Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГРАНУЛИРОВАННОГО ПРОДУКТА, ГРАНУЛИРОВАННЫЙ ПРОДУКТ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В ПЕСТИЦИДНОЙ КОМПОЗИЦИИ (ВАРИАНТЫ) И ПЕСТИЦИДНАЯ КОМПОЗИЦИЯ, ЕГО СОДЕРЖАЩАЯ

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области продуктов, предназначенных для обеспечения здоровья растений. В частности, оно относится к способу получения в промышленном масштабе гранул, обладающих высокой диспергируемостью в воде, которые содержат агент, обеспечивающий защиту растений, более конкретно хищный гриб (нематофаг). Изобретение относится также к полученным этим способом вододиспергируемым гранулам.

Введение

Являющиеся паразитами растений нематоды, которые атакуют почти все типы сельскохозяйственных культур, приводя к ежегодным потерям во всем мире, составляющим примерно 500 миллионов долларов США, известны уже в течение многих лет. Поскольку они обладают очень высокой устойчивостью к химическим обработкам, то для их уничтожения требуется применение продуктов с низким селективным действием и, как правило, вредных для окружающей среды.

Начиная с Саммита Земли, состоявшегося в Рио-де-Жанейро в 1992 г., и в соответствии с современными законами о защите биосферы, год за годом накладываются запреты на применение многочисленных традиционных нематоцидов, в результате чего фермеры остаются без средств защиты, в то время как рассматриваемая проблема может принимать более или менее драматический характер в зависимости от климатических областей и сельскохозяйственных культур. Поэтому возрастает интерес к альтернативным или «органическим» способам, которые не основаны на применении обычных химических пестицидов. Однако для того, чтобы разработать такие методы, необходимо не только доказать их эффективность в качестве обеспечивающих «органический» контроль решений, но и сделать их такими же простыми и практичными для применения фермером, что и применение обычных продуктов.

Среди «органических» (биологических) методов борьбы с вредителями все большее распространение приобретает применение антагонистических микроорганизмов. Например, известны противокомариные обработки, которые осуществляют с использованием бактерии, такой как Bacillus thuringiensis. Аналогичным образом можно осуществлять борьбу с белокрылкой (Trialeurodes vaporariorum), поражающей овощные культуры, применяя споры гриба, паразитирующего на личинках белокрылок (алейродиды, Verticillium leucanii).

Нитчатые грибы (Deuteromycetes, которые обычно относят к плесневым грибам) характеризуются наличием тонких трубчатых образований (гифов), как правило, прозрачных, имеющих диаметр порядка нескольких микронов; совокупность гифов образует мицеллий; указанные грибы размножаются вегетативно посредством конидий. Установлено, что некоторые нитчатые грибы, относящиеся к порядку Moniliales семейства Monilialeae (в частности, Arthrobothrys conoides Dreschsler), можно применять для борьбы с нематодами: они питаются нематодами, очищая тем самым почву от этих паразитов.

Для эффективного применения нитчатых грибов необходимо иметь стабильные препаративные формы, содержащие грибы в высоких количествах, с которыми легко можно манипулировать и которые легко вносить в почву. К сожалению, методы получения и хранения таких грибов, в частности грибов-нематофагов, все еще являются эмпирическими и полученные к настоящему времени результаты являются не совсем удовлетворительными.

В заявке на патент WO-A-2005078067 описаны эффективные культуральные среды для выращивания нитчатых грибов, но не указаны конкретные методы получения препаративных форм и/или их применения. В заявке на патент GB-A-857161 описано получение неорганических носителей (пемза, вермикулит, асбестовое волокно), поверхность которых обработана культурой грибов-нематофагов.

В патенте US 5811092 описана обработка поверхности зерен кукурузы культурами грибов-нематофагов; обработанное таким образом зерно смешивают с небольшими количествами почвы с получением инокулята и последний распределяют в подлежащей обработке почве; указанный метод в целом является эффективным, но количество грибов на зернах является весьма вариабельным, а внесение в почву очень неравномерным.

В заявке на патент US 2007/0292932 описано получение желированных пеллетов, содержащих грибы-нематофаги, которые пригодны для внесения в почву; однако получение, хранение и манипуляции с этими пеллетами являются довольно сложными.

Кроме того, известные из существующего уровня техники продукты являются слабо диспергируемыми в воде, и поэтому их необходимо диспергировать в почве в твердой форме; твердые частицы остаются в поверхностном слое и не обеспечивают требуемого проникновения грибов в более глубокие слои почвы; такое проникновение достигается лишь за счет дополнительных операций по обработке почвы (плужная обработка).

Таким образом, несмотря на вышеуказанные разработки ни один из имеющихся в настоящее время продуктов не является в полной мере удовлетворительным. Основная трудность заключается в том, что необходимо создать сухой гранулированный продукт, т.е. продукт, который легко хранить и с которым легко манипулировать, обладающий высокой диспергируемостью в воде и обеспечивающий более чем удовлетворительную жизнеспособность культуры, последние два условия не удавалось выполнить в сухих условиях.

Объектом настоящего изобретения является способ приготовления в промышленном масштабе сухой гранулированной формы, содержащей нитчатые грибы и более конкретно грибы-нематофаги, которая обеспечивает гарантированную стабильность, жизнеспособность и простоту применения. В частности, изобретение позволяет получать композиции с высоким содержанием грибов, с которыми легко манипулировать и которые легко вносить в почву, обеспечивающие высокую и равномерную нематоцидную активность на обработанной поверхности; при этом композиции можно приготавливать с помощью способа получения, который является простым, недорогим и который не оказывает вредного воздействия на жизнеспособность мицелия.

Краткое изложение сущности изобретения

В настоящем изобретении предложен способ включения нитчатых грибов в конкретную препаративную форму, находящуюся в твердой фазе, которая, как было установлено при создании изобретения, обеспечивает простое, однородное и эффективное внесение грибов в почву. Изобретение основано на применении обработки культуры нитчатых грибов, приводящей к получению сухих гранул с высоким содержанием грибов, легко диспергирующихся в воде. Обработка предусматривает смешение культуральной среды, предварительно инокулированной нитчатым грибом, с крахмальной мукой и модифицированным крахмалом. Затем полученный продукт смешивают с конкретными наполнителями и при необходимости с питательными веществами, взятыми в пропорциях, пригодных для получения легкогранулируемой пасты; гранулы, которые можно получать с помощью хорошо известных методов, выделяют и сушат до достижения определенного содержания влаги, как правило, составляющего от 5 до 15%. Полученный таким путем гранулированный продукт наиболее пригоден для сохранения жизнеспособности мицелия, он является сухим на ощупь, с ним легко могут манипулировать операторы, и он обладает высокой диспергируемостью в воде. Более подробно, способ заключается в том, что осуществляют перечисленные ниже стадии, на которых:

а) выращивают нитчатые грибы в пригодной жидкой культуральной среде в течение определенного периода времени;

б) смешивают продукт, полученный на стадии а), с крахмальной мукой и модифицированным крахмалом;

в) смешивают продукт, полученный на стадии б), с пригодными наполнителями и при необходимости с питательными веществами до получения гранулируемой пасты;

г) формируют гранулы, выделяют их и затем сушат, снижая содержание в них влаги до уровня, составляющего от 5 до 15%.

Другим объектом настоящего изобретения является гранулированный продукт, содержащий, прежде всего, компоненты, применяемые при осуществлении стадии б). Кроме того, под объем изобретения подпадают нематоцидные композиции, содержащие указанный выше гранулированный продукт, и применение указанных выше продуктов для обработки почв и/или культур, зараженных нематодами.

Описание чертежа

На чертеже показано сравнение результатов перемешивания суспензии гранул, известных из существующего уровня техники, которые были взяты в качестве эталона (справа), и суспензии диспергируемых гранул, предлагаемых в настоящем изобретении (слева).

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение можно применять для всех широко известных нитчатых грибов; предпочтительно применяемый гриб представляет собой обладающий нематоцидной активностью гриб, относящийся, например, к семейству Monilialeae; наиболее предпочтительными в этом семействе являются грибы вида conoides из рода Arthrobotrys, прежде всего Arthrobotrys conoides Dreschsler.

Культуральную среду для нитчатых грибов можно выбирать из числа известных в данной области питательных сред. Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения она содержит по меньшей мере один источник углерода, выбранный из группы продуктов, которые получают из мелассы, солодового экстракта, сахарозы, и по меньшей мере один источник органического азота, выбранный из дрожжевого экстракта и так называемого «жидкого кукурузного экстракта» («жидкости, полученной после замачивания зерен кукурузы до разбухания». Получение такой среды подробно описано в заявке на патент WO-A-2005078067, включенной в настоящее описание в качестве ссылки. В такой среде на долю источника углерода предпочтительно приходится от 70 до 85 мас.% в пересчете на сухую массу культуральной среды, а на долю указанного выше источника органического азота приходится от 15 до 30 мас.% в пересчете на сухую массу культуральной среды. Культуральная среда может дополнительно включать источник минерального азота, представляющий собой нитраты или соли аммония. Обычно этот источник минерального азота постепенно добавляют к культуральной среде в процессе выращивания гриба в количествах, не превышающих 10 мас.% в пересчете на сухую массу культуральной среды, предпочтительно в количествах, составляющих от 5 до 8%.

Наиболее предпочтительная культуральная среда состоит на 75-85% из солодового экстракта и на 15-25% из дрожжевого экстракта, где проценты представляют собой мас.% в пересчете на сухую массу культуральной среды. Другая предпочтительная культуральная среда содержит мелассу в количестве, составляющем 60-65%, сахарозу в количестве, составляющем 10-15%, жидкий кукурузный экстракт в количестве, составляющем 10-15%, и дрожжевой экстракт в количестве, составляющем 10-15%. Эта культуральная среда дополнительно содержит также источник минерального азота, предпочтительно вторичный кислый фосфат аммония, в количестве, составляющем 5-8%. Последняя предпочтительная культуральная среда содержит два источника углерода, а именно солодовый экстракт в количествах, составляющих от 25 до 30%, и мелассу в количествах, составляющих от 40 до 45%, а также жидкий кукурузный экстракт в количествах, составляющих от 25 до 30%.

Солодовый экстракт получают из прорастающих зерновых культур, как правило, из ячменя. В процессе прорастания в них происходит образование ферментов, более конкретно, амилазы, которая осуществляет превращение крахмала в сахара. Солодовый экстракт содержит мальтозу в количестве, составляющем примерно 60%, витамины и другие многочисленные олигоэлементы.

Меласса представляет собой побочный продукт сахарной промышленности, и она находится в форме вязкой жидкости черно-коричневого цвета, которая содержит воду в количестве 10%, сахарозу в количестве 35%, другие сахара в количестве 20% и золу в количестве 15%. Дрожжевой экстракт получают путем автолиза Saccharomyces cerevisiae, и он находится в форме тонкого порошка, имеющего светло-желтую окраску, который легко растворим в воде. Дрожжевой экстракт содержит пептиды, свободные аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания, а также водорастворимые витамины группы В. Общее содержание азота в дрожжевом экстракте составляет 10%, а α-аминоазота - 5%.

Жидкий кукурузный экстракт получают путем мацерации (вымачивания) кукурузы при 50°С в течение 24-48 ч в воде, содержащей диоксид серы. Последний реагент позволяет связывать белковую сеть, окружающую зерна, и обладает тем преимуществом, что он препятствует развитию нежелательных микроорганизмов в процессе мацерации. Общее содержание азота в жидком кукурузном экстракте составляет 7%, содержание α-аминоазота составляет 1,7%, экстракт содержит также сахара в количестве, составляющем до 5%, калий в количестве 4%, фосфор в количестве 3% и минералы в количестве 17%.

Согласно способу получения, предлагаемому в изобретении, выращивание нитчатого гриба в указанных выше культуральных средах предпочтительно осуществляют в течение периода времени, составляющего 5-10 дней, при постоянной температуре от 23 до 30°С. Для изготовления гранул приготавливают смесь, содержащую модифицированный крахмал и крахмальную муку. В этой смеси на долю модифицированного крахмала предпочтительно приходится 30-60 мас.% (более предпочтительно 33%), в то время как на долю муки приходятся остальные 70-40% (более предпочтительно 67%), указанные проценты даны по отношению к массе сухого вещества. Предпочтительным модифицированным крахмалом является Cleargum, (натрийоктенилсукцинат крахмала), продукт, который получают путем ферментативного гидролиза крахмала, полученного из кукурузы восковой спелости. В качестве муки можно применять любую зерновую муку или другие содержащие крахмал продукты, предпочтительно кукурузную муку.

Перед смешением с культуральной средой указанную смесь предпочтительно разбавляют кипящей водой в массовых соотношениях, составляющих 40-60% (более предпочтительно 52% относительно воды). Например: 100 г раствора субстанции в кипящей воде содержат 17 г модифицированного крахмала, 35 г крахмальной муки и 48 г воды.

После охлаждения в указанную первую смесь добавляют, предпочтительно в объемном соотношении 1:1, описанную выше культуральную среду, которая предварительно была инокулирована нитчатыми грибами и в которой они были выращены. Затем в образовавшийся раствор добавляют соответствующие наполнители и при необходимости питательные вещества, которые в сочетании с остальными компонентами препаративной формы обеспечивают ее стабильность, запас питательных веществ для грибов и позволяют приготавливать гранулы, обладающие требуемыми консистенцией и объемом.

Предпочтительно наполнитель представляет собой диатомовую землю, а питательные вещества выбирают из группы, включающей различные виды муки и сахара. Предпочтительным наполнителем является Celaton FPM 0,08. Он представляет собой продукт на основе диатомовой скорлупы (одноклеточные содержащие кремний водоросли) с размером частиц порядка 0,08 микронов. Этот продукт обладает способностью абсорбировать в определенном количестве воду, что позволяет получать гранулы требуемого объема, защищая тем самым микроорганизмы от возможных внешних воздействий (вариации температуры, влажность и т.д.).

Среди различных видов муки предпочтительной в качестве источника питательных веществ является кукурузная мука. Она представляет собой натуральный продукт, обладающий способностью абсорбировать воду в количествах, в несколько раз превышающих ее собственный объем, и в конкретном случае она также увеличивает объем гранулы. Кроме того, кукурузная мука представляет собой важный источник питательных веществ для нитчатых грибов, содержащихся в грануле, который является доступным сразу же после диспергирования в почве, подлежащей обработке.

Сахара помогают повышать жизнеспособность грибов, прежде всего в результате стабилизации клеточных мембран.

В способе, являющемся объектом изобретения, вышеуказанные наполнители и при необходимости питательные вещества добавляют к смеси, полученной на стадии б). Когда применяют только наполнители, то предпочтительно наполнитель представляет собой диатомовую землю. Когда наполнители применяют в комбинации с питательными веществами, то предпочтительно применяют смесь диатомовой земли и муки, к которой в небольших количествах можно добавлять сахара. Предпочтительная смесь содержит наполнители в количестве, составляющем 30-50 мас.% (предпочтительно 33 мас.%), и муку различных видов, на долю которой приходится остальные 70-50 мас.% (предпочтительно 67%). Сахара в случае их применения присутствуют в количествах, составляющих от 10 до 20 мас.% по отношению к массе смеси наполнителей и муки различных видов.

Наполнители и при необходимости питательные вещества добавляют в виде смеси или по отдельности к смеси, полученной на стадии б), до образования компактной пасты. Предпочтительно в указанной пасте на долю смеси наполнителей и при необходимости питательных веществ, применяемой на стадии в), приходится от 15 до 50 мас.%. Например: 34 г смеси наполнителей и питательных веществ добавляют к 100 г смеси, полученной на стадии б). Как правило, полученная таким путем паста имеет содержание влаги, находящееся в пределах от 30 до 60%, предпочтительно от 35 до 55%, более предпочтительно примерно 47%. Образовавшуюся в результате смесь подвергают общепринятым процессам грануляции, например, таким как экструзия, получая гранулы с величиной диаметра, предпочтительно находящейся в пределах от 3 до 5 мм. Содержание влаги в гранулах перед сушкой практически идентично содержанию влаги в пасте. Сушку гранул можно осуществлять в потоке стерильного воздуха при температуре 25-30°С. В результате сушки процент влаги снижают до величины, составляющей менее 13%, предпочтительно находящейся в пределах от 9 до 10%. В результате такой обработки гранулы приобретают требуемые консистенцию и объем.

Под объем настоящего изобретения подпадает сам гранулированный продукт, полученный с помощью указанного выше способа. Такой продукт находится в гранулированной форме, является сухим на ощупь и отличается прежде всего тем, что он содержит один или несколько видов нитчатых грибов, модифицированный крахмал и крахмальную муку, указанные в описании стадии б), и пригодные наполнители и при необходимости питательные вещества, указанные в описании стадии в). Гранулированный продукт можно применять без дальнейшей обработки или его можно включать в состав препаративной формы вместе с другими обычными ингредиентами с помощью хорошо известных методов; полученная таким путем пестицидная композиция также представляет собой объект изобретения. И, наконец, под объем изобретения подпадает применение указанных выше продуктов для обработки субстрата, зараженного нематодами или другими паразитами, чувствительными к нитчатым грибам.

Настоящее изобретение обладает рядом преимуществ, которые можно охарактеризовать следующим образом.

С точки зрения процесса производства:

- небольшое количество операций, что позволяет поддерживать стерильность при осуществлении процесса;

- быстрая сушка, что обусловлено тем, что содержание влаги является небольшим уже в самом начале процесса;

- высокая диспергируемость продукта, что позволяет лучше оценивать содержание микроорганизмов;

- процесс обеспечивает защиту активности микроорганизмов.

С точки зрения потребителя:

- обладающая высокой диспергируемостью препаративная форма обеспечивает возможность ее применения различными путями: ее можно разбрасывать на защищаемую почву, но, что является преимуществом, ее можно также добавлять в ирригационную систему;

- добавление продукта к ирригационной воде устраняет необходимость в осуществлении дополнительных обработок с целью диспергирования нематоцида; жидкий продукт равномерно распределяется по поверхности и, что является преимуществом, также проникает и в глубокие слои почвы, не требуя плужной обработки или других операций по перемещению почвы;

- диспергирование в воде требует небольшого времени (оно осуществляется в течение нескольких секунд) при температуре окружающей среды при слабом перемешивании;

- гранулированная препаративная форма с низким содержанием влаги представляет собой продукт, с которым потребитель может легко манипулировать, он является сухим на ощупь, текучим, его легко загружать и выгружать из бункеров и т.д., при этом отсутствует прилипание частиц к стенкам контейнера.

В приведенных ниже примерах вариантов осуществления изобретения, представленных с целью его иллюстрации, но не с целью ограничения объема, применяли нитчатые грибы семейства Monilialeae, в частности нитчатый гриб Arthrobotrys conoides Dreschsler.

Экспериментальный раздел

Пример 1

Культуру нитчатого гриба получали в реакторе объемом 2 л, содержащем 1,2 л культуральной среды. Реактор представлял собой круглодонный контейнер, снабженный спиральной мешалкой, регулятором температуры и системой охлаждения, впускным воздушным клапаном, а также датчиками для измерения значения рН, концентрации O₂ и температуры. Продукт, содержащий солодовый экстракт в концентрации 20 г/л и дрожжевой экстракт в концентрации 4 г/л, подвергали стерилизации перед осуществлением инокуляции конидиями гриба A. conoides. Культуру выращивали в течение 6 дней из инокулята при температуре примерно 27°С. В процессе культивирования брали образцы культуральной среды для определения сухой массы (г/л) и, следовательно, количества пропагулов (КОЕ/л). Для определения сухой массы фильтровали 20 мл культуральной среды и затем сушили в печи при 100°С в течение 24 ч. Определяли количество пропагулов на 1 мл культуральной среды. По окончании указанного периода времени концентрация гриба составляла примерно 8 г/л, что было эквивалентно количеству пропагулов, составляющему 6×10⁹ на один литр.

Смесь, содержащую Cleargum и кукурузный крахмал (в массовом соотношении 1:1), диспергировали в кипящей воде до достижения концентрации 54 мас.%. После охлаждения добавляли культуральную среду, содержащую гриб в равном количестве добавленной перед этим воды. Затем к полученной таким путем смеси добавляли Celaton FPM 0,08 в количествах, составляющих 28 мас.% по отношению с указанной первой смеси, до получения компактной пасты. Эту пасту вносили с помощью шпателя в шприц и затем распределяли в равномерных количествах на алюминиевую фольгу. После сушки в течение нескольких минут в потоке воздуха при максимальной температуре 30°С процентное содержание влаги в продукте становилось эквивалентным 7,9% и гранулы свободно отделялись от алюминиевой фольги.

После внесения гранулы в 9 мл стерильной воды и нескольких разведений можно было определить количество пропагулов, содержащихся в грануле, которое оказалось эквивалентным 8×10³ КОЕ/гранулу (среднее арифметическое результатов определения для пяти гранул), что соответствовало проценту выживаемости, равному 50%. Этот процент является более чем удовлетворительным для представленного в настоящем описании процесса.

Пример 2

Тест, описанный в данном примере, проводили с использованием той же самой культуры грибов, которая применялась в примере 1, но с вариациями пропорций компонентов, входящих в препаративную форму. Смесь, содержащую Cleargum (18%) и кукурузный крахмал (36%), смешивали с кипящей водой, взятой в количестве, соответствующем 45% общей смеси. После охлаждения добавляли культуральную среду, содержащую гриб, в количествах, эквивалентных количеству предварительно добавленной воды. Затем к полученной таким путем смеси добавляли Celaton FPM 0,08 в количествах, эквивалентных 25 мас.% относительно количества указанной первой смеси, до получения компактной пасты. После сушки в течение нескольких минут в потоке воздуха при температуре 30°С процентное содержание влаги в продукте становилось эквивалентным 8,8%. После растворения гранулы в 9 мл стерильной воды и нескольких разведений можно было определить количество пропагулов, содержащихся в грануле. Оно составляло 1×10⁴ КОЕ/гранулу, что соответствует проценту выживаемости, равному 66%. Такой процент можно считать оптимальным для представленного в настоящем описании процесса.

Пример 3

Тест, описанный в данном примере, проводили с использованием той же самой культуры грибов, которая применялась в примере 1, но с вариациями пропорций компонентов, входящих в препаративную форму. Смесь, содержащую Cleargum (16%) и кукурузный крахмал (31,5%), смешивали с кипящей водой (52,5%). После охлаждения добавляли культуральную среду, содержащую гриб, в количествах, эквивалентных количеству предварительно добавленной воды. Затем к полученной таким путем смеси добавляли смесь, содержащую кукурузный крахмал (54%) и Celaton FPM 0,08 (46%), в количествах, эквивалентных 45 мас.% относительно количества указанной первой смеси, до получения компактной пасты. После сушки в течение нескольких минут в потоке воздуха при температуре 30°С процентное содержание влаги в продукте становилось эквивалентным 9%.

После растворения гранулы в 9 мл стерильной воды и нескольких разведений можно было определить количество пропагулов, содержащихся в грануле, которое оказалось эквивалентным 1,2×10⁴ КОЕ/гранулу, что соответствовало проценту выживаемости, равному 83%. Такой процент можно считать высоким для представленного в настоящем описании типа процесса. После хранения в течение месяца в пластиковом контейнере при температуре от 18 до 25°С процент выживаемости (количество присутствующих пропагулов относительно количества пропагулов, обнаруженных сразу после приготовления гранул), оставался все еще очень высоким и составлял примерно 95%.

Пример 4

150 г гранулированного продукта, полученного согласно методу, описанному в примере 3, диспергировали в 1000 мл воды при температуре окружающей среды при слабом перемешивании, которое осуществляли с помощью магнитной мешалки при 500 об/мин в течение 5 мин.

Параллельно этому в идентичных условиях обрабатывали 150 г желированных пеллетов, полученных согласно методу, описанному в примере 1 US 2007/0292932 (эталон для сравнения). По окончании перемешивания оба раствора обследовали визуально с целью оценки состояния растворения продукта. Как четко видно на чертеже, служившие в качестве эталона желированные пеллеты (1) все еще полностью сохраняли свою целостность, находились в нерастворенном состоянии и осаждались на дно сосуда с раствором; в отличие от этого гранулы (2), полученные согласно процедуре, изложенной в примере 3 настоящего описания, были идеально диспергированы (см. чертеж).