Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ОЧИСТКИ ВИРУСА ОСПОВАКЦИНЫ ИЛИ ЕГО РЕКОМБИНАНТНЫХ ВАРИАНТОВ

Изобретение относится к медицинской биотехнологии и может быть использовано при разработке и изготовлении средств специфической профилактики против вирусов оспы, а также для противоопухолевой терапии с помощью вируса осповакцины или его рекомбинантных вариантов.

Еще в начале двадцатого века была выявлена способность некоторых непатогенных вирусов человека избирательно разрушать раковые клетки. В настоящее время в качестве онколитических, т.е. лизирующих опухолевые клетки, агентов предлагаются в основном аттенуированные штаммы природных вирусов: герпеса, вируса осповакцины, аденовирусов, реовирусов, а также различные рекомбинантные вирусы, полученные из природных путем генно-инженерных манипуляций [1]. Селективная репликация онколитических вирусов в опухолевых клетках приводит к лизису этих клеток и распространению вирусов в другие опухолевые клетки. Таким образом, с помощью онколитических вирусов возможно эффективное лечение онкологических заболеваний, невосприимчивых к другим формам терапии. Клиническое подтверждение этому представлено в серии работ по локальному введению в опухоль различных онколитических вирусов [2, 3, 4]. Среди всех онколитических вирусов вирус осповакцины (ВОВ) является наиболее перспективным для применения в качестве онколитического агента. Для использования вируса осповакцины в противоопухолевой терапии и проведения специфической профилактики необходимо разработать дешевый и эффективный способ получения высококонцентрированного и очищенного препарата вируса осповакцины или его рекомбинантных вариантов.

Наиболее широко известными методами очистки и концентрирования вирусных частиц в настоящее время являются высокоскоростное центрифугирование в градиенте плотности сахарозы, концентрирование и экстракция вируса из вируссодержащей жидкости с помощью фреона 113 и эфира [5], а также метод зонного электрофореза [6]. Кроме того, известен способ очистки и концентрирования вирусов с помощью магнитоиммуносорбентов - твердых магнитных частиц с прикрепленными антителами, содержащих иммобилизованные антитела к вирусу [7].

Известен способ очистки ВОВ, включающий концентрирование вируса путем его связывания биоаффинным сорбентом, содержащим антитела к вирусу, иммобилизованные на полимерной основе, промывку и последующую десорбцию, при этом в качестве полимерной основы биоаффинного сорбента используют криогель поливинилового спирта с размером пор 0,04-2,0 мкм, активированный глутаровым альдегидом при pH 1,2, к которому ковалентно пришиты специфические антитела, полученные из сыворотки крови кроликов [8].

Недостатком данного способа является сложность получения биоаффинного сорбента, связанная с многостадийной схемой модификации неорганического носителя.

Наиболее ближайшим к заявляемому способу - прототипом, является способ очистки вируса коровьей оспы [9], заключающийся в следующем. Неочищенный вирусный исходный материал выдерживали при температуре -20°C, а затем оттаивали и один раз суспендировали в PBS (фосфатно-буферный раствор), после чего суспензию центрифугировали при 3000 об/мин в центрифуге Sorvall RC-3B при температуре 4°C в течение пяти минут. Полученный осадок суспендировали в десяти объемах буфера Трис 1 (10 мМ Трис-HCl, pH 9,0), и суспензию быстро обрабатывали ультразвуком (2 раза по 10 сек при мощности 60 Вт, при комнатной температуре) в целях последующего дезинтегрирования клеточного дебриса и высвобождения вирусных частиц из клеточного материала. Ядра клеток и большую часть клеточного дебриса удаляли путем быстрого центрифугирования суспензии на роторной центрифуге в течение 3 мин при 3000 об/мин при 10°C. Осадок снова один раз суспендировали в буфере Трис 1, обрабатывали ультразвуком и центрифугировали, как описано выше. Собранные супернатанты, содержащие свободные вирусные частицы, объединяли и наносили на 10 мл 36% сахарозы в 10 мМ Трис-HCl с pH 9,0, а затем центрифугировали в центрифуге Beckman SW 27/SW 28 при 13500 об/мин в течение 80 минут при температуре 4°C. Затем супернатант отбрасывали, а осадок, содержащий вирусные частицы, растворяли в 10 мл 1 мМ Трис-HCl с pH 9,0, гомогенизировали путем быстрой обработки ультразвуком (2 раза по 10 сек при мощности 60 Вт, при комнатной температуре) и наносили на градиент сахарозы 20-40% в 1 мМ Трис-HCl, pH 9,0 для последующей очистки. Центрифугирование проводили на роторной центрифуге Beckman, используя ротор SW41 при 13000 об/мин в течение 50 минут при температуре 4°C. После центрифугирования дискретные полосы, содержащие вирусные частицы, собирали, полученный раствор сахарозы разбавляли тремя объемами PBS и вирусные частицы снова осаждали центрифугированием (Beckman SW 27/28, 60 минут при 13500 об/мин, температура 4°C). Осадок, который состоял, главным образом, из чистых вирусных частиц, ресуспендировали в PBS и уравновешивали до средних концентраций вируса, составляющих в среднем (1-5)×10⁹ МЕ/мл. Раствор очищенного вирусного материала хранили при -80°C и использовали либо сразу, либо разводили PBS для проведения последующих экспериментов.

Недостатками прототипа являются трудоемкость, связанная со сложностью проведения заключительных стадий очистки и длительность способа за счет проведения многоступенчатых операций, приводящих к удорожанию и значительному удлинению процесса очистки.

Задачей заявляемого изобретения является разработка более простого и менее трудоемкого и длительного способа очистки вируса осповакцины, а также его рекомбинантных вариантов.

Техническим результатом данного изобретения является уменьшение трудоемкости, упрощение способа и сокращение его длительности при сохранении высокой степени очистки вирусного препарата.

Поставленная задача достигается предлагаемым способом, заключающимся в следующем.

Исходную вируссодержащую жидкость двукратно замораживают-оттаивают, затем обрабатывают на ультразвуковом гомогенизаторе на льду и центрифугируют 60 минут при 24000 об/мин (Beckman L8-70M, ротор SW27) при 4°C. Осадок ресуспендируют в буфере 0,05 М Трис-HCl, pH 9,0 и повторно обрабатывают на ультразвуковом гомогенизаторе. Затем полученную вируссодержащую суспензию инкубируют с трипсином (ТРСК трипсин, Sigma) в течение 10-30 мин при 37°C в концентрации 50-75 мкг/мл. Далее суспензию замораживают при -20°С. После размораживания вируссодержащую суспензию наносят на 36% раствор сахарозы и центрифугируют 90 минут при 30000 об/мин при 4°C (Beckman L8-70M, ротор SW40, США). Полученный осадок ресуспендируют в 0,05 М Трис-HCl, pH 9,0 и обрабатывают ультразвуком на льду в течение 5 сек. Полученный вирусный препарат расфасовывают в пробирки и хранят при -80°C. Предлагаемый способ позволяет получать препараты, обладающие высоким титром вируса (8,0±0,6×10⁹ БОЕ/мл), а также высокой степенью очистки. Предлагаемый способ также пригоден для очистки рекомбинантных вариантов вируса осповакцины.

Определяющими отличиями предлагаемого способа, по сравнению с прототипом, являются:

1. Обработанную ультразвуком вируссодержащую жидкость центрифугируют при 24000 об/мин, полученный осадок ресуспендируют в буфере и повторно обрабатывают на ультразвуковом гомогенизаторе, что позволяет выделить практически весь вирус, содержащийся в надклеточной жидкости, и вирус, связанный с мембранами клеток.

2. Полученную вируссодержащую суспензию обрабатывают модифицированным трипсином (преимущественно бессолевым трипсином, обработанным L-(тозиламидо-2-фенил)-этил-хлорометил кетоном) в течение 10-30 мин при 37°C в концентрации 50-75 мкг/мл, что позволяет отделить вирус от мембран клетки без потери инфекционных свойств вируса.

3. Обработанную трипсином суспензию замораживают при -20°C, что позволяет увеличить количество не связанного с мембранами вируса.

4. После размораживания вируссодержащую суспензию наносят на 36% раствор сахарозы и центрифугируют при 30000 об/мин, что позволяет осадить очищенные вирусные частицы и удалить клеточные мембраны.

Оказалось, что высокоскоростное центрифугирование вируссодержащей жидкости при 24000 об/мин (Beckman L8-70M, ротор SW27) (стадия 1) позволяет осадить весь вирус, а последующая обработка трипсином всего клеточного дебриса, содержащего вирус, способствует разрушению клеточного дебриса и высвобождению вируса, связанного с мембранами клетки. Заключительное высокоскоростное центрифугирование вируссодержащей суспензии при 30000 об/мин (Beckman L8-70M, ротор SW40, США) через подушку 36% сахарозы с последующей гомогенизацией осадка ультразвуком позволяет получить очищенный вирус и удалить клеточный дебрис.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения способа.

Пример 1. Неочищенный вирусный исходный материал, содержащий вирус осповакцины штамм LIVP, подвергали двукратному циклу замораживания-оттаивания. Титр вируса контролировали на каждом этапе очистки вируса. Титр вирусной суспензии после двукратного цикла замораживания-оттаивания составил 1.5×10⁶ БОЕ/мл. Вируссодержащую жидкость обрабатывали на ультразвуковом гомогенизаторе на льду в течение 2 минут по 10 сек с интервалом 5 сек и центрифугировали 60 минут при 24000 об/мин (Beckman L8-70M, ротор SW27) при 4°C. Титр вируса в супернатанте был меньше 10⁵ БОЕ/мл. Осадок ресуспендировали в буфере 0,05 М Трис-HCl, pH 9,0 и повторно обрабатывали на ультразвуковом гомогенизаторе. Затем полученную вируссодержащую суспензию инкубировали с трипсином (ТРСК трипсин, Sigma) в концентрации 50 мкг/мл в течение 10 мин при 37°C. Далее вируссодержащую суспензию наносили на 36% раствор сахарозы и центрифугировали 90 минут при 30000 об/мин при 4°C (Beckman L8-70M, ротор SW40, США). Полученный осадок ресуспендировали в 0,05 М Трис-HCl, pH 9,0 и обрабатывали ультразвуком на льду в течение 5 сек. Полученный вирусный препарат расфасовывали в пробирки и хранили при -80°C. В результате данной обработки был получен препарат, обладающий высоким титром вируса (3,0±0,7×10⁹ БОЕ/мл) и высокой степенью очистки. Электронная микрофотография полученного препарата представлена на фиг.1. По данным электронной микроскопии данный препарат содержит как отдельные частицы ВОВ, так и группы вирусных частиц, а также малое количество мембранных структур.

Пример 2. Неочищенный вирусный исходный материал, содержащий вирус осповакцины штамм LIVP, подвергали двукратному циклу замораживания-оттаивания. Титр вирусной суспензии после двукратного цикла замораживания-оттаивания составил 1.2×10⁶ БОЕ/мл. Вируссодержащую жидкость и вируссодержащий клеточный дебрис обрабатывали на ультразвуковом гомогенизаторе Sonopulse (Bandelin, Германия) на льду в течение 2 минут по 10 сек с интервалом 5 сек и центрифугировали 60 минут при 24000 об/мин при 4°C (Beckman L8-70M, ротор SW27, США). Титр вируса в супернатанте был меньше 10⁵ БОЕ/мл. Далее к осадку добавляли 18 мл буфера 0,05 М Трис-HCl, pH 9,0 и повторно обрабатывали на ультразвуковом гомогенизаторе Sonopulse (Bandelin, Германия) на льду в течение 2 минут по 10 сек с интервалом 5 сек. Далее суспензию замораживали при -20°C. После размораживания полученную вируссодержащую суспензию инкубировали с модифицированным трипсином (ТРСК трипсин, Sigma) в концентрации 75 мкг/мл в течение 20 минут при 37°C. Далее 9,5 мл вируссодержащей суспензии наносили на 2 мл 36% раствора сахарозы и центрифугировали 90 минут при 30000 об/мин при 4°C (Beckman L8-70M, ротор SW40, США). Полученный осадок ресуспендировали в 0,05М Трис-HCl, pH 9,0, обрабатывали ультразвуком на льду в течение 5 сек. Полученную вируссодержащую жидкость расфасовывали в пробирки 1,5 мл (Eppendorf, Германия) и хранили при -80°C.

В результате данной обработки был получен препарат, обладающий высоким титром вируса (8,0±0,6×10⁹ БОЕ/мл), а также высокой степенью очистки. Электронная микрофотография полученного препарата представлена на фиг.2. По данным электронной микроскопии препарат содержит гораздо меньше сгруппированных вирусных частиц, чем препарат, полученный по примеру 1, количество мембранных структур, относящихся к клеточному дебрису, также мало.

Пример 3. Неочищенный вирусный исходный материал, содержащий рекомбинантный вирус осповакцины штамм LIVP-GFP, дефектный по гену тимидинкиназы и экспрессирующий зеленый флуоресцентный белок, подвергали двукратному циклу замораживания-оттаивания. Титр вирусной суспензии после двукратного цикла замораживания-оттаивания составил 2,7×10⁶ БОЕ/мл. Вируссодержащую жидкость и вируссодержащий клеточный дебрис обрабатывали на ультразвуковом гомогенизаторе Sonopulse (Bandelin, Германия) на льду в течение 2 минут по 10 сек с интервалом 5 сек и центрифугировали 60 минут при 24000 об/мин при 4°C (Beckman L8-70M, ротор SW27, США). Титр вируса в супернатанте был меньше 10⁵ БОЕ/мл. Далее к осадку добавляли 18 мл буфера 0,05 М Трис-HCl, pH 9,0 и повторно обрабатывали на ультразвуковом гомогенизаторе Sonopulse (Bandelin, Германия) на льду в течение 2 минут по 10 сек с интервалом 5 сек. Далее суспензию замораживали при -20°C. После размораживания полученную вируссодержащую суспензию инкубировали с модифицированным трипсином (ТРСК трипсин, Sigma) в концентрации 75 мкг/мл в течение 30 минут при 37°C. Далее 9,5 мл вируссодержащей суспензии наносили на 2 мл 36% раствора сахарозы и центрифугировали 90 минут при 30000 об/мин при 40°C (Beckman L8-70M, ротор SW40, США). Полученный осадок ресуспендировали в 0,05 М Трис-HCl, pH 9,0, обрабатывали ультразвуком на льду в течение 5 сек Полученную вируссодержащую жидкость расфасовывали в пробирки 1,5 мл (Eppendorf, Германия) и хранили при -80°C.

В результате данной обработки был получен препарат рекомбинантного вируса осповакцины, обладающий высоким титром вируса (8,7±0,5×10⁹ БОЕ/мл), а также высокой степенью очистки.

Предлагаемый способ позволяет повысить эффективность выделения вируса из клеточного дебриса, уменьшить количество стадий очистки, сократить время на выделение вируса, удешевить способ при сохранении высокой степени очистки вирусного препарата.

Источники информации

1. Нетесов С.В., Кочнева Г.В., Локтев В.Б., Святченко В.А., Сергеев А.Н., Терновой В.А., Тикунова Н.В., Шишкина Л.Н., Чумаков П.М. Онколитические вирусы: достижения и проблемы. // Эпидемиология и санитария. - 2011 - №3. - С.10-17.

2. Parato, K.A., Senger, D., Forsyth, P.A., Bell, J.C. Recent progress in the battle between oncolytic viruses and tumours // Nat. Rev. Cancer. - 2005. - V.5. - P.965-976.

3. Park, B.H., Hwang, Т., Liu, T.C., Sze, D.Y., Kim, J.S., Kwon, H.C., Oh, S.Y., Han, S.Y., Yoon, J.H., Hong, S.H., Moon, A., Speth, K., Park, C., Ahn, Y.J., Daneshmand, M., Rhee, B.G., Pinedo, H.M., Bell, J.C., Kirn, D.H. Use of a targeted oncolytic poxvirus, JX-594, in patients with refractory primary or metastatic liver cancer: a phase I trial // Lancet Oncol. - 2008. - V.9. - P.533-542.

4. Mastrangelo, M.J., Maguire, H.C., Eisenlohr, L.C., Laughlin, C.E., Monken, C.E., McCue, P.A. Intratumoral recombinant GM-CSF-encoding virus as gene therapy in patients with cutaneous melanoma // Cancer Gene Ther. - 1999. - V.6. - P.409-422.

5. Х. Френкель-Конрат. Химия и биология вирусов. // М., 1972, стр.33-37.

6. Я. Туркова, Аффинная хроматография. // М., 1980, стр.5-14.

7. Левченко Н.В. с соавт. "Разработка магноиммуносорбентных тест-систем и установок селективного концентрирования для выявления вируса гриппа птиц". // Материалы 9-го съезда эпидемиологов. M., 2007, т.1, с.248-249.

8. Патент RU 2130069 C1, опубл. 10.05.1999.

9. W.K. Joklik, Virology, 1962, v.18, p.9-18.