СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ФОРМ ПЕРВИЧНОЙ ПЛАЦЕНТАРНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ

Изобретение относится к медицине, а именно к патологической анатомии, и позволяет проводить морфологическую дифференциальную диагностику трофобластической, эндометриальной и смешанной формы первичной плацентарной недостаточности при самопроизвольном прерывании беременности в первом триместре.

Актуальность

Актуальность предлагаемого способа определяется тем, что первичная плацентарная недостаточность является основной причиной самопроизвольного прерывания беременности в первом триместре, удельная доля которого составляет, по оценке разных авторов, 75-80% от числа всех репродуктивных потерь. Применение заявляемого способа позволяет не только проводить морфологическую диагностику первичной плацентарной недостаточности, но и в каждом случае установить ее патогенетическую форму с целью разработки индивидуального подхода к дальнейшей диагностике и коррекции нарушений репродуктивной функции женщины.

Известен способ диагностики хронической плацентарной недостаточности, согласно которому при уровне фактора роста плаценты в крови 126-315 пкг/мл; уровне термостабильной щелочной фосфатазы 67-233 Ед/л; содержании лимфоцитов СД95+ 31-74%; концентрации ФНОα 220-1710 пкг/мл диагностируют хроническую плацентарную недостаточность (Патент №2313795. Российская Федерация. Способ диагностики хронической плацентарной недостаточности. / Липатов И.С., Мельников В.А., Тезиков Ю.В., и др. // Изобретения. Полезные модели. - 2007. - №36). Однако способ разработан для хронической плацентарной недостаточности, развивающейся в третьем триместре беременности. Является неморфологическим методом, о наличии плацентарной недостаточности судят косвенно, по факторам, определяемым в периферической крови. Не учитывается патогенетическая неоднородность синдрома.

Известно несколько способов диагностики плацентарной недостаточности с помощью ультразвукового исследования. Способ ранней диагностики плацентарной недостаточности, основанный на проведении допплерометрии спиральных артерий у беременных женщин в 20-24 недели гестации. При отношении индексов резистентности в спиральных артериях периферической к центральной части плаценты менее 1,0 диагностируют плацентарную недостаточность (Патент №2257850. Российская Федерация. Способ ранней диагностики плацентарной недостаточности. / Посисеева Л.В., Зимина С.И., Перетятко Л.П., и др. // Изобретения. Полезные модели. - 2005. - №22). Способ диагностики фетоплацентарной недостаточности путем оценки системного и плацентарного кровотока при ультразвуковом допплерометрическом исследовании. Высчитывают плодово-материнский гематологический индекс, на основании которого судят о наличии фетоплацентарной недостаточности (Патент №2402271. Российская Федерация. Способ диагностики фетоплацентарной недостаточности. / Тривоженко О.В., Евтушенко И.Д. // Изобретения. Полезные модели. - 2010. - №30). Недостатками ультразвуковых методов являются: использование дорогостоящего оборудования, хронологические рамки, не позволяющие проводить диагностику первичной плацентарной недостаточности в первом триместре.

Наиболее близким по техническому решению является используемый в патологоанатомической практике способ дифференциальной диагностики первичной плацентарной недостаточности в первом триместре при самопроизвольных абортах (Морфологическая характеристика хориона при спонтанных абортах хромосомной этиологии / Пальцев М.А., Горбачева Ю.В., Волощук И.Н. и др. // Архив патологии. - 2004. - №6. - С.11-15). Способ осуществляется путем иммуногистохимического исследования ворсинчатого хориона с определением уровня экспрессии протеина Ki-67 (маркера пролиферации) и протеина р53 (маркера апоптоза). При индексе пролиферации вневорсинчатого цитотрофобласта менее 4,2 и индексе апоптоза ворсинчатого цитотрофобласта выше 26,2 диагностируют самопроизвольный аборт с патологическим кариотипом, при других значениях индексов пролиферации и апоптоза - самопроизвольный аборт с нормальным кариотипом. Способ имеет ряд недостатков: оцениваются неспецифические факторы (пролиферация и апоптоз), не учитывает состояние гравидарного эндометрия, не проводится дифференциальная диагностика других форм первичной плацентарной недостаточности.

Указанные недостатки перечисленных способов предлагается устранить в заявляемом способе.

Заявляемым техническим результатом является разработка способа морфологической дифференциальной диагностики трофобластической, эндометриальной и смешанной форм первичной плацентарной недостаточности при самопроизвольном прерывании беременности в первом триместре. Технический результат достигается тем, что при иммуногистохимическом исследовании ворсинчатого хориона и децидуальных клеток гравидарного эндометрия оценивают индекс экспрессии сосудисто-эндотелиального (СЭФР) и трансформирующего (ТФР-β2) факторов роста. При индексе экспрессии в ворсинчатом хорионе СЭФР, равном или менее 1,5 у.е., а ТФР-β2, равном или менее 1,4 у.е., диагностируют трофобластическую форму первичной плацентарной недостаточности; при индексе экспрессии в децидуальных клетках СЭФР, равном или менее 1,6 у.е., а ТФР-β2, равном или более 2,7 у.е., диагностируют эндометриальную форму первичной плацентарной недостаточности; при одновременном выявлении вышеуказанных критериев диагностируют смешанную форму первичной плацентарной недостаточности.

Отличительные признаки способа

Установлены дифференциально-диагностические параметры экспрессии СЭФР и ТФР-β2 в ворсинчатом хорионе и децидуальных клетках гравидарного эндометрия. При индексе экспрессии в ворсинчатом хорионе СЭФР, равном или менее 1,5 у.е., а ТФР-β2, равном или менее 1,4 у.е., диагностируют трофобластическую форму первичной плацентарной недостаточности; при индексе экспрессии в децидуальных клетках СЭФР, равном или менее 1,6 у.е., а ТФР-β2, равном или более 2,7 у.е., диагностируют эндометриальную форму первичной плацентарной недостаточности; при одновременном выявлении вышеуказанных критериев диагностируют смешанную форму первичной плацентарной недостаточности.

Новизна способа

Впервые предложен способ морфологической дифференциальной диагностики трофобластической, эндометриальной и смешанной форм первичной плацентарной недостаточности, основанный на оценке результатов иммуногистохимической реакции с антителами к СЭФР и ТФР-β2. Дифференциальная диагностика первичной плацентарной недостаточности при самопроизвольном прерывании беременности в первом триместре будет способствовать разработке индивидуального подхода к дальнейшему лечению и реабилитации репродуктивного здоровья женщины в зависимости от патогенетической формы плацентарной недостаточности.

Факторы роста играют одну из ведущих ролей в регуляции процессов имплантации, плацентации и раннего эмбриогенеза в первом триместре беременности. Сосудисто-эндотелиальный фактор роста (СЭФР) обнаруживают в высоких концентрациях как в периферической крови беременных женщин, так и в тканях развивающейся плаценты и эндометрии (Иммунологическая загадка беременности / Под ред. Сотниковой Н.Ю. - Иваново: Изд-во МИК, 2005. - 276 с.). Его продукция осуществляется клетками плаценты (синцитио- и цитотрофобласт, стромальные клетки ворсин), а также децидуальными клетками и эндотелиоцитами (Localization of angiogenic growth factors and their receptors in the human placental bed throughout normal human pregnancy / Schiessl В., Innes B.A., Bulmer J.N., et al. // Placenta. - 2009. - Vol.30, №1. - P.79-87). Под контролем СЭФР находится не только васкуляризация ворсинчатого хориона. Показано, что вышеуказанный фактор стимулирует рост плацентарной ткани, контролирует процессы дифференцировки и пролиферации цитотрофобласта, активизирует цитотрофобластическую инвазию в гравидарный эндометрий (The effects of angiogenic growth factors on extravillous trophoblast invasion and motility / Lash G.E., Cartwright J.E., Whitley G. StJ., et al. // Placenta. - 1999. - Vol.20, №8. - P.661-667). Последний процесс является ключевым для ранних и последующих сроков беременности, поскольку инвазия клеток цитотрофобласта приводит к гестационному ремоделированию спиральных артерий матки (эндометриальных и миометриальных сегментов), преобразуя их в маточно-плацентарные артерии, т.е. обеспечивает установление адекватного маточно-плацентарного кровотока (Милованов А.П., Кириченко А.К. Цитотрофобластическая инвазия - ключевой механизм развития нормальной и осложненной беременности. - Красноярск: Литера-принт, 2009. - 188 с.). Данные о характере продукции СЭФР при плацентарной недостаточности и невынашивании беременности противоречивы: существуют исследования, демонстрирующие как снижение уровня экспрессии СЭФР (Expression of angiogenesis - and apoptosis-related genes in chorionic villi derived from recurrent pregnancy loss patients / Choi H.K., Choi B.C., Lee S.H., et al. // Molecular Reproduction and Development. - 2003. - Vol.66, №1. - P.24-31), так и, напротив, повышение (Крукиер И.И. Погорелова Т.Н. Продукция сосудисто-эндотелиального фактора роста и эндотелина в плаценте и пуповине при нормальной и осложненной беременности. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2006. - Т.141, №2. - С.177-179). Различия, по нашему мнению, обусловлены рядом причин: применяемая методика, срок беременности, исследуемый материал (периферическая кровь, плацентарная ткань, эндометрий).

Трансформирующий фактор роста (ТФР-β2) в настоящее время рассматривается в качестве основного иммуносупрессивного цитокина, обеспечивающего иммунную толерантность материнского организма к чужеродным антигенам плода (Nagaeva О., Jonsson L., Mincheva-Nilsson L. Dominant IL-10 and TGF-beta mRNA expression in gammadeltaT cells of human early pregnancy decidua suggests immunoregulatory potential // American Journal of Reproductive Immunology. - 2002. - Vol.48, №1. - P.9-17). По признаку продукции ТФР-β2 среди иммунных клеток выделяют регуляторные Т-лимфоциты. Однако, кроме лимфоцитов ТФР-β2 обнаруживают в синцитио- и цитотрофобласте, а также стромальных децидуальных клетках эндометрия (Transforming growth factor beta expression in human placenta and placental bed during early pregnancy / Simpson H., Robson S.C., Bulmer J.N., et al. // Placenta. - 2002. - Vol.23, №1. - P.44-58). Другой не менее важной функцией ТФР-β2, осуществляемой в зоне плацентанции гравидарного эндометрия, является ограничение цитотрофобластической инвазии (Graham C.H. Effect of transforming growth factor-beta on the plasminogen activator system in cultured first trimester human cytotrophoblasts // Placenta. - 1997. - Vol.18, №2-3. - P.137-143). Исследованиями показано, что ТФР-р2 блокирует активность матричных металлопротеиназ цитотрофобластических клеток посредством увеличения продукции тканевого ингибитора (TIMP-1) (Cytokine-mediated regulation of 92-kilodalton type IV collagenase, tissue inhibitor or metalloproteinase-1 (TIMP-1), and TIMP-3 messenger ribonucleic acid expression in human endometrial stromal cells / Huang H.Y., Wen Y., Irwin J.C., et al. // Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. - 1998. - Vol.83, №5. - P.1721-1729). Данные о характере изменений экспрессии ТФР-β2 при патологии беременности также противоречивы. На основании снижения уровня ТФР-β2 в сыворотке крови у женщин во втором триместре беременности прогнозируют невынашивание (Патент №2340899. Российская Федерация. Способ прогнозирования невынашивания во втором триместре беременности. / Левченко М.В., Орлов В.И. // Изобретения. Полезные модели. - 2008. - №34). При повышении уровня ТФР-β2, начиная с 5-й недели гестации, прогнозируют развитие фетоплацентарной недостаточности (Патент №2238567. Российская Федерация. Способ прогнозирования фетоплацентарной недостаточности. / Орлов А.В., Крукмер И.И., Погорелова Т.Н. и др. // Изобретения. Полезные модели. - 2004. - №29). Исследованиями, проведенными при угрозе и самопроизвольном прерывании беременности в первом триместре, показано повышение спонтанной продукции ТФР-β2 лимфоцитами как периферической крови, так и базальной децидуальной оболочки, однако общий уровень ТФР-β2 в экстрактах децидуальной ткани снижен по сравнению с неосложненным течением беременности (Иммунологическая загадка беременности / Под ред. Сотниковой Н.Ю. - Иваново: Изд-во МИК, 2005. - 276 с.).

Поскольку в процессе плацентации на ранних сроках беременности происходит тесное взаимодействие и интеграция развивающихся внезародышевых структур и базального эндометрия с формированием в последующем базальной пластинки плаценты и плацентарного ложа, то, вероятно, причиной развития первичной плацентарной недостаточности при самопроизвольном аборте является морфо-функциональная несостоятельность как трофобласта, так и эндометрия.

Трофобластическая недостаточность характеризуется выраженной задержкой роста и дифференцировки ворсинчатого хориона с преобладанием аваскуляризированных ворсин и редукцией ворсинчатого цитотрофобласта, а также слабовыраженной трофобластической инвазией в эндометрий. Резкое снижение индекса экспрессии СЭФР (равного или менее 1,5 у.е.) и ТФР-β2 (равного или менее 1,4 у.е.) в ворсинчатом хорионе отражает, по нашему мнению, функциональную недостаточность трофобласта вследствие его первичного повреждения, связанного прежде всего с генетическими аномалиями. Вышеуказанные значения индекса экспрессии обоих факторов роста предлагаем использовать в качестве диагностического критерия трофобластической формы первичной плацентарной недостаточности.

Эндометриальная недостаточность при самопроизвольном прерывании беременности в ранние сроки связана, прежде всего, с гормональными нарушениями и, в частности, с недостаточностью гравидарного желтого тела. Морфологический субстрат несостоятельности эндометрия составляют незавершенная децидуализация стромы эндометрия, неполноценная секреторная трансформация эндометриальных желез, слабая спирализация артерий эндометрия. Децидуальные клетки эндометрия посредством продукции факторов роста и других цитокинов оказывают регулирующее влияние на дифференцировку ворсинчатого хориона и цитотрофобластическую инвазию. По нашему мнению, иммуногистохимические признаки эндометриальной недостаточности при самопроизвольных абортах в первом триместре сочетают снижение экспрессии децидуоцитами СЭФР, оказывающего стимулирующее влияние на васкуляризацию, рост, дифференцировку ворсинчатого хориона и ремоделирование спиральных артерий, с одновременным увеличением экспрессии ТФР-β2, ингибирующим, как было сказано выше, цитотрофобластическую инвазию в эндометрий. Критериями эндометриальной формы первичной плацентарной недостаточности, согласно результатам проведенного исследования, являются значение индекса экспрессии СЭФР в децидуальных клетках, равного или менее 1,6 у.е., а индекса экспрессии ТФР-β2, равного или более 2,7±0,08 у.е.

В ряде случаев самопроизвольного прерывания беременности при наличии, как правило, базального и париетального эндометрита и нарушениях дифференцировки ворсинчатого хориона с преобладанием склерозированных ворсин профиль экспрессии СЭФР и ТФР-β2 в ворсинах хориона и децидуальных клетках сочетает признаки трофобластической и эндометриальной несостоятельности, что позволяет на основании иммуногистохимического исследования и вышеуказанных критериев диагностировать смешанную форму первичной плацентарной недостаточности.

Таким образом, иммуноморфологическое исследование ворсинчатого хориона и гравидарного эндометрия с изучением экспрессии двух факторов роста (СЭФР и ТФР-β2) при самопроизвольных абортах в первом триместре позволяет дифференцировать три различные по патогенезу формы первичной плацентарной недостаточности: трофобластическую, эндометриальную и смешанную.

Способ осуществляется следующим образом.

Материал, полученный путем выскабливания полости матки при самопроизвольном прерывании беременности в первом триместре, фиксируют в 10% нейтральном забуференном формалине в течение 24 часов. После гистологической проводки кусочки ткани заливают в парафин, изготавливают срезы толщиной 5 мкм, содержащие фрагменты ворсинчатого хориона и гравидарного эндометрия. Иммуногистохимическую реакцию проводят с использованием первичных антител фирмы Santa Cruz Biotechnology (моноклональные анти-VEGF антитела (клон С-1) в рабочем разведении 1:200 и поликлональные анти-ТОР-β2 антитела в рабочем разведении 1:400) и системы детекции LSAB + System HRP (Dako) по следующему протоколу:

1. Депарафинирование.

2. Демаскировка антигенных структур путем кипячения в скороварке в цитратном буфере рН 6,0 в течение 10 минут, остывание до комнатной температуры.

3. Блокирование эндогенной пероксидазы - инкубация с 3% перекисью водорода 20 минут во влажной камере при комнатной температуре.

4. Инкубация с первичными антителами в течение 20 часов (на ночь) во влажной камере при температуре +4°С.

5. Инкубация с вторичными биотинилированными антителами 20 минут во влажной камере при комнатной температуре.

6. Инкубация со стрептавидин-пероксидазным комплексом 20 минут во влажной камере при комнатной температуре.

7. Реакция с DAB-хромогеном 3 минуты при комнатной температуре.

8. Докраска ядер гематоксилином, заключение срезов. После каждого этапа срезы промывают в фосфатном буфере рН 7,4.

Оценку иммуногистохимической реакции проводят путем подсчета индекса экспрессии на 100 хориальных ворсин и 100 децидуальных клеток в 10 полях зрения микроскопа при увеличении ×100 и х400 соответственно.

Предварительно оценивают интенсивность иммуногистохимической реакции в баллах по следующему алгоритму:

0 баллов - отсутствие реакции;

1 балл - слабое или умеренное окрашивание только цитотрофобластического слоя эпителиального покрова ворсин / слабое окрашивание цитоплазмы децидуальных клеток;

2 балла - слабое или умеренное окрашивание ворсинчатого синцитио- и цитотрофобласта / умеренное окрашивание цитоплазмы децидуальных клеток;

3 балла - выраженное окрашивание синцитио-, цитотрофобласта и стромы ворсин / выраженное окрашивание цитоплазмы децидуальных клеток.

Индекс экспрессии изучаемых факторов высчитывают по формуле:

Индекс экспрессии = Σ P(i)·i/100,

где i - интенсивность реакции в баллах от 0 до 3;

P(i) - процент структур (ворсин хориона или децидуальных клеток), окрашенных с разной интенсивностью.

При индексе экспрессии СЭФР и ТФР-β2 в ворсинчатом хорионе, равном или менее 1,5 у.е. и равном или менее 1,4 у.е. соответственно, диагностируют трофобластическую форму первичной плацентарной недостаточности; при индексе экспрессии СЭФР в децидуальных клетках, равном или менее 1,6 у.е., а ТФР-β2, равном или более 2,7 у.е., диагностируют эндометриальную форму первичной плацентарной недостаточности; при одновременном выявлении вышеуказанных критериев диагностируют смешанную форму первичной плацентарной недостаточности.

Сущность способа поясним следующими примерами.

Пример 1

Женщина Г-ва, 32 лет. Начавшийся самопроизвольный выкидыш в сроке 9 недель. В анамнезе 2 беременности: 1 артифициальный аборт, 1 самопроизвольный выкидыш в раннем сроке. В стационаре выполнено выскабливание полости матки.

При гистологическом исследовании отмечено преобладание крупных аваскуляризированных ворсин с отеком стромы, эпителиальный покров истончен в результате почти полного отсутствия цитотрофобластического слоя. В компактном слое гравидарного эндометрия преобладают промежуточные децидуальные клетки, скудная диффузная инфильтрация лимфоцитами. В спонгиозном слое -вытянутые и пилообразные эндометриальные железы со светлым цилиндрическим эпителием. В зоне плацентации определяются небольшие разрозненные депозиты фибриноида, единичные клетки инвазивного цитотрофобласта в поверхностных отделах компактного слоя.

Проведено иммуногистохимическое исследование. Индекс экспрессии в ворсинах хориона составил: СЭФР - 1,3 у.е., ТФР-β2 - 1,4 у.е. Индекс экспрессии в децидуальных клетках составил: СЭФР - 2,3 у.е., ТФР-β2 - 2,1 у.е. Согласно заявляемому способу диагностирована трофобластическая форма первичной плацентарной недостаточности. Даны рекомендации к генетическому обследованию супружеской пары.

Пример 2

Женщина Б-ва, 26 лет. Начавшийся самопроизвольный выкидыш в сроке 9 недель. Беременность первая. Выполнено выскабливание полости матки.

При гистологическом исследовании выявлено преобладание гиповаскуляризированных ворсин с незавершенным дихотомическим делением с формированием синцитиальных почек и свободных симпластов. Цитотрофобластический слой в эпителии отдельных ворсин редуцирован. Признаки дифференцировки стволовых ворсин отсутствуют. В строме гравидарного эндометрия преобладают веретенообразные предецидуальные клетки, эндометриальные артерии слабо спирализованы, железы вытянутые и округлые с гладким внутренним контуром.

При проведении иммуногистохимического исследования индекс экспрессии в ворсинах хориона составил: СЭФР - 1,9 у.е., ТФР-β2 - 2,1 у.е. Индекс экспрессии в децидуальных клетках составил: СЭФР - 1,6 у.е., ТФР-β2 - 2,8 у.е. Согласно заявляемому способу диагностирована эндометриальная форма первичной плацентарной недостаточности. Даны рекомендации о первоочередном исследовании гормональной функции системы гипоталамус-гипофиз-яичники.

Пример 3

Женщина К-ва, 20 лет. Начавшийся самопроизвольный выкидыш в сроке 12 недель. Беременность вторая, 1-я - артифициальный аборт. Выполнено выскабливание полости матки.

При гистологическом исследовании диагностировано нарушение дифференцировки ворсинчатого хориона с преобладанием склерозированных аваскуляризированных ворсин. Гравидарный эндометрий с очаговыми некрозами и диффузной инфильтрацией полиморфно-ядерными лейкоцитами в компактном слое. В спонгиозном слое обнаружены очаговые перигландулярные воспалительные инфильтраты с преобладанием лимфоцитов. Децидуализация стромы эндометрия недостаточна: преобладают промежуточные децидуальные и предецидуальные клетки.

При проведении иммуногистохимического исследования индекс экспрессии СЭФР в ворсинах хориона составил: - 1,2 у.е., ТФР-β2 в ворсинах хориона - 1,1 у.е. Индекс экспрессии в децидуальных клетках составил: СЭФР - 1,4 у.е., ТФР-β2 - 2,7 у.е. Согласно заявляемому способу диагностирована смешанная форма первичной плацентарной недостаточности. Даны рекомендации к диагностике генитальных инфекций и проведению антибактериальной и противовоспалительной терапии.

Преимущества способа

1. Является объективным иммуноморфологическим методом дифференциальной диагностики патогенетических форм первичной плацентарной недостаточности: трофобластической, эндометриальной и смешанной.

2. Проводится прямая оценка состояния ворсинчатого хориона и децидуальных клеток гравидарного эндометрия на местном уровне.

3. В диагностике используются специфические для ворсинчатого хориона и децидуальных клеток ростовые факторы, непосредственно контролирующие процессы развития плаценты в первом триместре.

4. Повышает качество гистологического заключения и позволяет в индивидуальном порядке определить первоочередные мероприятия диагностики и реабилитации нарушений репродуктивной функции.

5. Заявленный способ высокоинформативен и прост в осуществлении оценки результатов.