ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИЕ ПРОБИОТИЧЕСКИЕ МОЛОЧНО-КИСЛЫЕ БАКТЕРИИ

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к иммуномодулирующим пробиотическим молочно-кислым бактериям, способам применения этих бактерий для снижения аллергии и пищевым продуктам, в которые могут быть добавлены эти бактерии, для снижения аллергии при потреблении продукта.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ, ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ ИЗОБРЕТЕНИЮ

IgE-опосредованная аллергия, также отнесенная к I типу гиперчувствительности, является важной реакцией гиперчувствительности тела. Она индуцируется сильной реакцией против определенных типов соединений окружающей среды (молекулы пищевых продуктов, пыльца, домашняя пыль, пчелиный яд и тому подобное), относящихся к аллергенам. Как правило, I тип гиперчувствительности связан с IgE антителами, включая сенную лихорадку, астму, крапивницу, анафилактический шок и тому подобное.

Воздействие аллергенов в результате может привести к индуцированию, как иммунологической толерантности, так и к активному иммунному ответу. T-лимфоциты играют важную роль в направлении иммунного ответа. В теле человека могут быть обнаружены различные подвиды T-лимфоцитов.

Аллергия является результатом иммунного ответа, опосредованного T-хелпером типа 2-(Th2), и характеризуется продуцированием интерлейкинов IL-4, IL-5 и IL-13. IL-4 представляет собой цитокин, отвечающий за образование IgE-продуцирующих клеток. Долгое время аллергия рассматривалась как несбалансированность между Th2 и Th1 -(T-хелпер 1 типа) ответами. Таким образом, считалось, что стимуляция Th1 ответа в результате должна привести к снижению Th2 ответа. Однако в недавно опубликованных данных предполагается, что Th2 ответы являются физиологически нормальными ответами, которые могут существовать в отсутствие аллергии, наряду с присутствием сильных Th1 ответов. Следовательно, ролью T регуляторных клеток (Treg или Th3) заключается предположительно в ингибировании толерантности для контроля развития аллергии.

T-лимфоциты не нацелены напрямую на аллергены, но фагоцитируют антиген представляющими клетками, такими как дендридные клетки, которые могут быть обнаружены в желудочно-кишечном тракте, дыхательных путях и расположены под кожей. Антиген представляющие клетки обрабатывают аллергены и экспрессируют его фрагменты на своей поверхности. Они распознаются T лимфоцитами совместно с маркерами поверхности клеток, такими как MHC-II и B7-2 молекулами.

Ответ T лимфоцитов зависит, как от активации антиген представляющих клеток, так и от цитокинов, продуцируемых этими клетками. Не активированные дендридные клетки распознаются за счет низкой экспрессии маркеров поверхности MHC-II и B7-2. Эти клетки продуцируют IL-10 и стимулируют регуляторные T клетки (также называемые T- супрессорными клетками или T-хелперными 3 клетками; Th3 клетками), приводя к индуцированию толерантности. Активированные дендридные клетки увеличивают экспрессию MHC-II и B7-2. Эти клетки могут продуцировать высокие уровни IL-12 и IFN-γ, которые стимулируют образование T-хелперных 1 клеток (Th1 клеток), или продуцируют IL-6 и IL-10 для стимуляции T-хелперных 2 клеток (Th2 клеток). Клетки последнего типа могут приводить к индуцированию аллергии.

Желудочно-кишечный тракт имеет самую большую площадь поверхности человеческого тела и имеет большую концентрацию не собственных молекул, таких как молекулы пищевых продуктов и симбиотические бактерии, которые находятся в близком контакте с иммунной системой слизистых оболочек. Следовательно, не является неожиданностью, что кишечная микробиота играет роль в развитии аллергии. Более того, у детей с аллергией были обнаружены отличающиеся профили колонизации по сравнению со здоровыми детьми. Лактобациллы являются важнейшим компонентом симбиотической микрофлоры человека и часто используются как пробиотики. Поэтому проводились исследования способности лактобацилл оказывать профилактическое воздействие на аллергию.

Kalliomaki и другие (Lancet, 2001. 357(9262): p. 1076-9) сообщают, что Lactobacillus GG, если их давать новорожденным, находящимся на искусственном вскармливании, или их матерям в период, близкий к рождению, и в течение нескольких следующих месяцев, значительно снижают риск возникновения у этих детей развития аллергии на коровье молоко. Даже в возрасте четырех лет может все еще наблюдаться протективный эффект (Kalliomaki и другие, Lancet, 2003. 361(9372): стр. 1869-71). Однако эти исследования направлены на профилактику аллергии у новорожденных и относятся к пациентам, уже страдающим от аллергии. На самом деле не наблюдается обещанное профилактическое воздействие Lactobacillus GG на аллергию, вызванную пыльцой березы (Helin и другие, Allergy, 2002. 57(3): стр. 243-6). В EP1364586 описываются штаммы молочно-кислых бактерий, принадлежащих к роду Lactobacillus, и в частности к штаммам Lactobacillus paracasei, которые способны усиливать индуцирование пероральной толерантности у мышей к бета-лактоглобулину коровьего молока. В US2005214270 описываются противоаллергические агенты, включающие в качестве активного ингредиента один или более штаммов молочно-кислых бактерий видов Lactobacillus acidophilus или Lactobacillus fermentum, которые снижают уровень IgE мышиной модели с гиперчувствительностью к овальбумину. Ishida и другие исследовали эффективность орального введения штамма Lactobacillus acidophilus L-92 при хроническом аллергическом рините (J Dairy Sci, 2005. 88(2): стр. 527-33.) и на симптомы аллергии на пыльцу криптомерии японской (Biosci Biotechnol Biochem, 2005. 69(9): стр. 1652-60). Хотя наблюдается значительное улучшение клинических симптомов, таких как нозальные и офтальмологические симптомы, но в сыворотке между двумя группами не наблюдаются значительные отличия в уровнях IgE против домашнего пылевого клеща или в соотношении Th 1/Th 2.

В EP 1634600 описываются противоаллергические композиции, включающие в качестве активного ингредиента штамм Lactobacillus paracasei KW 3110, который индуцирует продуцирование IL 12 и снижает продуцирование IL 4 in vitro лимфоцитов в селезенке мышей, чувствительных к овальбумину.

Было опубликовано несколько докладов о мононуклеарных клетках периферической крови человека (PBMCs), использованных для тестирования иммуномодулирующей способности культур Lactobacillus (Niers и другие, Clin Exp Allergy, 2005. 35(11): стр. 1481-9; Miettinen и другие, Infect Immun, 1998. 66(12): стр. 6058-62; Miettinen и другие, Infect Immun, 1996. 64(12): стр. 5403-5).

Однако все еще сохраняется потребность в дополнительных штаммах пробиотических молочно-кислых бактерий с иммуномодулирующей способностью, которые могут быть использованы для снижения аллергии и которые, например, могут быть добавлены в пищевые продукты для снижения аллергии.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В первом аспекте настоящее изобретение относится к штаммам молочно-кислых бактерий, обладающих иммуномодулирующей способностью. Штаммы молочно-кислых бактерий могут быть использованы в качестве лекарственного средства, предпочтительно они могут быть использованы для лечения аллергии. Используемый здесь термин «молочно-кислые бактерии» относится к бактериям, которые продуцируют молочную кислоту, как продукт ферментации, включая, например, бактерии рода Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcus, Oenococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Carnobacterium, Propionibacterium, Enterococcus и Bifidobacterium. Штаммы молочно-кислых бактерий по настоящему изобретению представляют собой «пробиотики» или «пробиотические штаммы», используемый здесь термин относится к штамму живых бактерий, которые оказывают положительное воздействие на хозяина при их потреблении (например, энтерально или ингаляцией) субъектом. Используемый здесь термин «субъект» относится к человеку или животному, не являющемуся человеком, в частности позвоночному.

Аллергия, которую можно лечить с помощью штаммов молочно-кислых бактерий по настоящему изобретению, предпочтительно представляет собой IgE-опосредованную аллергию, также относится к I типу гиперчувствительности. Лечение может включать профилактику и/или снижение аллергий, вызванных окружающей средой, таких как сенная лихорадка, атопический дерматит, бронхиальная астма, хронический аллергический ринит, крапивница и анафилактический шок. Аллергия, которую можно лечить, может быть вызвана различными аллергенами, включая: взвешенные в воздухе частицы (сенная лихорадка): (пыльца) газонных трав, сорных трав, тимофеевки луговой, пыльцы березы и споры плесени; лекарственные средства: пенициллин, сульфонамиды, салицилаты (также изначально находящиеся в многочисленных фруктах) и анастезирующие средства местного действия; пищевые продукты (пищевая аллергия): орехи, арахис, кунжут, морепродукты, яйца (как правило, альбумин), горох, бобы, соевые бобы и другие бобовые, сельдерей и корневой сельдерей, соя, молоко, пшеница (глютен) и кукуруза или маис; укусы насекомых: аллергия на пчелиный укус и аллергия на укус осы; и продукты животного происхождения (аллергия на животных): шерсть и перхоть животных, оболочку тараканов, и экскременты пылевого клеща. Штаммы молочно-кислых бактерий, которые могут быть использованы, как активный ингредиент для лечения аллергии, обладают иммуномодулирующими способностями. Предпочтительно штаммы молочно-кислых бактерий обладают одной или более из следующих иммуномодулирующих способностей, которые являются преимуществом при лечении аллергии:

a) стимуляция T-хелперных 1 клеток (Th1 клеток) и/или Th1 ответа;

b) стимуляция T-хелперных 3 клеток (Th3 клеток) и/или Th3 ответа. Также Th3 клетки относятся к регуляторным T клеткам или T-супрессорным клеткам и содействуют индуцированию толерантности;

c) отсутствие или снижение индуцирования воспалительного ответа и

d) отсутствие стимуляции и/или подавление T-хелперных 2 клеток (Th2 клеток) и/или Th2 ответа, который может привести к индуцированию аллергии.

Согласно настоящему изобретению молочно-кислые бактерии со способностью стимулировать T-хелперные 1 клетки (Th1 клетки) и/или Th1 ответ предпочтительно представляют собой молочно-кислые бактерии, которые при совместной инкубации in vitro с человеческими PBMCs индуцируют IL- 12 и/или продуцирование IFN- γ. Предпочтительно молочно-кислые бактерии индуцируют продуцирование, по меньшей мере, 50, 60, 70, 80 или 90% IL-12, которое индуцировано в человеческих PBMCs in vitro, по меньшей мере, одним из четырех указанных штаммов, выбранных из L. plantarum BI-1, L. plantarum BI-2, L. fermentum BI-6 и L. plantarum BI-3, из которых L. plantarum BI-1 и L. plantarum BI-2 наиболее предпочтительны. Предпочтительно молочно-кислые бактерии дополнительно включают продуцирование, по меньшей мере, 40, 50, 60, 70, 80 или 90% IFN-γ, которое индуцировано в человеческих PBMCs in vitro, по меньшей мере, одним из четырех указанных штаммов, выбранных из L. plantarum BI-1, L. plantarum BI-2, L. fermentum BI-6 и L. plantarum BI-3, из которых L. plantarum BI-1 и L. plantarum BI-2 более предпочтительны. Предпочтительно молочно-кислые бактерии при инкубации in vitro с человеческими PBMCs дополнительно индуцируют ограниченные количества провоспалительных цитокинов и/или про-Th2 цитокинов ответа, таких как, например, IL-1β. Следовательно, предпочтительные молочно-кислые бактерии при инкубировании in vitro с человеческими PBMCs дополнительно индуцируют не более чем 150, 140, 130, 120 или 110% от количества IL-1β, индуцированных при тех же условиях, по меньшей мере, одним из четырех указанных штаммов (BI-1, BI-2, BI-3 и BI-6). В частности предпочтительные молочно-кислые бактерии со способностью стимулировать T-хелперные 1 клетки и/или Th1 ответ представляют собой бактерии, выбранные из L. plantarum BI-1, L. plantarum BI-2, L. fermentum BI-6 и L. plantarum BI-3. L. plantarum BI-1, L. plantarum BI-2, L. fermentum BI-6 и L. plantarum BI-3 были депонированны 18 декабря 2006 NIZO Food Research, Ede, Нидерланды по Будапештскому соглашению в Центральном Бюро противоплесневых культур (Centraal Bureau voor Schimmelcultures), Баарн, Нидерланды. Штаммы получили следующие депозитные номера L. plantarum BI-1: CBS120663; L. plantarum BI-2: CBS120664; L. fermentum BI-6: CBS120661; и L. plantarum BI-3: CBS120662. BI-3 сначала не корректно отнесли к типу L. fermentum, но позднее ретипировали.

Дополнительно, предпочтительные молочно-кислые бактерии со способностью стимулировать T-хелперные 1 клетки (Th1 клетки) и/или Th1 ответ предпочтительно представляют собой молочно-кислые бактерии, которые при совместном инкубировании in vitro с человеческими PBMCs от индивидуумов с аллергией, более предпочтительно от индивидуумов с аллергией на пыльцу березы, индуцируют IL- 12. Предпочтительно молочно-кислые бактерии индуцируют продуцирование, по меньшей мере, 50, 60, 70, 80 или 90% IL-12, которое индуцировано в человеческих PBMCs in vitro, по меньшей мере, одним из трех указанных штаммов, выбранных из L. plantarum BI-1, L. plantarum BI-2 и L. fermentum BI-6.

Согласно настоящему изобретению молочно-кислые бактерии со способностью стимулировать T-хелперные 3 клетки (Th3 клетки) и/или Th3 ответ предпочтительно представляют собой молочно-кислые бактерии, которые при совместном инкубировании in vitro с человеческими PBMCs индуцируют продуцирование IL-10. Предпочтительно молочно-кислые бактерии индуцируют продуцирование, по меньшей мере, 50, 60, 70, 80 или 90% IL-10, которое индуцировано в человеческих PBMCs in vitro, по меньшей мере, одним из четырех указанных штаммов L. plantarum BI-1, L. plantarum BI-2, L. fermentum BI-6 и L. plantarum BI-3, из которых L. fermentum BI-6 и L. plantarum BI-3 наиболее предпочтительны.

Дополнительно предпочтительно молочно-кислые бактерии со способностью стимулировать T-хелперные 3 клетки (Th3 клетки) и/или Th3 ответ представляют собой молочно-кислые бактерии, которые при совместном инкубировании in vitro с человеческими PBMCs от индивидуумов с аллергией, более предпочтительно от индивидуумов с IgE-опосредованной аллергией, наиболее предпочтительно от индивидуумов с аллергией на пыльцу (наиболее предпочтительно с аллергией на пыльцу березы) индуцируют продуцирование IL-10. Предпочтительно молочно-кислые бактерии индуцируют продуцирование, по меньшей мере, 50, 60, 70, 80 или 90% IL-10, которое индуцировано в человеческих PBMCs in vitro от индивидуумов с аллергией, более предпочтительно от индивиуумов с аллергией на пыльцу березы, по меньшей мере, одним из четырех указанных штаммов L. plantarum BI-1, L. plantarum BI-2, L. fermentum BI-6 и L. plantarum BI-3, из которых L. plantarum BI-3 наиболее предпочтителен.

В соответствии с настоящим изобретением молочно-кислые бактерии со способностью подавлять и/или, по меньшей мере, снижать способность стимулировать T-хелперные 2 клетки (Th2 клетки) и/или Th2 ответ (приводящих к индуцированию аллергии), предпочтительно представляют собой молочно-кислые бактерии, которые при совместном инкубировании in vitro с человеческими PBMCs подавляют или, по меньшей мере, не стимулируют индуцирование IL-13. Предпочтительно молочно-кислые бактерии индуцируют не более чем 150, 140, 130, 120 или 110% количества IL-13, как индуцировано при тех же условиях, по меньшей мере, одним из трех указанных штаммов (BI-1, BI-2 и BI-6). Предпочтительно молочно-кислые бактерии подавляют или, по меньшей мере, не стимулируют индуцирование IL-13 при совместном инкубировании in vitro с человеческими PBMCs, более предпочтительно от индивидуумов с IgE-опосредованной аллергией, наиболее предпочтительно с аллергией на пыльцу (наиболее предпочтительно с аллергией на пыльцу березы).

Уровни цитокинов, индуцированные при совместном инкубировании in vitro выше указанных молочно-кислых бактерий по настоящему изобретению с человеческими PBMCs, могут быть определены рутинными способами, известными из уровня техники, предшествующего изобретению. Предпочтительно индуцирование цитокинов молочно-кислыми бактериями определяется, как описано в Примерах: человеческие PBMCs представляют собой фиколл-пак, очищенную от человеческой лейкоцитарной пленки и ресуспендированную 2 мл среды RPMI 1640, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки, инактивированной нагреванием, 2 мМ глютамина и антибиотики пенициллин и стрептомицин в концентрации 10⁶/мл, PBMCs инкубируют с молочно-кислыми бактериями для тестирования при концентрации 10⁶ КОЕ/мл при 5% CO₂ и 37°C в течение 24 часов. Цитокины, как указано выше, затем определяют в культуре супернатантов с использованием рутинных способов. Более предпочтительно цитокины определяют после 48, 72 или 96 часов. Наиболее предпочтительно цитокины определяют в PBMC культурах, стимулированных LPS или антителами против CD3 и/или CD28. Человеческие PBMCs могут быть получены из крови, сданной здоровыми волонтерами-добровольцами, волонтерами с аллергией, вызванной любым из множества аллергенов, как описано выше, включая, например, пыльцу березы.

Используемый здесь термин IL-12, как правило, относится к коллекции IL-12, относящихся к белкам. Предпочтительная форма IL-12 та, которая определяема описанным здесь анализом на цитокины, представляет собой биоактивную форму IL-12, IL12p70, которая представляет собой 75 кДа гетеродимер, включающий независимо регулируемые дисульфидно-связанные 40 кДа (p40) и 35 кДа (p35) субъединицы.

Штаммы молочно-кислых бактерий по настоящему изобретению предпочтительно принадлежат к роду Lactobacillus. Бактерии должны быть пищевыми, то есть они должны быть безвредными при потреблении человеком или животным. Следует понимать, что не пищевые бактерии, например патогенные бактерии, модифицированные таким образом, что перестают быть вредными при потреблении субъектом, входят в объем притязаний настоящего изобретения. Штаммы Lactobacillus могут быть следующих видов: L. rhamnosus, L. casei, L. paracasei, L. helveticus, L. delbrueckii, L. reuteri, L. brevis, L. crispatus, L. sakei, L. jensenii, L. sanfransiscensis, L. fructivorans, L. kefiri, L. curvatus, L. paraplantarum, L. kefirgranum, L. parakefir, L. fermentum, L. plantarum, L. acidophilus, L. johnsonii, L. gasseri, L. xylosus, L. salivarius и тому подобное. Предпочтительные штаммы молочно-кислых бактерий выбирают из видов L. acidophilus, L. plantarum, L. fermentum, L. rhamnosus, L. paracasei, L. acetotolerans, L. reuteri, L. casei, и L. paracasei subsp., более предпочтительно они представляют собой L. plantarum и L. fermentum, наиболее предпочтительно представляют собой депонированные указные выше штаммы. Штамм молочно-кислых бактерий по настоящему изобретению дополнительно предпочтительно устойчив к пищеварительному соку, такому как желудочный сок, желчная кислота, что позволяет бактериям достигать желудочно-кишечного тракта живыми (в случае, когда они не инкапсулированы/защищены). Кроме того, предпочтительный штамм молочно-кислых бактерий обладает высокой адгезивностью к желудочно-кишечному тракту, что позволяет им оставаться в желудочно-кишечном тракте более длительный период времени, и они могут колонизировать желудочно-кишечный тракт.

Следует понимать, что реплики и/или производные депонированных штаммов или любого другого штамма по настоящему изобретению входят в объем притязаний настоящего изобретения. Используемый здесь термин «реплика» относится к биологическому материалу, который представляет собой по существу не модифицированную копию материала, такого как материал, полученный выращиванием микроорганизмов, например бактерий в культуральной среде. Используемый здесь термин «производный» относится к материалам, созданным из биологических материалов, и которые по существу модифицированы и имеют новые свойства, например, вызванные наследственными изменениями в генетическом материале. Эти изменения могут быть как спонтанными, так и являться результатом применения химических и/или физических агентов (например, мутагенов) и/или технологии рекомбинантной ДНК, известной из предшествующего уровня техники. При указании на штамм «производный» другого штамма следует понимать, что оба: «реплики» этого штамма наряду с «производными» штамма, входят в объем понятия при условии, что производный штамм все еще обладает иммуномодулирующими способностями штамма и, следовательно, может быть использован для лечения аллергии.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению штамма молочно-кислых бактерий для получения (производства) композиции для лечения аллергии, как указанно выше. Композиция, полученная при использовании одного или более штаммов по настоящему изобретению, может представлять собой композицию любого типа, которая подходит для потребления или введения субъекту, предпочтительно человеку, страдающему от аллергии, как описано выше. Композиция может представлять собой пищевой продукт, композицию пищевой добавки, нутрицевтическую или фармацевтическую композицию. В зависимости от типа композиции и предпочтительного способа введения, компоненты и текстура композиции могут варьировать. Пищевой продукт или пищевая/нутритивная композиция включают помимо штамма(ов) бактерий по настоящему изобретению также подходящую пищевую основу. Используемый здесь термин пищевой продукт или пищевая композиция включает сухие вещества (например, порошки), полусухие вещества и/или жидкости (например, питье или напиток) для потребления человеком или животным. Пищевой продукт или пищевая/нутритивная композиция может представлять собой молочный продукт, такой как ферментированные молочные продукты, йогурт, молоко или напитки на основе молока, пахту, напитки на основе йогурта, сыр или сливочное масло, мороженое, дессерты (например, десерты, полученые из молока, такие как сладкие соусы, датский эквивалент: «vla»), творог (датский эквивалент: «кварк»), свежий сыр (например, деревенский сыр), и тому подобное. Такие пищевые продукты или пищевые композиции могут быть получены способом, известным как per se, например, добавлением штамма(ов) по настоящему изобретению, подходящего для пищевого продукта или пищевой основы, в подходящем количестве (смотрите, например, WO 01/82711). В дополнительном варианте воплощения настоящего изобретения штамм(ы) используют в или для получения пищевого продукта или пищевой/нутритивной композиции, например, ферментацией. Примеры таких штаммов включают пробитические продуцирующие молочную кислоту бактерии по настоящему изобретению. При этом штамм(ы) по настоящему изобретению может быть получен способом, известным, как per se, для получения таких ферментированных пищевых продуктов или пищевых/нутритивных композиций, например, способом, известным, как per se для получения ферментированных молочных продуктов с использованием бактерий, продуцирующих молочную кислоту. При таких способах штамм(ы) по настоящему изобретению может быть использован при добавлении микроорганизмов, используемых, как правило, и/или может заменять одну или более части микроорганизмов, используемых, как правило. Например, при получении ферментированных молочных продуктов, таких как йогурт или напитки на основе йогурта, живые бактерии, продуцирующие молочную кислоту по настоящему изобретению, могут быть добавлены в или использованы как часть заквасочной культуры, или могут быть подходяще добавлены во время или после такой ферментации. Также могут присутствовать ароматизаторы, антиоксиданты, витамины, минеральные вещества, красители и тому подобное. Хотя предпочтительно использовать живые клетки, в некоторых композициях также могут быть использованы мертвые или не жизнеспособные клетки.

Предпочтительный штамм молочно-кислых бактерий по настоящему изобретению представляет собой штамм, стабильный в молочном продукте, в частности в ферментированном молочном продукте. Под стабильностью штамма здесь понимается выживаемость жизнеспособных бактерий после длительного хранения в (ферментированном) молочном продукте. Предпочтительно штамм молочно-кислых бактерий по настоящему изобретению стабилен в (ферментированном) молочном продукте в условиях холодильного хранения (4-6°C) в течение, по меньшей мере, 1, 2, 3, или 4 недель, при этом следует понимать, что log выживания штамма бактерий (то есть КОЕ после хранения / КОЕ в начале) составляет, по меньшей мере, -2, -1,3, -1,2, -0,5, -0,2 или -0,1. Пример условий для определения стабильности или показателя выживаемости описан в Примере 3.

Наряду с эффективным количеством одного или более штаммов молочно-кислых бактерий по настоящему изобретению, пищевая добавка может включать один или более носители, стабилизатор, пребиотик и тому подобное. Предпочтительно композиция находится в порошкообразной форме для энтерального (предпочтительно орального) введения, хотя также может подходить назальное введение или ингаляция. При использовании живых клеток штамма(ов) клетки могут находиться в инкапсулированной форме для защиты от желудочного сока, что означает, что в этом случае нет необходимости в устойчивости клеток к желудочному соку. Композиция, например, может быть в форме порошка, расфасованного в саше, который может быть растворен или диспергирован в воде, фруктовом соке, молоке или другом напитке. Доза клеток на штамм предпочтительно составляет, по меньшей мере, 1×10⁶ КОЕ на штамм, предпочтительно в пределах от 1×10⁶ до 1×10¹² КОЕ (колоний образующих единиц) в день, более предпочтительно от 1×10⁷ до 1х10¹¹ КОЕ/день, более предпочтительно от около 1×10⁸ до 5×10¹⁰ КОЕ/день, наиболее предпочтительно от около 1×10⁹ до 2×10¹⁰ КОЕ/день. Эффективная доза может быть обеспечена как единичной дозой, так и может быть разделена на несколько более мелких доз и введена, например, за два, три или более приема в день.

Наряду с одним или более штаммами молочно-кислых бактерий по настоящему изобретению, питательная композиция предпочтительно включает углеводы, и/или белки, и/или липиды, подходящие для потребления человеком и/или животным. Композиция содержать или не содержать биоактивные ингредиенты, такие как другие (пробиотические) штаммы и пребиотики, которые поддерживают пробиотические штаммы. При использовании живых клеток штамма(ов) клетки могут находиться в инкапсулированной форме для защиты от желудочного сока, что означает, что в этом случае нет необходимости в устойчивости клеток к желудочному соку. Доза клеток на штамм предпочтительно составляет, по меньшей мере, 1×10⁶ КОЕ на штамм, предпочтительно в пределах от 1×10⁶ до 1×10¹² КОЕ (колоний образующих единиц) в день, более предпочтительно от 1×10⁷ до 1×10¹¹ КОЕ/день, более предпочтительно от около 1×10⁸ до 5×10¹⁰ КОЕ/день, наиболее предпочтительно от около 1×10⁹ до 2×10¹⁰ КОЕ/день. Питательная композиция может заменять потребление нормального пищевого продукта/напитка субъектом или может потребляться дополнительно к нему.

Следует понимать, что при использовании мертвых или не жизнеспособных клеток используют дозы, эквивалентные выше указанному КОЕ. Эти эквивалентные дозы, например, могут быть определены с использованием оптической плотности (например, OD₆₀₀) или количественным определением белка или ДНК.

Один или более штаммов молочно-кислых бактерий по настоящему изобретению в подходящей дозе также могут быть использованы для получения нутрицевтической или фармацевтической композиции для лечения, терапии или профилактики аллергии. Нутрицевтические/ фармацевтические композиции, как правило, могут использоваться для энтерального, например орального, применения.

Нутрицевтические/фармацевтические композиции, как правило, включают носитель дополнительно к штамму(ам) по настоящему изобретению. Предпочтительная форма зависит от предполагаемого способа введения и (терапевтического) применения. Фармацевтический носитель может представлять собой любой совместимый, не токсичный, подходящий для доставки штамма(ов) в желаемую полость тела, например кишечник субъекта. Например, в качестве носителя может быть использована стерильная вода или инертные сухие вещества, как правило, совместимые с фармацевтически приемлемыми адъювантами, буферами, диспергирующими агентами и тому подобным.

Нутрицевтические/фармацевтические композиции дополнительно могут включать дополнительные биологически или фармацевтически активные ингредиенты.

Следует понимать, что в способе, применениях и композициях по настоящему изобретению в одной композиции могут быть скомбинированы или совместно введены, по меньше мере, два или более штамма(ов). Штаммы могут присутствовать в различных композициях и могут быть скомбинированы только in vivo после введения различных композиций субъекту. В качестве альтернативы штаммы могут присутствовать в одной композиции. В обоих случаях введение двух или более штаммов указано, как «совместное введение».

В предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения, по меньшей мере, один штамм обладает способность стимулировать T-хелперные 3 клетки (Th3 клетки) и/или Th3 ответ, как определено здесь при комбинировании, по меньшей мере, с одним штаммом, обладающим способностью не индуцировать или только снижать воспалительный ответ, как определено здесь, в способах, применениях и композиции по настоящему изобретению. В качестве альтернативы, по меньшей мере, один штамм, обладающий способностью стимулировать T-хелперные 3 клетки (Th3 клетки) и/или Th3 ответ, как определено здесь, может быть скомбинирован, по меньшей мере, с одним штаммом, обладающим способностью стимулировать T-хелперные 1 клетки (Th1 клетки) и/или Th1 ответ, как определено здесь, или по меньшей мере, с одним штаммом, обладающим способностью не индуцировать или только снижать воспалительный ответ, как определено здесь, может быть скомбинирован, по меньшей мере, с одним штаммом, обладающим способностью стимулировать T-хелперные 1 клетки (Th1 клетки) и/или Th1 ответ, как определено здесь, в способах, применениях и композициях по настоящему изобретению. В другом предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения, по меньшей мере, один штамм, обладающий способностью подавлять и/или не стимулировать T-хелперные 2 клетки (Th2 клетки) и/или Th2 ответ, как определено здесь, комбинируют, по меньшей мере, с одним штаммом, обладающим способностью стимулировать T-хелперные 3 клетки (Th3клетки) и/или Th3 ответ, как определено здесь, и/или комбинируют, по меньшей мере, с одним штаммом, обладающим способностью не индуцировать или только снижать воспалительный ответ, как определено здесь, и/или, по меньшей мере, с одним штаммом, обладающим способностью стимулировать T-хелперные 1 клетки (Th1 клетки) и/или Th1 ответ, как определено здесь, в способах, применениях и композициях по настоящему изобретению. Такие комбинации штаммов в некоторых примерах превосходят введение только штамма(ов), обладающего одной из указанных иммуномодулирующих способностей.

В другом дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к способу получения композиции для лечения аллергии, включающему стадии: a) выращивания, по меньшей мере, одного штамма молочно-кислых бактерий, как определено здесь, в подходящей жидкой или твердой среде; b) необязательно выделение штамма из среды, например, центрифугированием и/или фильтрацией и проведение последующей обработки, известной из уровня техники, предшествующей изобретению, например лиофилизацией, распылительной сушкой и/или замораживанием; и c) составление рецептуры штамма в форме, подходящей для введения субъекту. Штаммы по настоящему изобретению могут быть выращены на искусственной среде или на натуральной среде, такой как молоко (с низким содержанием жира), йогурт и тому подобное. Затем они могут быть непосредственно использованы для получения композиции по настоящему изобретению, или бактерии могут быть подвергнуты концентрированию или выделению центрифугированием и/или фильтрацией из среды и затем составлены подходящие композиции.

В настоящем документе и формуле изобретения глагол «включать» и его формы следует интерпретировать в открытом, а не закрытом значении, если ясно не указано иное. Использованные здесь и в приложенной формуле изобретения формы единственного числа включают и множественное число, если в контексте ясно не просматривается иное. Кроме того, единственное число подразумевает, по меньшей мере, один.

ПРИМЕРЫ.

Пример 1: Влияние лактобацилл на продуцирование цитокинов человеческими PBMC.

1.1 Материалы и способы.

1.1.1 in vitro оценку проводят на первый день (a) и четвертый день (b) с использованием процедур, приведенных ниже.

1.1.1.a День l - предварительный отбор.

Отбор in vitro проводят на 70 штаммах Lactobacillus. Штаммы выбирают, исходя из хорошей выживаемости, в воспроизведенных условиях желудочно-кишечного тракта, выделяют из желудочно-кишечного тракта или из штаммов видов, которые образуют доминирующую популяцию Lactobacillus в кишечнике.

Человеческую лейкоцитарную пленку (содержащую концентрированную фракцию лейкоцитов) получают из банка крови. Мононуклеарные клетки периферической крови человека выделяют центрифугированием из фиколл-пак. После промывки клетки ресуспендируют в среде RPMI 1640, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки, инактивированной нагреванием, 2 мМ глютамина и антибиотики пенициллин и стрептомицин. Очищенные лейкоциты инкубируют в объеме 2 мл при концентрации 10⁶/мл. Конечная концентрация бактерий, использованных для тестирования, составляет 10⁶ КОЕ/мл. Клетки с бактериями инкубируют на 24- луночных пластинах при 5% CO₂ и 37°C в течение 24 часов. Цитокины определяют в культуре супернатантов с использованием коммерчески доступных наборов ELISA.

1.1.1.b День 4 - in vitro определение.

Отбор in vitro проводят по Akdis CA. И другие (2003). Eur. J. Immunol.33, стр. 2717-2726. Клетки крови или не стимулируют или стимулируют LPS или добавлением антител против-CD3 и против-CD28. Соотношение бактерий и клеток крови аналогично таковому при отборе на первый день. Цитокины определяют с использованием проточного цитометрического анализа, используя меченые антитела против цитокинов.

1.1.2 Измерение цитокинов.

Цитокины измеряют на 1 день для прогнозирования индуцирования Th1, Th2 или Treg. На 1 день или на 4 день определения измеряют следующие цитокины:

- IL-1β как маркер провоспалительного ответа.

- IFN-γ как маркер Th1 ответа (не на 1 день)

- TNF-α как второй маркер провоспалительного ответа.

- IL-12 (предпочтительно, IL12p70) как маркер Th1 ответа.

- IL-6 как маркер Th2 ответа (не на день 4).

- IL-10 как маркер T-регуляторных клеток (в комбинации с низким IL-6)

1.2. Результаты

1.2.1 Первый день in vitro определение.

Штаммы индуцируют стимуляцию продуцирования цитокинов PBMC, но, как и ожидалось, уровни цитокинов значительно варьируют. Обнаруживают большие количества TNF- α, следующие за IL-6. Все эти цитокины присутствуют в пределах около 10-40 нг/мл. IL-1β может быть обнаружен в концентрации около 4 нг/мл. IL-10 присутствует в пределах 0-1600 пг/мл, и IL-12p70 далек от самого низкого и составляет в пределах 0-200 пг/мл.

Интересным наблюдением является то, что иммуномодулирующий эффект во многом зависит от видов. Например, большинство штаммов L. Plantarum очень эффективны для стимуляции IL-12 и TNF- α, при этом эти цитокины плохо стимулируются штаммами L. Acidophilus.

Для определения основных характеристик иммунной стимуляции лактобацилл исследуют корреляцию между цитокинами. В таком случае было обнаружено, что стимуляции IL-6 и IL-10 по существу коррелируют. Повышенное продуцирование IL-10 получают после порогового уровня IL-6 (данные не показаны). Аналогично, продуцирование IL-12 быстро увеличивается после превышения порогового уровня TNF-α (данные не показаны). При более высоких концентрациях TNF-α уровень IL-1β показал неожиданно высокий максимальный показатель в пределах от 4 до 4,5 нг/мл (данные не показаны).

Штаммы, далекие от среднего, обладают интересующим иммунологическим потенциалом. Штаммы могут быть разделены на три класса:

1) штаммы с высоким индуцированием IL-12, но с низкой стимуляцией IL-6 и IL-10. Эти клетки могут специфично усиливать Th1 ответ (данные не показаны).

2) штаммы с высокой стимуляцией продуцирования IL-6 и IL-10 и подходящие штаммы для усиления Th2 ответа (данные не показаны), и

3) штаммы, которые или сильно индуцируют IL-10 и/или которые индуцируют слабо IL-12, IL-6 и/или провоспалительные цитокины IL-1β и/или TNFα, являются подходящими штаммами для индуцирования толерантности, то есть Th3 или T регуляторного ответа (данные не показаны).

Однако это очень предварительное разделение, которое требует дополнительного подтверждения на 4 день эксперимента по совместному культивированию, приведено ниже.

1.2.2 Четвертый день in vitro определение.

Этот отбор проводят из 12 штаммов, выбранных, как описано выше. Целью является выявление штаммов, которые наиболее сильно стимулируют как Th1 путь, так и Treg (Th3) путь. Эксперимент по культивированию PBMC длится 4 дня (по сравнению с 1 дневным экспериментом, описанным выше), то позволяет получить более выраженные изменения PBMCs для разграничения результатов стимуляции. В течение 4-дневного культивирования обнаружены цитокины, продуцированные T-клетками, которые созревают в процессе культивирования (Таблица 1). Следовательно, прогностичность результатов этого исследования более надежна по сравнению с 1-дневным исследованием, проведенным выше.

Другое дополнение этого исследования состоит в том, что PBMCs стимулировали LPS (Таблица 2) или смесью антител, распознающих CD3 и CD28 маркеры поверхности лейкоцитов (Таблица 3). В этом случае изучают влияние пробиотических лактобацилл на LPS или CD3/CD28 стимуляцию.

Выявили четыре штамма (номера 17, 26, 31 и 34) с наибольшей комбинацией индуцирования IL-12, IFN-γ (оба Th1 маркеры) и IL-10 (T-reg маркер). В частности, штаммы 17 и 26 являются самыми сильными индукторами цитокина Th1 и также достаточно сильно индуцируют IL-10, при этом 31 и 34 являются самыми сильными индукторами IL-10, которые также достаточно сильно индуцируют уровни цитокина Th1. Это подтверждается другим Th1 маркером (CD8) и T-reg маркером (CD25). Другие маркеры, измеряемые в этом исследовании, относятся к стимуляции и пролиферации клеток и менее интересны с точки зрения выбора штаммов.

Эти четыре штамма, соответствующие штаммам L. Plantarum BI-1 (штамм 17), L. Plantarum BI-2 (штамм 26), L. Fermentum BI-6 (штамм 31) и L. Plantarum BI-3 (штамм 34) соответственно, были депонированы 18 декабря 2006 NIZO Food Research, Ede, Нидерланды по Будапештскому соглашению в Центральном Бюро противоплесневых культур (Centraal Bureau voor Schimmelcultures), Баарн, Нидерланды. Штаммы получили следующие депозитные номера L. plantarum BI-1: CBS120663; L. plantarum BI-2: CBS120664; L. fermentum BI-6: CBS120661; и L. plantarum BI-3: CBS120662. BI-3 сначала не корректно отнесли к типу L. Fermentum, но позднее ретипировали.

Пример 2: Влияние лактобацилл на продуцирование цитокина PBMC людей с аллергией на пыльцу березы.

2.1 План эксперимента.

Мононуклеарные клетки периферической крови человека (PBMCs) собирают из крови, сданной здоровым волонтером (P1), волонтерами с аллергией на пыльцу березы (P4, P6, P3, P5, P7 и P9) и волонтерами с неустановленной аллергией (P2 и P8).

Клетки стимулируют различными способами:

- Не стимулируют, добавляя простую ростовую среду

- Не спицефически стимулируют все T-клетки αCD3/αCD28. Первичный анализ на 4 день.

- Специфическая стимуляция на пыльцу березы основным антигеном Betv 1, с последующей стимуляцией αCD3/αCD28 на 7 день (которые воздействуют только на клетки, которые уже были стимулированы). Первичный анализ на 8 день. Более мелкие фракции клеток активируются и выращиваются. Следовательно, клеткам дается больше времени для ответа. Цитокины определяют с использованием проточного цитометрическго анализа, используя меченые антитела против цитокинов.

Включенные штаммы молочно-кислых бактерий приведены в Таблице 4.

2.2 Результаты.

IL-13 представляет собой основной цитокин, индуцирующий аллергический ответ. Данные, приведенные в Таблице 5 ниже, показывают, что IL-13 обнаруживают, когда клетки специфически стимулируют Betv 1 (Таблица 5: сырая среда (Med)). Самые высокие уровни обнаруживают, как ожидалось, у волонтеров с аллергией на пыльцу березы. Кроме того, молочно-кислые бактерии приводят к почти полному ингибированию IL-13 у большинства волонтеров (за исключением волонтера P7). Эффект ограничивается или даже отсутствует, когда используют штаммы 8 или 34, что показывает специфичность влияния штаммов. Пробиотический эффект также поддерживается, когда смесь включает штамм 26 и 31. Дополнительно данные позволяют пролить свет на рабочий механизм ингибирования образования IL-13.

IL-13 является ключевым цитокином, продуцированным клетками, принадлежащими к T-хелперному 2 пути строительства иммунного ответа. Стратегия снижения этого пути представляет собой стимуляцию T-хелперного 1 пути, где IL-12 играет основную роль. На самом деле, добавление пробиотиков 17, 26 и 31 по сравнению с контрольной средой приводит в результате к стимуляции продуцирования IL-12 в CD3/CD28 стимулированных PBMCs у 5 из 6 пациентов с аллергией на березовую пыльцу (смотрите Таблицу 6). Другой стратегией снижения продуцирования IL-13 Th2 клетками считается продуцирование IL-10, который представляет собой цитокин, продуцированный регуляторными T-клетками. Как показано в Таблице 7, авторы настоящего изобретения обнаружили, что в CD3/CD28 активированных клетках IL-10 стимулирован несколькими бактериальными штаммами (17, 26, 31 и 34) по сравнению с контрольной средой.

В заключение авторы настоящего изобретения обнаружили специфическое снижение IL-13 при аллергии на пыльцу березы при использовании специфических молочно-кислых бактерий. Это снижение аналогично вызванному не специфичным влиянием пробиотиков на продуцирование PBMCs IL-10 и IL-12.

Пример 3: Рост и стабильность выбранных штаммов в молочных продуктах.

3.1 Рост и стабильность в MRS и молоке.

1 мл 10% исходной культуры клеток в среде Mann Rogosa Sharp (MRS, Merck Company) (-40°C) смешивают с 9 мл MRS. Рост проходит в течение 20 часов при температуре 37°C. Далее 1% этой культуры инокулируют в среду: 1. MRS 2. молоко. Молоко получают, как 10% масса/масса раствор сухого обезжиренного молока (Promex). Молоко стерилизуют в течение 10 минут при температуре 115°С. Через 24 ч и 48 ч культуры высевают на MRS. Подсчет проводят через 3 дня роста при температуре 37°C. Результаты приведены в Таблице 8.

Через 24 ч в MRS было получено большое количество клеток и более низкое количество было получено в молоке. Однако через 48 ч в MRS количество снижалось, а в молоке стабилизировалось.

3.2 Стабильность в йогурт-подобном продукте.

Выживаемость выбранных штаммов Lactobacillus в среде йогурт-подобного продукта оценивают в условиях холодильного хранения. Прекультуры Lactobacillus выращивают в течение ночи в MRS. Протеаза-позитивные культуры Streptococcus thermophilus, используемые для получения йогурт-подобных продуктов, предварительно культивировали в течение ночи в молоке, обработанном в течение 10 минут при температуре 115°C. Прекультуры S. thermophilus инокулируют при 0,1% плотности вместе с 1% инокулята прекультур Lactobacillus в пастризованное (5 минут при температуре 85°C) обезжиренное молоко (полученное из сухого молока), которое охлаждают до температуры 37°C. Инокулированные культуры делят на порции по 100 мл. Культуры обезжиренного молока выращивают при температуре 37°C в течение 15 часов, после роста перемешивают стерильной пипеткой, охлаждают до температуры 4°C и хранят в холодильнике (4-6°C). Плотность культур Lactobacillus определяют с использованием подсчета колоний образующих единиц на мл на MRS чашках с агаровой средой, непосредственно после роста и охлаждения и через 28 дней хранения в холодильнике. Результаты, приведенные в Таблице 9, показывают явные различия между различными штаммами Lactobacillus. Хотя полученная для каждого штамма плотность культур Lactobacillus отличается на одну log-единицу после 15 часов роста, последующее выживание при хранении йогурт-подобных продуктов значительно различается для различных штаммов.

Интересно сравнение двух штаммов L.acidophilis 5 и 70. В первый день анализа PBMC по Примеру 1 иммунномодулирующие профили (низкий IL-12, высокий IL-10, сравнительно низкий IL-6, указывают на высокую способность Treg) 5 и 70 штаммов почти аналогичны, однако Таблица 9 показывает, что их стабильность в йогурте и, следовательно, применимость в ферметированном продукте значительно отличается: штамм 70 гораздо более стабилен по сравнению со штаммом 5. Это говорит о том, что первый не может быть выбран только по иммуномодулирующей способности, но также следует принимать во внимание технологическую применимость (стабильность в ферментированном продукте).