механически прочных гранул биокатализатора размером 0.1-2 мм.

Задача решается также способом проведения переэтерификации растительных масел при помощи биокатализатора, приготовленного в виде механически прочных гранул. Процесс переэтерификации осуществляют при 60-80°C как в периодическом, так и непрерывном режимах. Сухой биокатализатор загружают в реакторы различной конструкции - реакторы смешения и реакторы вытеснения. При проведении непрерывного процесса переэтерификации биокатализатор загружают в колоночный стальной реактор и через неподвижный слой прокачивают реакционную смесь с варьируемой скоростью потока. Время контакта (τ), равное отношению объема биокатализатора к объемной скорости потока, варьируют от 30 до 90 мин.

Для определения активности приготовленных биокатализаторов используют реакцию гидролиза 0.2 М эмульгированного трибутирина до масляной кислоты при 20°C. Активность биокатализаторов выражают в единицах активности на 1 г. Одна единица активности (ЕА) соответствует скорости реакции, равной мкмоль/мин. Концентрацию масляной кислоты определяют титриметрически с помощью 0.025 н. раствора едкого натра. Для определения активности биокатализаторов в реакции переэтерификации в качестве исходной реакционной смеси используют смесь 2-3 вес. частей растительного масла (подсолнечного, или соевого, или оливкового) и 1 вес. часть полностью гидрированного масла (саломаса). Активность биокатализаторов в реакции переэтерификации оценивают, анализируя кривые охлаждения конечных продуктов, а также кривые, характеризующие содержание твердых триглицеридов (ТТГ) в реакционной смеси при различных температурах (от 15°C до 35°C). В процессе переэтерификации количество ТТГ уменьшается, и продукт переэтерификации характеризуется более низкой температурой плавления по сравнению с исходной смесью растительного масла и саломаса. Конверсию рассчитывают по формуле: , %, где С_исх и С_кон - содержание твердых триглицеридов при 35°C в исходной смеси и продуктах реакции, соответственно.

Сущность изобретения иллюстрируется следующими примерами и таблицами.

Пример 1.

Рекомбинантный штамм-продуцент термостабильной липазы сконструирован методами генетической инженерии путем клонирования химически синтезированного гена зрелой липазы из Thermomyces lanuginosus в составе экспрессирующего вектора pJExpress401 в клетках Е. coli BL21(DE3) (обозначен rE. coli/lip). Кодирующая область гена оптимизирована для экспрессии в Е. coli с помощью компьютерной программы Gene Designer2 фирмы DNA2.0 (США) и с учетом частот встречаемости пар кодонов и положения второго аминокислотного остатка с N-конца полипептидной цепи. Штамм rE. coli/lip обеспечивает экспрессию гена, индуцируемую изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозидом (ИПТГ), под контролем промотора бактериофага Т5.

Биокатализатор готовят следующим образом. Тщательно смешивают клетки рекомбинантного штамма-продуцента rE. coli/lip (1.5 г), частично разрушенные в процессе замораживания-размораживания, с гидрогелем диоксида кремния (5.0 г) до однородного состояния. Затем полученную массу высушивают в течение 8 ч при 25°C, механически размельчают и фракционируют до размера гранул 0.1-2 мм. Биокатализатор имеет следующий состав, в мас.% сухих веществ: клетки rE. coli/lip - 44, SiO₂ - 56.

Начальная активность биокатализатора в реакции гидролиза трибутирина составляет 380 ЕА/г (что в 5 раз больше, чем в прототипе). Биокатализатор осуществляет переэтерификацию в смеси растительного масла (оливкового или соевого) и саломаса в периодическом режиме в течение 5 ч при 60°C. Конверсия составляет 55%.

Пример 2.

Аналогичен пр. 1, только используют клеточные лизаты рекомбинантного штамма-продуцента rE. coli/lip. Биокатализатор имеет следующий состав, в мас. % сухих веществ: лизаты rE. coli/lip - 38, SiO₂ - 62.

Начальная активность биокатализатора в реакции гидролиза трибутирина составляет 870 ЕА/г (что в 11 раз больше, чем в прототипе). Приготовленный биокатализатор в реакции переэтерификации не проявляет активности.

Пример 3.

Аналогичен пр. 2, только в состав биокатализатора добавляют влагоудерживающий агент углеводной природы - мальтодектрин. Биокатализатор имеет следующий состав, в мас. % сухих веществ: лизаты rE. coli/lip - 40, мальтодектрин - 5, SiO₂ - 55.

Начальная активность биокатализатора в реакции гидролиза трибутирина составляет 880 ЕА/г (что в 11 раз больше, чем в прототипе). Приготовленный биокатализатор осуществляет переэтерификацию в смеси растительного масла (оливкового, или соевого, или подсолнечного) и саломаса в периодическом режиме в течение 5 ч при 70°C. Конверсия составляет 30%.

Пример 4.

Аналогичен пр. 3, только биокатализатор имеет следующий состав, в мас.% сухих веществ: лизаты rE. coli/lip - 39, мальтодектрин - 11, SiO₂ - 50.

Начальная активность биокатализатора в реакции гидролиза трибутирина составляет 880 ЕА/г (что в 11 раз больше, чем в прототипе). Приготовленный биокатализатор осуществляет переэтерификацию в смеси растительного масла (оливкового, или соевого, или подсолнечного) и саломаса в периодическом режиме в течение 5 ч при 70°C. Конверсия составляет 48%.

Пример 5.

Аналогичен пр. 3, только биокатализатор имеет следующий состав, в мас.% сухих веществ: клеточные лизаты rE. coli/lip - 38, мальтодектрин - 23, SiO₂ - 39.

Начальная активность биокатализатора в реакции гидролиза трибутирина составляет 860 ЕА/г (что в 11 раз больше, чем в прототипе). Приготовленный биокатализатор осуществляет переэтерификацию в смеси растительного масла (оливкового, или соевого, или подсолнечного) и саломаса в периодическом режиме в течение 5 ч при 70°C. Конверсия составляет 43%.

Пример 6.

Аналогичен пр. 3, только биокатализатор имеет следующий состав, в мас.% сухих веществ: лизаты rE.coli/lip - 36, мальтодектрин - 34, SiO₂ - 30.

Начальная активность биокатализатора в реакции гидролиза трибутирина составляет 820 ЕА/г. Приготовленный биокатализатор осуществляет переэтерификацию в смеси растительного масла (оливкового, или соевого, или подсолнечного) и саломаса в периодическом режиме в течение 5 ч при 70°C. Конверсия составляет 25%.

Пример 7.

Аналогичен пр. 3, только биокатализатор имеет следующий состав, в мас.% сухих веществ: лизаты rE. coli/lip - 39, мальтодектрин - 45, SiO₂ - 16.

Начальная активность биокатализатора в реакции гидролиза трибутирина составляет 840 ЕА/г. Приготовленный биокатализатор практически не проявляет активность в реакции переэтерификации при 70°C. Конверсия составляет менее 5%.

Пример 8.

Аналогичен пр. 4, только биокатализатор имеет следующий состав, в мас.% сухих веществ: лизаты rE. coli/lip - 12, мальтодектрин - 11, SiO₂ - 77.

Начальная активность биокатализатора в реакции гидролиза трибутирина составляет 250 ЕА/г. Приготовленный биокатализатор осуществляет переэтерификацию в смеси растительного масла (оливкового, или соевого, или подсолнечного) и саломаса в периодическом режиме в течение 5 ч при 70°C. Конверсия составляет 15%.

Пример 9.

Аналогичен пр. 4, только биокатализатор имеет следующий состав, в мас.% сухих веществ: лизаты rE. coli/lip - 20, мальтодектрин - 11, SiO₂ - 69.

Начальная активность биокатализатора в реакции гидролиза трибутирина составляет 610 ЕА/г. Приготовленный биокатализатор осуществляет переэтерификацию в смеси растительного масла (оливкового, или соевого, или подсолнечного) и саломаса в периодическом режиме в течение 5 ч при 70°C. Конверсия составляет 35%.

Пример 10.

Аналогичен пр. 4, только биокатализатор имеет следующий состав, в мас.% сухих веществ: клеточные лизаты rE. coli/lip - 52, мальтодектрин - 10, SiO₂ - 39.

Начальная активность биокатализатора в реакции гидролиза трибутирина составляет 900 ЕА/г. Механическая прочность гранул существенно уменьшается при увеличении содержания лизатов выше 40 мас. %, гранулы биокатализатора набухают и разрушаются в реакционной среде. Приготовленный биокатализатор осуществляет переэтерификацию в смеси растительного масла (оливкового, или соевого, или подсолнечного) и саломаса в периодическом режиме в течение 5 ч при 70°C. Конверсия составляет 25%.

Пример 11.

Аналогичен пр. 3, только вместо мальтодекстрина в состав биокатализатора добавляют карбоксиметилцеллюлозу (КМЦ). Биокатализатор имеет следующий состав, в мас.% сухих веществ: лизаты rE. coli/lip - 30, КМЦ - 0.5, SiO₂ - 69.5.

Начальная активность биокатализатора в реакции гидролиза трибутирина составляет 700 ЕА/г. Гранулы биокатализатора сохраняют высокую механическую прочность и не набухают в течение 5 реакционных циклов продолжительностью 24-48 ч каждый, т.е. в течение более 120 часов.

Приготовленный биокатализатор осуществляет переэтерификацию в смеси растительного масла (подсолнечного) и саломаса в периодическом режиме в течение 5 часов при 70°C. Конверсия составляет 30%.

Пример 12.

Аналогичен пр. 11, только биокатализатор имеет следующий состав, в мас.% сухих веществ: лизаты rE. coli/lip - 39, КМЦ - 1, SiO₂ - 60.

Начальная активность биокатализатора в реакции гидролиза трибутирина составляет 870 ЕА/г (что в 11 раз больше, чем в прототипе). Приготовленный биокатализатор осуществляет переэтерификацию в смеси растительного (подсолнечного) масла и саломаса в периодическом режиме в течение 5 ч при 70°C. Конверсия составляет 35%.

Пример 13.

Аналогичен пр. 11, только биокатализатор имеет следующий состав, в мас.% сухих веществ: лизаты rE. coli/lip - 40, КМЦ - 2, SiO₂ - 58.

Начальная активность биокатализатора в реакции гидролиза трибутирина составляет 870 ЕА/г (что в 11 раз больше, чем в прототипе). Приготовленный биокатализатор осуществляет переэтерификацию в смеси растительного (подсолнечного) масла и саломаса в периодическом режиме в течение 5 ч при 70°C. Конверсия составляет 34%.

Пример 14.

Аналогичен пр. 11, только биокатализатор имеет следующий состав, в масс. % в мас.% сухих веществ: лизаты rE. coli/lip - 30, КМЦ - 5, SiO₂ - 65.

Начальная активность биокатализатора в реакции гидролиза трибутирина составляет 650 ЕА/г. Механическая прочность гранул в реакционной среде уменьшается, гранулы разрушаются в течение 5 реакционных циклов продолжительностью 24 ч каждый.

Приготовленный биокатализатор осуществляет реакцию переэтерификацию в периодическом режиме в течение 5 ч при 70°C. Конверсия составляет 30%.

Пример 15.

Аналогичен пр. 11, только биокатализатор имеет следующий состав, в масс. % в мас.% сухих веществ: лизаты rE. coli/lip - 30, КМЦ - 10, SiO₂ - 60.

Начальная активность биокатализатора в реакции гидролиза трибутирина составляет 650 ЕА/г. Механическая прочность гранул в реакционной среде уменьшается, гранулы разрушаются в течение 2 реакционных циклов продолжительностью 24 ч каждый.

Приготовленный биокатализатор осуществляет реакцию переэтерификацию в периодическом режиме в течение 5 часов при 70°C. Конверсия составляет 30%.

Пример 16.

Аналогичен пр. 3, только вместо мальтодекстрина в состав биокатализатора добавляют гуммиарабик (ГУМ). Биокатализатор имеет следующий состав, в мас.% сухих веществ: лизаты rE. coli/lip - 39, ГУМ - 1, SiO₂ - 60.

Начальная активность биокатализатора в реакции гидролиза трибутирина составляет 870 ЕА/г (что в 11 раз больше, чем в прототипе). Приготовленный биокатализатор осуществляет переэтерификацию в смеси растительного (подсолнечного) масла и саломаса в периодическом режиме в течение 5 ч при 70°C. Конверсия составляет 24%.

Пример 17.

Аналогичен пр. 16, только биокатализатор имеет следующий состав, в мас.% сухих веществ: лизаты rE. coli/lip - 40, ГУМ - 2, SiO₂ - 58.

Начальная активность биокатализатора в реакции гидролиза трибутирина составляет 870 ЕА/г (что в 11 раз больше, чем в прототипе). Приготовленный биокатализатор осуществляет переэтерификацию в смеси растительного (подсолнечного) масла и саломаса в периодическом режиме в течение 5 ч при 70°C. Конверсия составляет 28%.

Пример 18.

Аналогичен пр. 3, только вместо мальтодекстрина в состав биокатализатора добавляют природный полисахарид - крахмал. Биокатализатор имеет следующий состав, в мас.% сухих веществ: лизаты rE. coli/lip - 30, крахмал - 1, SiO₂ - 69.

Начальная активность биокатализатора в реакции гидролиза трибутирина составляет 670 ЕА/г. Гранулы биокатализатора сохраняют высокую механическую прочность и не набухают в течение 5 реакционных циклов продолжительностью 24-48 ч каждый, т.е. в течение более 120 ч.

Приготовленный биокатализатор осуществляет реакцию переэтерификацию в периодическом режиме в течение 5 ч при 70°C. Конверсия составляет 40%.

Пример 19.

Аналогичен пр. 18, только биокатализатор имеет следующий состав, в мас.% сухих веществ: лизаты rE. coli/lip - 30, крахмал - 2, SiO₂ - 68.

Начальная активность биокатализатора в реакции гидролиза трибутирина составляет 670 ЕА/г. Гранулы биокатализатора сохраняют высокую механическую прочность и не набухают в течение 5 реакционных циклов продолжительностью 24-48 ч каждый, т.е. в течение более 120 ч.

Приготовленный биокатализатор осуществляет реакцию переэтерификации в периодическом режиме в течение 5 ч при 70°C. Конверсия составляет 40%.

Из примеров 1-2 видно, что биокатализаторы, приготовленные на основе частично разрушенных клеток rE. coli/lip, обладают в ~2 раза более низкой гидролитической активностью, чем биокатализаторы, приготовленные на основе клеточных лизатов. С другой стороны, данные биокатализаторы проявляют высокую активность в переэтерификации и в их состав не нужно вводить влагоудерживающие агенты, в отличие от биокатализаторов, приготовленных на основе клеточных лизатов rE. coli/lip, описанных в примерах 2-19.

Из примеров 2-7 и таблицы 1 видно, что в биокатализаторах по пр. 2-7 содержание мальтодекстрина, равное 10-20 мас. %, является оптимальным и обеспечивает максимальную конверсию в реакции переэтерификации.

Из пр. 4, 8-10 видно, что оптимальное содержание клеточных лизатов rE. coli/lip в биокатализаторах составляет 20-40%. Данные биокатализаторы обладают высокой ферментативной активностью и стабильны в условиях реакции благодаря высокой механической прочности гранул.

Из примеров 11-15 видно, что при увеличении содержания компонента полисахаридной природы, например карбоксиметилцеллюлозы, механическая прочность гранул биокатализаторов к воздействию водной реакционной среды (для реакции гидролиза триглицеридов) уменьшается из-за заметного набухания полисахарида, приводящего к разрушению силикатной матрицы. Оптимальное содержание полисарида в биокатализаторах не превышает 2 мас.%.

Пример 20.

Аналогичен пр. 5, только дополнительно в состав биокатализатора вводят наноструктурированный углерод в виде тонкодисперного порошка из углеродных нанотрубок (УНТ) диаметром 9-11 нм с удельной поверхностью 280-320 м²/г, образующих агрегаты размером 100-150 мкм. Биокатализатор имеет следующий состав, в мас.% сухих веществ: лизаты rE. coli/lip - 30, мальтодектрин - 20, УНТ - 5, SiO₂ - 40.

Начальная активность биокатализатора в реакции гидролиза трибутирина составляет 870 ЕА/г (что в 11 раз больше, чем в прототипе). Приготовленный биокатализатор осуществляет переэтерификацию в смеси растительного (подсолнечного) масла и саломаса в периодическом режиме в течение 5 ч при 70°C. Конверсия составляет 26%.

Пример 21.

Аналогичен пр. 20, только биокатализатор имеет следующий состав, в мас. % сухих веществ: лизаты rE. coli/lip - 30, мальтодектрин - 20, УНТ - 10, SiO₂ - 40.

Начальная активность биокатализатора в реакции гидролиза трибутирина составляет 870 ЕА/г (что в 11 раз больше, чем в прототипе). Приготовленный биокатализатор осуществляет переэтерификацию в смеси растительного (подсолнечного) масла и саломаса в периодическом режиме в течение 5 ч при 70°C. Конверсия составляет 27%.

Пример 22.

Аналогичен пр. 20, только биокатализатор имеет следующий состав, в мас. % сухих веществ: лизаты rE. coli/lip - 30, мальтодектрин - 20, УНТ - 20, SiO₂ - 40.

Начальная активность биокатализатора в реакции гидролиза трибутирина составляет 870 ЕА/г (что в 11 раз больше, чем в прототипе). Приготовленный биокатализатор осуществляет переэтерификацию в смеси растительного (подсолнечного) масла и саломаса в периодическом режиме в течение 5 ч при 70°C, однако механическая прочность гранул биокатализатора является низкой.

Пример 23.

Аналогичен пр. 5, только в состав биокатализатора вводят наноструктурированный углерод в виде тонкодисперного порошка из углеродных нанотрубок диаметром 21-22 нм с удельной поверхностью 100-140 м²/г, образующих агрегаты размером 100-150 мкм. Биокатализатор имеет следующий состав, в мас. % сухих веществ: лизаты rE. coli/lip - 30, мальтодектрин - 20, УНТ - 10, SiO₂ - 2-40.

Начальная активность биокатализатора в реакции гидролиза трибутирина составляет 1040 ЕА/г (в 13 раз больше, чем в прототипе), что в 1,2 раза больше, чем биокатализаторов по пр. 5 и 21. Приготовленный биокатализатор осуществляет переэтерификацию в смеси растительного (подсолнечного) масла и саломаса в периодическом режиме в течение 5 ч при 70°C. Конверсия составляет 35%.

Из пр. 20-22 видно, что оптимальное содержание наноструктурированного углерода в биокатализаторе составляет 5-10%. Из пр. 23 видно, что при введении в состав биокатализатора наноструктурированного углерода - углеродных нанотрубок диаметром 21-22 нм с удельной поверхностью 100-140 м²/г в виде агрегатов размером 100-150 мкм, наблюдают увеличение активности приготовленного биокатализатора как в реакции гидролиза, так и в реакции переэтерификации.

Пример 24. Способ переэтерификации в непрерывном режиме.

Биокатализатор (3-5 г) с оптимальным составом, приготовленный по пр. 4, или пр. 9, или пр. 23, загружают в стальной проточный реактор. Через неподвижный слой биокатализатора прокачивают реакционную смесь, состоящую из растительного (подсолнечного или соевого) масла и саломаса с варьируемой скоростью потока. Время контакта варьируют от 30 мин до 90 мин. Температура процесса 70-80°C.

Результаты испытаний представлены в таблице 2.

Из приведенной ниже таблицы видно, что оптимальное время контакта составляет не мене 60 мин. Время полуинактивации биокатализатора, в течение которого сохраняется ½ первоначальной активности, составляет 120 ч при 70°C.

Пример 25. Способ переэтерификации в периодическом режиме.

Биокатализатор (0,5 г) с оптимальным составом, приготовленный, например по пр. 9, заливают реакционной смесью (10 мл) следующего состава: 10 об. % подсолнечное масло, 20 об. % этилацетат (или метилацетата),70 об. % гексан. Переэтерификацию, в результате которой образуются этиловые (или метиловые) эфиры жирных кислот (биодизель), проводят при 40°C и перемешивании 150 об/мин в течение 24-48 ч. Конверсия составляет 36%.

Из приведенных выше примеров видно, что биокатализаторы, приготовленные на основе клеточных лизатов рекомбинантого штамма-продуцента термостабильной липазы rE. coli/lip, состав которых подобран оптимальным образом, в среднем на порядок активнее прототипа. Способ приготовления биокатализаторов отличается простотой, сравнительно низкой стоимостью и доступностью структурообразователя (SiO₂-гидрогеля), а также влагоудерживающих агентов, не требует использования токсичных реагентов и сшивающих агентов. Биокатализаторы приготовлены в виде механически прочных гранул, что позволяет осуществить процессы переэтерификации растительных масел как в периодическом в реакторах смешения, так и непрерывном режимах в проточных реакторах с неподвижным слоем.