Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИНЫ, АССОЦИИРОВАННОЙ ПРОТИВ ЭШЕРИХИОЗА, СТРЕПТОКОККОЗА И СТАФИЛОКОККОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

Изобретение относится к ветеринарной медицине, в частности к способу изготовления вакцин, и может быть использовано в научно-исследовательских и производственных учреждениях, занимающихся конструированием биопрепаратов, а также на предприятиях биологической промышленности.

Известен способ получения поликомпонентной вакцины для иммунопрофилактики инфекций, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами (патент РФ на изобретение №2083223 от 27.05.94, МКИ A61K 39/116, 39/02, 39/085, 39/108), включающий раздельное культивирование штаммов Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris ГИСК №177, Escherichia coli К-100 №147 и Staphylococcus aureus ГИСК №1991 с последующим экстрагированием протективных антигенов и их смешиванием, при этом из клебсиелл используют штамм Klebsiella pneumoniae ГИСК №204 и культивируют его на среде Вольфель-Фергюссона, из стафилококков дополнительно используют штамм Staphylococcus aureus ГИСК №1981 и производственные штаммы Staphylococcus aureus ГИСК №5, Staphylococcus aureus ГИСК №9, при этом экстракцию антигенов из клеток клебсиелл, протей и кишечной палочки проводят гидроксиламином, а из клеток стафилококка водной экстракцией и полученные антигены смешивают в соотношении 0,6; 0,6; 0,6 и 0,8 мг соответственно на 1 мл дистиллированной воды.

Недостатком указанного способа получения вакцины является сложная технология, используется только для человека. В ветеринарной практике не применяется.

Известен способ получения ассоциированной вакцины для профилактики инфекций, вызываемых условно-патогенными бактериями (патент РФ на изобретение №2035189 от 02.01.86, МКИ A61K 39/125, 39/135). Данный способ включает раздельное выделение протективных антигенов: из штамма Staphylococcus aureus № Б-243 выделяют цитоплазматический антиген, из токсинпродуцирующего штамма Pseudomonas aeruginosa НИИЭМ № РА-7 получают анатоксин синегнойной палочки, из клинических штаммов Proteus mirabillis №6, 8, 40, 508, 1115, 4641 выделяют растворимые антигены, смешивают в физрастворе из расчета содержания их в 1 мл вакцины 0,15-0,2 мг белка, 15-30 мкг белка, 10-20 мкг белка соответственно и в смесь дополнительно добавляют коммерческий стафилококковый анатоксин и гидроокись алюминия в количестве 5-10 ЕС и 1-2 мг соответственно. Указанный способ принят за прототип.

Недостатком указанного аналога является сложность технологии получения ассоциированной вакцины, а описанная вакцина имеет ограниченную протективную активность.

Техническим результатом изобретения является получение безвредной и высокоиммуногенной ассоциированной вакцины против эшерихиоза, стрептококкоза и стафилококкоза крупного рогатого скота путем введения новых чистых культур возбудителей, простая, доступная технология.

Технический результат достигается тем, что в способе изготовления вакцины, ассоциированной против эшерихиоза, стрептококкоза и стафилококкоза крупного рогатого скота, включающем раздельное получение антигенов с последующим их смешиванием, внесение адъюванта, согласно изобретению проводят отбор патологического материала от больного и павшего крупного рогатого скота из местного эпизоотического очага, затем из отобранного патологического материала приготавливают суспензию и далее делают посев на дифференциально-диагностические среды, после чего выделяют клетки чистых культур возбудителей эшерихиоза Escherichia coli, стрептококкоза Streptococcus pneumoniae и стафилококкоза Staphylococcus aureus, затем раздельно выращивают клетки чистых культур возбудителей эшерихиоза, стрептококкоза и стафилококкоза в мясо-пептонном бульоне с добавлением глюкозы до 0,2%-ной концентрации с титром 4-5 млрд микробных клеток в 1 см³, после этого раздельно инактивируют клетки чистых культур возбудителей эшерихиоза, стрептококкоза и стафилококкоза формалином до 0,4-0,5%-ной конечной концентрации при температуре 37°C в течение 72-96 часов при периодическом перемешивании, потом смешивают клетки чистых культур возбудителей эшерихиоза Escherichia coli, стрептококкоза Streptococcus pneumoniae и стафилококкоза Staphylococcus aureus в равных соотношениях, затем в смесь инактивированных клеток чистых культур вносят адъювант, качестве которого используют гидроокись алюминия в количестве 20% к объему, а перед фасовкой тщательно перемешивают конечный продукт.

Новизна заявляемого предложения обусловлена тем, что в отличие от известных способов, проводят отбор патологического материала от больного и павшего крупного рогатого скота из местного эпизоотического при эшерихиозе, стрептококкозе и стафилококкозе, из которого приготавливают суспензию, выделяют клетки чистых культур возбудителей посевом на дифференциально-диагностические среды, раздельно выращивают клетки чистых культур возбудителей эшерихиоза Escherichia coli, стрептококкоза Streptococcus pneumoniae и стафилококкоза Staphylococcus aureus и получают концентрацию микробных клеток не менее 4-5 млрд в 1 см³, инактивируют формалином и смешивают инактивированные клетки чистых культур в равных соотношениях, что позволяет полностью подавить патогенность и сохранить высокую иммуногенность против эшерихиоза, стрептококкоза и стафилококкоза.

Раздельное выращивание возбудителей с содержанием 0,2% глюкозы позволяет получать концентрацию бактериальных клеток не менее 4 млрд в 1 см³ в течение 12-14 часов инкубирования. Использование формалина для инактивации в 0,4-0,5%-ной конечной концентрации позволяет в течение 72-96 часов при температуре 37°C подавить патогенность и сохранить высокую иммуногенность в течение 12 месяцев хранения. Адсорбирование трех антигенов на гидроокиси алюминия позволяет через 12-15 суток после двукратного введения с интервалом 7-14 дней в дозе коровам по 5,0 см³, телятам в возрасте 1,0-1,5 месяца - в дозе 1,5-2,0 см³ обеспечить у привитых животных формирование напряженного иммунитета против эшерихиоза, стрептококкоза и стафилококкоза, продолжительностью не менее 9 мес. (срок наблюдения).

Способ обеспечивает получение безвредной, высокоиммуногенной, специфичной вакцины для защиты крупного рогатого скота против эшерихиоза, стрептококкоза и стафилококкоза.

По данным патентной и научно-технической литературы не обнаружена аналогичная заявляемой совокупность признаков, что позволяет судить об изобретательском уровне заявленного технического решения.

Что касается критерия «промышленная применимость», то компоненты, входящие в состав вакцины, известны и широко применяются в ветеринарной практике при изготовлении инактивированных вакцин: ассоциированная вакцина против сальмонеллеза, пастереллеза и энтерококковой инфекции поросят ТУ 10.09-62-90, утверждено 01.08.90 г., инструкция по изготовлению и контролю данной вакцины утверждена Главным управлением ветеринарии 16.07.90 г.; вакцина против энтерококковой инфекции телят, ягнят и поросят ТУ 10.09-91-90, утверждено 15.12.90 г. представлены все необходимые сведения о микроорганизмах.

Методы выделения чистой культуры возбудителя эшерихиоза и характеристика описаны в «Методических указаниях по бактериологической диагностике колибактериоза (эшерихиоза) животных», утвержденных 27.07.2000 г. №13-7-2/2117, Департаментом ветеринарии МСХ РФ, описана характеристика эшерихий в справочнике «Определитель зоопатогенных микроорганизмов» под редакцией профессора Сидорова М.А., М.: Колос, 1995, стр.196-201, а также в «Практикуме по ветеринарной микробиологии и иммунологии», авторы: Костенко Т.С., Родионова В.Б., Скородумов Д.И., М.: Колос, 2001, стр.219-222.

Методы выделения и характеристика стрептококков и стафилококков описаны в справочнике «Определитель зоопатогенных микроорганизмов» под редакцией профессора Сидорова М.А., М.: Колос, 1995, стр.90-95; в «Практикуме по ветеринарной микробиологии и иммунологии», авторы: Костенко Т.С., Родионова В.Б., Скородумов Д.И., М.: Колос, 2001, стр.165-171; в справочнике «Микробиологическая диагностика бактериальных болезней животных», авторы: Скородумов Д.И., Субботин В.В., Сидоров М.А., Костенко Т.С., М.: ИзограФъ, 2005, стр.246-257; в «Методических указаниях по лабораторной диагностике стрептококкоза животных», утвержденных 25.09.1990 г. Главным управлением ветеринарии с государственной инспекцией при Государственной комиссии СМ СССР по продовольствию и закупкам.

Способ изготовления вакцины, ассоциированной против эшерихиоза, стрептококкоза и стафилококкоза крупного рогатого скота, осуществляют следующим образом. Проводят отбор патологического материала от больного и павшего крупного рогатого скота из местного эпизоотического очага. Затем из отобранного патологического материала приготавливают суспензию и далее делают посев на дифференциально-диагностические среды. После чего выделяют клетки чистых культур возбудителей эшерихиоза Escherichia coli, стрептококкоза Streptococcus pneumoniae и стафилококкоза Staphylococcus aureus. Затем раздельно выращивают клетки чистых культур возбудителей эшерихиоза, стрептококкоза и стафилококкоза в мясо-пептонном бульоне с добавлением глюкозы до 0,2%-ной концентрации с титром 4-5 млрд микробных клеток в 1 см³. После этого раздельно инактивируют клетки чистых культур возбудителей эшерихиоза, стрептококкоза и стафилококкоза формалином до 0,4-0,5%-ной конечной концентрации при температуре 37°C в течение 72-96 часов. Потом смешивают инактивированные клетки чистых культур возбудителей эшерихиоза Escherichia coli, стрептококкоза Streptococcus pneumoniae и стафилококкоза Staphylococcus aureus в равных соотношениях. Затем в смесь инактивированных клеток чистых культур вносят адъювант, в качестве которого используют гидроокись алюминия в количестве 20% к объему. Перед фасовкой тщательно перемешивают конечный продукт.

Пример конкретного осуществления способа изготовления вакцины.

Для изготовления вакцины, ассоциированной против эшерихиоза, стрептококкоза и стафилококкоза крупного рогатого скота, проводят отбор патологического материала от больного и павшего крупного рогатого скота из местного эпизоотического очага, из которого приготавливают суспензию и проводят бактериологические исследования с целью выделения чистых культур возбудителей.

Для определения морфологии и тинкториальных свойств возбудителя эшерихиоза готовят мазки из патологического материала от больного и павшего крупного рогатого скота путем прикосновения обезжиренным стеклом к свежему разрезу пораженной ткани и последующей фиксацией над пламенем спиртовки, окрашивают их по методу Грама. При микроскопировании полученного препарата под иммерсионной системой микроскопа наблюдают толстые палочки с закругленными концами красного цвета, расположенные одиночно, что характерно для Escherichia coli.

Для определения культуральных свойств возбудителя эшерихиоза Escherichia coli делают посевы выделенной культуры из патологического материала в мясо-пептонный бульон (МПБ), на среду Эндо, на мясо-пептонный агар (МПА) и инкубируют в термостате при 37°C в течение 16-24 часов. На чашках Петри с МПА вырастают влажные колонии с ровными краями и гладкой поверхностью серого цвета. В пробирках с МПБ наблюдали равномерное помутнение питательной среды с небольшим осадком, разбивающимся при встряхивании. В чашках Петри, на среде Эндо наблюдают рост колоний малиново-красного цвета с розовым ободкам диаметром 2-3 мм, характерные для Escherichia coli.

При определении биохимической активности чистых баккультур проводят посевы на дифференциально-диагностические среды с различным набором компонентов. Для Е. coli характерно расщепление глюкозы и лактозы с образованием кислоты и газа, выделение индола, отсутствие уреазы.

Патогенность чистых выделенных культур определяют путем внутрибрюшинного заражения белых мышей массой 14-18 г. Через 2-4 суток наблюдения все зараженные лабораторные животные погибают при 100% сохранности в контроле. Для подтверждения специфичности гибели мышей из паренхиматозных органов павших мышей приготавливают мазки-отпечатки, окрашивают их по методу Грама. При микроскопировании под иммерсионной системой микроскопа в препаратах видны толстые палочки с закругленными концами красного цвета, расположенные одиночно, характерные для Е. coli. Серологическую типизацию кишечной палочки проводят в реакции агглютинации с набором типоспецифических сывороток по общепринятой методике в пробирках.

В реакции агглютинации исследуемая культура кишечной палочки реагирует с колисывороткой (Escherichia coli), виден хлопьевидный осадок (положительный результат) при отрицательном контроле.

Для определения морфологии и тинкториальных свойств возбудителя стрептококкоза готовят мазки-отпечатки из пораженных органов павших KPC, окрашивают их по методу Грама. При микроскопии препаратов под иммерсионной системой микроскопа наблюдают мелкие кокки в виде цепочек, окрашенные в фиолетовый цвет, характерные для рода Streptococcus. Для определения культуральных свойств возбудителя делают посевы выделенной культуры из патматериала в мясо-пептонный бульон с добавлением глюкозы до 0,2%-ной конечной концентрации и 10% инактивированной сыворотки лошади (МПБ), в чашки Петри с мясо-пептонным агаром (МПА) с добавлением глюкозы до 0,2%-ной конечной концентрации и 5% дефибринированной крови кролика. Через 18-20 часов инкубирования в термостате при температуре 37°C наблюдают в МПБ рост с равномерным помутнением среды. В чашках Петри на глюкозо-кровяном МПА наблюдают рост круглых, полупрозрачных, плоских, с приподнятым центром и краями колонии, с зоной гемолиза типа «альфа», что характерно для Str. pneumoniae.

Для определения морфологии и тинкториальных свойств возбудителя стафилококкоза готовят мазки из патологического материала от больного и павшего крупного рогатого скота путем прикосновения обезжиренным стеклом к свежему разрезу пораженной ткани и последующей фиксацией над пламенем спиртовки, окрашивают их по методу Грама. При микроскопировании препаратов под иммерсионной системой микроскопа наблюдают шаровидной формы синего цвета, расположенные группами кокки, характерные для рода Staphylococcus.

Для определения культуральных свойств возбудителя стафилококкоза делают посевы выделенной культуры из патологического материала в мясо-пептонный бульон (МПБ), на дифференциально-диагностические среды (солевой МПА, МПБ с 8-10% хлорида натрия, желточно-солевой агар с добавлением 0,1%-ного кристаллвиолета - на этой среде колонии оранжевого цвета), на мясо-пептонный агар (МПА) и инкубируют в термостате при 37°C в течение 18-24 часов. На чашках Петри с МПА вырастают гладкие, прозрачные, бесцветные колонии с ровными краями. В пробирках с МПБ наблюдают интенсивное помутнение питательной среды с образованием осадка. В чашках Петри вырастают колонии с гладкой поверхностью, ровными краями золотистого цвета, что характерно для рода Staphylococcus.

Для выделенной чистой культуре возбудителя стафилококкоза Staph. aureus характерно образование капсулы, выделение гемолизина, фибринолизина, желатиназы, лецитиназы.

Патогенность и специфичность чистой выделенной культуры определяют путем внутрибрюшинного заражения белых мышей массой 14-18 г. Через 2-4 суток наблюдения все зараженные лабораторные животные погибают при 100% сохранности в контроле. Для подтверждения специфичности гибели белых мышей из паренхиматозных органов павших мышей готовят мазки-отпечатки, окрашивают их по методу Грама. При микроскопировании под иммерсионной системой микроскопа наблюдают тонкие палочки красного цвета, расположенные одиночно, характерные для Staph. aureus.

Для дифференциации стрептококков от стафилококков используют каталазную пробу. При постановке каталазной пробы на предметное стекло наносят каплю свежеприготовленного 3%-ного раствора перекиси водорода. Бактериологической петлей снимают одну колонию исследуемой культуры и растирают ее в капле перекиси водорода. Стафилококки, в отличие от стрептококков, образуют каталазу и вызывают пенообразование. Для предварительной идентификации стрептококков и энтерококков баккультуру высевают в пробирки с 10%, 40% желчи, с 6,5% хлористого натрия, с углеводами (раффинозой, сорбитом, маннитом), учитывают рост в жидкой среде и гемолиз на МПА с кровью.

В результате в пробирках с желчью наблюдают диффузный рост баккультуры, отмечают ферментацию маннита. На МПА с кровью наблюдают неполный гемолиз эритроцитов с образованием вокруг колоний зеленоватой зоны, что характерно для стрептококков.

Выделенные таким образом клетки чистых культур возбудителей эшерихиоза Е. coli, стрептококкоза Streptococcus pneumoniae и стафилококкоза Staphylococcus aureus используют для изготовления вакцины.

Выращивание клеток чистых культур возбудителей проводят раздельно в мясо-пептонном бульоне. Для заражения берут по 5 см³ свежей чистой культуры возбудителей эшерихиоза Escherichia coli, стрептококкоза Streptococcus pneumoniae и стафилококкоза Staphylococcus aureus на 1000 см³ мясо-пептонной питательной среды с добавлением глюкозы до 0,2%-ной концентрации и раздельно выращивают при 37°C в течение 12-14 часов. Концентрацию микробных клеток в бактериальной массе определяют по стандарту мутности и разводят стерильной дистиллированной водой до концентрации 4-5 млрд в 1 см³. Инактивацию полученного баксырья проводят внесением формалина 0,4-0,5%-ной конечной концентрации, выдерживают при температуре 37°C в течение 72-96 часов при периодическом перемешивании.

Таким образом, использование для изготовления вакцины, ассоциированной против эшерихиоза, стрептококкоза и стафилококкоза крупного рогатого скота клеток чистых культур возбудителей Escherichia coli, Streptococcus pneumoniae и Staphylococcus aureus, выделенных из местного эпизоотического очага, позволяет получать специфичную, безвредную, высокоиммуногенную ассоциированную вакцину для защиты от этих трех опасных инфекционных болезней: эшерихиоза, стрептококкоза и стафилококкоза крупного рогатого скота. После введения животным высокоиммуногенной ассоциированной вакцины внутримышечно не вызывает у них поствакцинальных осложнений (таблица 1).

Таким образом, данные таблицы 1 показывают преимущества предлагаемого способа изготовления вакцины, ассоциированной против эшерихиоза, стрептококкоза и стафилококкоза крупного рогатого скота, по сравнению с прототипом. Предложенный способ прост в исполнении, доступен и является промышленно применимым.