СПОСОБ ОЦЕНКИ АНТИОКСИДАНТНОЙ ЗАЩИТЫ ОРГАНИЗМА ЧЕЛОВЕКА

Изобретение относится к области медицины, а именно к способам определения антиоксидантной защиты организма человека и может быть использовано при диагностике и лечении различных заболеваний, сопровождающихся нарушением антиоксидантной защиты.

В процессе адаптации человека к изменяющимся условиям окружающей среды выработались механизмы защиты организма, в том числе с вовлечением в процесс окислительных реакций образования свободных радикалов, губительно действующих на патогены окружающей среды (бактерии, вирусы). Эти радикалы образуются при одноэлектронном окислении молекул и при участии металлов переменной валентности (Fe, Cu, Са и другие). Радикалы выполняют важные физиологические функции, но избыток или недостаток их вреден для организма человека.

Вторичные свободные радикалы образуются из первичных при разложении перекиси водорода и липидных перекисей под действием Fe²⁺. Они запускают цепные реакции перекисного окисления липидов (ПОЛ) и оказывают на клетки организма человека разнообразное негативное воздействие (цитотоксическое, мутагенное и др.), повреждают клетки и вызывают патологические изменения в органах и тканях.

Третичные радикалы вступают во взаимодействие с молекулами антиоксидантов, в результате чего образуются радикалы с малой реакционной способностью, что замедляет процессы ПОЛ, но не обрывает их полностью.

Антибактериальная защита при избытке свободных радикалов вызывает тяжелые повреждения. Попытки нейтрализовать радикалы ферментами, включающими металлы (Fe, Cu), каталазой, пероксидазой оказываются недостаточными и в организме образуются активированные кислородные метаболиты (АКМ), источником которых в том числе являются радикальные окислительные реакции и металлопротеиновые ферментативные системы.

Особая роль в этом отводится Fe, которое выполняет важные физиологические функции в эритропоэзе, транспорте О₂ к тканям, в том числе с гемоглобином. В то же время Fe обладает способностью запускать свободнорадикальные реакции, в том числе ПОЛ.

К антиоксидантам, зависящим от железа, относятся ферменты: супероксиддисмутаза (СОД-дисмутаза), каталаза, другие вещества: аскорбиновая кислота, ретинол, α-токоферол, церулоплазмин. К химическим элементам, которые обладают антиоксидантными свойствами, относятся Se, Zn, Co, Mn.

СОД-дисмутаза включает два металла с антиоксидантными свойствами: Cu и Zn. Антиоксидантным свойством обладает церулоплазмин или ферроксидаза, в состав которой входит три процента всей меди организма. Накопление свободных радикалов не только повреждает ткани, но приводит к неопластической трансформации клеток, злокачественным опухолям.

В последние десятилетия все больше внимания уделяется тому, что концентрация металлов с про- и антиоксидантными свойствами играет ведущую роль в балансе антиоксидантной защиты (АОЗ) организма человека и имеет огромное значение для нормального функционирования обменных процессов в организме человека.

Одна из систем для определения антиоксидантной активности (АОА) была предложена в 1974 году. В этой системе можно выявить активность в межклеточной жидкости ионов Fe²⁺, вклад в АОА церулоплазмина - транспортного белка для Cu²⁺, белка трансферрина - переносчика для Fe²⁺ и альбумина. Иные компоненты общей АОА в плазме крови в этой системе действие не проявили.

В патогенезе многих болезней и патологических процессов играет важную роль окислительный стресс. Метод кинетики хемилюминесценции оказывается полезным при изучении таких патологий, поскольку дает возможность измерять уровень свободных радикалов, оценивать параметры антиоксидантной защиты и влияние антиоксидантов. Комплекс активных радикалов, которые образуют и секретируют нейтрофилы в межклеточную среду, определяют методом амперометрии (1-7).

Присутствующие в крови человека химические элементы играют значимую роль в жизненнонеобходимых окислительно-восстановительных процессах, при недостатке их нарушаются процессы роста и развития организма человека.

Известно влияние химических элементов: железа, меди, цинка в составе ферментов в создании про- и антиоксидантных систем (см. Горожанская Э.Г. Свободнорадикальное окисление и механизмы антиоксидантной защиты в нормальной клетке и при опухолевых заболеваниях. Клиническая лабораторная диагностика, 2010, №6, с.28-45).

Обоснована важность антиоксидантной защиты, описаны этапы формирования перекисного окисления липидов (ПОЛ) и образование активированных кислородных метаболитов (АКМ), которые сдерживаются на низком уровне системой ферментативных и неферментативных антиоксидантов, в которые входят химические элементы.

Недостатком является то, что для определения антиоксидантной защиты исследуют роль только одного химического элемента - железа в активации процесса ПОЛ.

Известно определение антиокислительной активности плазмы крови (см. В.В. Титов, В.В. Крылин, В.А. Дмитриев, Я.И. Яшин. Антиокислительная активность плазмы крови - тест нарушения биологических функций эндоэкологии, экзоэкологии и реакции воспаления. Клиническая лабораторная диагностика, 2010, №7 с.10-14).

Компоненты антиоксидантной защиты определяют методом электрохимии на жидкостном хроматографе (без колонки) при использовании амперометрического детектора. Рассматривают только два химических элемента: железо, входящее в транспортный белок, и медь, входящая в состав церулоплазмина, их роль в образовании активных форм кислорода и антиоксидантной активности (АОА). Активные формы кислорода определены с помощью превращения Fe³⁺ в Fe²⁺.

Недостатком определения антиокислительной активности плазмы крови является определение только двух компонентов антиоксидантной защиты, влияние других химических элементов не рассмотрено.

Также известна работа, авторы которой выделили показатели, характеризующие антиоксидантную защиту (см. Л.И. Колесникова, И.М. Мадаева, Н.В. Семенова и др. Антиоксидантный потенциал крови у мужчин с абструктивными нарушениями дыхания во время сна. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2012, т. 154, №12, с.695-697).

Интенсивность ПОЛ и общую антиоксидантную защиту оценивают спектрометрическими методами по определению продуктов ПОЛ, малонового диальдегида в реакции с ТБК флуориметрическим методом, а также по содержанию α-токоферола и ретинола, восстановленного и окисленного глутатиона. Об активности СОД-дисмутазы судят по динамике аутоокисления адреналина. Были выделены две группы показателей: одна характеризовала антиоксидантную защиту человека, другая группа характеризовала прооксидантную защиту человека и определяли суммарный показатель антиоксидантного потенциала (АОП) по формуле. Использовались относительные величины, а результат сравнивался с контролем, принятым за единицу. Значение ближе к единице позволяет судить о равновесии между прооксидантной и антиоксидантной группой, значение меньше единицы - сдвиг в сторону прооксидантной активности, больше единицы - достаточная антиоксидантная защита. Так, например, показатель в 0,75 свидетельствует о выраженном дисбалансе в системе ПОЛ - АОЗ в сторону активности прооксидантов.

Недостатком является то, что химические элементы с разной про- и антиоксидантной активностью определяют разными методами, которые обладают разными степенями чувствительности и специфичности, что приводит к ошибкам при определении проб подготовки.

Наиболее близким к способу определения антиоксидантной защиты организма человека является «Способ оценки анти-, прооксидантного статуса организма путем определения антиоксидантного потенциала (АОП)» (патент РФ №2194984, МПК G01N 33/48).

Для определения антиоксидантной защиты сопоставляют про- и антиоксиданты, измеряют показатели антиоксидантной защиты как на субстратном (восстановленный глутатион, токоферол, ретинол), ферментном уровнях (глутатионпероксидаза, глутатионредуктаза), так и на неспецифическом (хемилюминесцентный метод регистрации ПОЛ) уровне, которые обладают ограниченной информацией и только опосредованно характеризуют химические элементы.

Вклад всех акцепторов активных форм кислорода в общую антиоксидантную активность можно было бы определить при оценке всех ее составляющих. Однако на практике это оказывается невозможным: во-первых, из-за технических сложностей определения всех акцепторов АФК, низкой их концентрации, и, во-вторых, из-за синергизма и непростых взаимодействий гидрофобных и гидрофильных, экзогенных и эндогенных акцепторов АФК, которые постоянно присутствуют в физиологических жидкостях, липопротеидах, фракции плазматических мембран клеток и гомогенатах тканей.

К недостаткам данного способа относится то, что применяют разные методы для регистрации компонентов ПОЛ, что приводит к неустойчивым динамическим характеристикам.

Задачей данного изобретения является повышение объективности и достоверности оценки антиоксидантной защиты организма человека.

В ходе работы впервые исследуется антиоксидантная защита по химическим элементам с про- и антиоксидантными свойствами, в то время как раньше определяли только результаты деятельности этих химических элементов.

Сущность данного способа оценки антиоксидантной защиты организма человека (АОЗ) заключается в том, что измеряют содержание химических элементов в крови человека рентгенофлуоресцентным методом с использованием синхротронного излучения, определяют соотношение суммы значений содержания химических элементов с прооксидантными свойствами к сумме значений химических элементов с антиоксидантными свойствами по формуле:

,

где x_i - значение химических элементов в крови человека с прооксидантными свойствами;

y_i - значение химических элементов в крови человека с антиоксидантными свойствами;

n - количество измеренных химических элементов в крови человека,

сравнивают с аналогичным соотношением химических элементов для «условно здорового человека», и при полученном значении АОЗ больше, чем значение АОЗ для «условно здорового человека», судят о снижении антиоксидантной защиты организма человека.

Способ осуществляют следующим образом.

Для определения содержания химических элементов в организме человека берут 25 мкл крови из пальца человека, наносят на бумажный фильтр (Whatman grade 41) площадью 1 см², высушивают на воздухе и помещают в тефлоновые кольца (держатели), процесс подготовки образцов описан в работах. Содержание химических элементов в анализируемых образцах определяют с применением «внешнего стандарта» (8-11).

Затем методом рентгенофлуоресцентного анализа с использованием синхротронного излучения (РФА СИ) на экспериментальной станции Рентгенофлуоресцентного элементного анализа Сибирского Центра Синхротронного и Терагерцового Излучения Института ядерной физики им. Г.И. Будкера Сибирского отделения РАН (накопитель ВЭПП-3) по специальной программе и алгоритму определяют содержание химических элементов.

Использование синхротронного излучения как источника рентгеновских квантов позволяет существенно улучшить параметры традиционного метода рентгенофлуоресцентного анализа, расширить диапазон анализируемых элементов (от калия до урана), проводить измерения, не разрушая анализируемый образец, уменьшить требования к размерам и массе образца (от 1 мг), уменьшить время проведения анализа. Естественная поляризация синхротронного излучения позволяет уменьшить фон, вызванный рассеянным излучением образца, и уменьшить предел обнаружения (10^-7 г/г).

Точность содержания химических элементов получают при многократных измерениях одного и того же образца (20 параллельных измерений).

Таким образом, абсолютные величины содержания химических элементов в исследуемом образце с разной про- и антиоксидантной активностью определяют одним методом с одинаковой степенью точности, а это позволяет провести корректный статистический анализ.

Определение оценки АОЗ проведено на примере восьми химических элементов: четырех химических элементов с прооксидантными свойствами - Fe, Cu, Pb, Cr и четырех химических элементов с антиоксидантными свойствами - Se, Zn, Co, Mn.

За условный норматив про- и антиоксидантной защиты организма человека принята величина, которая рассчитывается согласно уровня концентрации химических элементов в крови для «условно здорового человека» по Эмсли (12), которые приведены в таблице:

Расчетная величина антиоксидантной защиты для «условно здорового человека» определяется как соотношение суммы значений химических элементов с прооксидантными свойствами к сумме значений химических элементов с антиоксидантными свойствами

При значении АОЗ более 61,4 имеет место снижение антиоксидантной защиты человека.

Способ оценки антиоксидантной защиты организма человека был разработан на основе результатов исследования группы больных с сердечно-сосудистой патологией кардиологического отделения клиники НИИ терапии СО РАМН, в которую вошли 37 пациентов.

Клинические примеры

Пример 1. Больной М., мужчина, возраст 46 лет.

Клинически, лабораторно и инструментально подтвержден диагноз: ишемическая болезнь сердца.

Проведены биохимические методы исследования: общий холестерин - 7,60 ммоль/л, триглицериды - 9,84 ммоль/л, гиперхолестеринемия (ГХС, общий холестерин > 5,2 ммоль/л) - есть, гипертриглицеридемия (ГТГ, когда триглицериды > 1,7 ммоль/л) - есть; АЛТ - 25,80 ед/л, ACT - 26,00 ед/л, мочевина - 6,89 моль/л, глюкоза крови - 5,76 ммоль/л; курит;

ИМТ - 27,8 кг/м²;

Электрокардиографические показатели: продолжительность интервалов во II стандартном отведении: PQ - 0,15 мм, QRS - 0,10 мм, нарушения проводимости - есть; гемодинамические показатели: систолическое АД (САД) - 140,0 мм рт.ст.; диастолическое АД (ДАД) - 90,0 мм рт.ст., пульсовое АД (ПАД) - 50 мм рт.ст., пульс 72,0 уд/мин, артериальная гипертензия - есть.

Исследовано содержание химических элементов в крови: Fe - 762,0 мкг/мл; Cu - 9,84 мкг/мл; Pb - 1,8 мкг/мл; Cr - 2,45 мкг/мл; Se - 0,01 мкг/мл; Zn - 10,9 мкг/мл; Co - 0,04 мкг/мл; Mn - 0,07 мкг/мл.

Рассчитывается значение АОЗ как соотношение суммы значений химических элементов с прооксидантными свойствами к сумме значений химических элементов с антиоксидантными свойствами:

Полученное значение АОЗ=70, это больше, чем значение АОЗ для «условно здорового человека» равное 61,4. Имеет место снижение антиоксидантной защиты.

Пример 2. Больной Р., мужчина, возраст 50 лет.

В результате клинического, инструментального, функционального и лабораторного обследования установлен клинический диагноз: ишемическая болезнь сердца.

Биохимические методы исследования: общий холестерин - 6,40 ммоль/л, ГХС - есть, триглицериды - 1,92 ммоль/л, ГТГ - есть; холестерин липопротеидов низкой плотности - 5,2 ммоль/л, гипер-ХС-ЛНП (ХС-ЛНН > 3,0 ммоль/л) - есть; холестерин липопротеидов высокой плотности - 1,0 ммоль/л, гипо-ХС-ЛВП (ХС-ЛВП < 1,0 ммоль/л) - нет, индекс атерогенности 1 (ХС-ЛНП/ХС-ЛВП) - 5,02, индекс атерогенности 2 (ОХС - ХС-ЛВП)/ХС-ЛВП - 5,4; АЛТ - 56,0 ед/л, ACT - 31,4 ед/л, мочевина - 7,7 моль/л, глюкоза крови - 4,4 ммоль/л;

курит;

ИМТ-28,41 кг/м².

Электрокардиографические показатели: продолжительность интервалов во II стандартном отведении: PQ - 0,14 мм, QRS - 0,14 мм, нарушения проводимости - есть; гемодинамические показатели: систолическое АД (САД) - 100,0 мм рт.ст.; диастолическое АД (ДАД) - 65,0 мм рт.ст., пульсовое АД (ПАД) - 35 мм рт.ст., пульс 100,0 уд/мин, артериальная гипертензия - нет.

Исследовано содержание химических элементов в крови: Fe - 816,0 мкг/мл; Cu - 9,4 мкг/мл; Pb- 2,3 мкг/мл; Cr - 0,85 мкг/мл; Se - 0,01 мкг/мл; Zn - 4 мкг/мл; Co - 0,04 мкг/мл; Mn - 0,08 мкг/мл.

Рассчитывается значение АОЗ как соотношение суммы значений химических элементов с прооксидантными свойствами к сумме значений химических элементов с антиоксидантными свойствами:

Полученное значение АОЗ=207, это больше, чем значение АОЗ для «условно здорового человека», равное 61,4. Имеет место значительное снижение антиоксидантной защиты.

Пример №3. Больной С., мужчина, возраст 47 лет.

В результате клинического, инструментального, функционального обследования установлено, что признаков ишемической болезни сердца нет.

Биохимические методы исследования: общий холестерин - 6,2 ммоль/л, ГХС - есть, триглицериды - 1,74 ммоль/л, ГТГ - есть, ХС-ЛНП - 4,9 ммоль/л, гипер-ХС-ЛНП - есть, ХС-ЛВП - 0,95 ммоль/л, гипо-ХС-ЛВП - есть, ИА1 - 5,16, ИА2 - 5,53; АЛТ - 24,7 ед/л, ACT - 20,9 ед/л, мочевина - 7,8 моль/л, глюкоза крови - 4,3 ммоль/л; не курит; ИМТ - 28,81 кг/м².

Электрокардиографические показатели: продолжительность интервалов во II стандартном отведении: PQ - 0,14 мм, QRS - 0,09 мм, нарушения проводимости - нет; гемодинамические показатели: САД - 130,0 мм рт.ст.; ДАД - 80,0 мм рт.ст., ПАД - 50 мм рт.ст., пульс 70,0 уд/мин, артериальная гипертензия - нет.

Содержание химических элементов: Fe 561 мкг/мл; Cu - 0,77 мкг/мл; Pb - 0,01 мкг/мл; Cr - 0,64 мкг/мл; Se - 0,63 мкг/мл; Zn - 10,0 мкг/мл; Co - 1,9 мкг/мл; Mn - 1,3 мкг/мл.

Рассчитывается значение АОЗ как соотношение суммы значений химических элементов с прооксидантными свойствами к сумме значений химических элементов с антиоксидантными свойствами:

Полученное значение АОЗ=41,2, это меньше, чем значение АОЗ для «условно здорового человека», равное 61,4. Антиоксидантная защита достаточная.

По мере появления новых научных данных об участии химических элементов в антиоксидантной защите организма человека будет увеличиваться и количество химических элементов, используемых для определения АОЗ. С увеличением числа химических элементов с прооксидантными свойствами (числитель формулы) и химических элементов с антиоксидантными свойствами (знаменатель) увеличивается надежность и достоверность оценки определения антиоксидантной защиты человека.

Литература:

1. Авцын А.П., Жаворонков А.А., Риш М.А., Строчкова Л.С. Микроэлементы человека. - М: Медицина, 1991, 496 с.

2. Под ред. А.А.Болдырева. Введение в биомембранологию. - М: Издательство Московского университета, 1990, 208 с.

3. Владимиров Ю.А., Арчиков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах.- М: Наука, 1972, 252 с.

4. Под ред. В.А.Тутельяна. Витамины и микроэлементы в клинической фармокологии. - М.: Палея-М, 2001, 506 с.

5. Лосев А.С., Фесюк А.Ф. Антиоксидантный потенциал (АОП) - системный критерий экологических нарушений и их коррекция / Сборник материалов Всероссийской научно-практической конференции "Здоровье в 21 веке", 28-30 сентября 2000, Тула, 2000, с.136,137.

6. Меньшикова Е.Б., Ланкин В.З., Зенков Н.К. и др. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты. - М.: Фирма «Слово», 2006, 556 с.

7. Тулеутаев М.Е. Особенности обмена микроэлементов при экспериментальном инфаркте миокарда на фоне общей управляемой гипертермии // Диссертация к.м.н. - Новосибирск, 2003, 131 с.

8. Baryshev V.B., Kulipanov G.N., Skrinsky A.N. REVIEW OF X-RAY FLUORESCENT ANALYSIS USING SYNCHROTRON RADIATION // Nucl. Instrum. Meth. Phys. Res., 1986, Т 246, 739-750.

9. Baryshev V.B., Bufetov N.S., Koutzenogii K.P., Makarov V.I., Smirnova A.I. Synchrotron Radiation Measurements Of The Elemental Composition Of Siberian Aerosols // Nucl. Instrum. Meth. Phys. Res., 1995, A 359, 297-301.

10. Савченко Т.И., Чайкина О.В., Ковальская Г.А., Осипова Л.П. Определение микроэлементного состава крови и волос тундровых ненцев методом рентгенфлуоресцентного анализа с использованием синхотронного излучения (РФА СИ) // Сибирский экологический журнал, 2000, 1, с.85-91.

11. Koutzenogii К., Savchenko Т., Chankina O., Kovalskaya G., Osipova L., Bgatov A.J. Synchrotron Radiation X-Ray Fluorescence Analysis (SRXRF) for Measuring the Multielement composition of samples of Biogenic Nature // Trace and Microprobe Techniques, 2003, 21(2), 311-326.

12. Эмсли Дж. Элементы. - М.: Мир, 1993, 256 с.