СПОСОБ ОЦЕНКИ НАПРЯЖЕННОСТИ ПОСТВАКЦИОНАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА К ВИРУСУ ГРИППА

Изобретение относится к медицине, а именно к инфекционной иммунологии, и касается разработки иммунологической видоспецифической системы для оценки сероконверсии в ответ на иммунизацию в ходе вакцинопрофилактики гриппа на основе безинструментального определения уровня антител.

Ежегодно в РФ проводится профилактическая иммунизация населения, направленная на предупреждение, ограничение распространения и ликвидацию инфекционных болезней. Законодательством регламентирована вакцинация населения в рамках национального календаря прививок, а также по эпидемическим показателям. Для оценки эффективности профилактических мер осуществляют мониторинг напряженности поствакцинального иммунитета, основанный на измерении содержания антител в сыворотке крови испытуемых.

Одним из наиболее социально значимых заболеваний в РФ является грипп. Ежегодно в течение первого полугодия происходит сезонный подъем заболеваемости гриппом, в период которого количество больных достигает в определенных регионах 70-100 человек на 10000 населения. Профилактические мероприятия ежегодно затрагивают более 30 млн человек, из которых примерно половину составляют дети. При этом статистика свидетельствует о том, что процент заболеваемости среди привитых пациентов весьма высок и достигает 35-40%. Система тотального мониторинга эффективности вакцинации в системе противоэпидемических мер отсутствует. В качестве причины чаще всего называют отсутствие аналитических инструментов (тест-систем), пригодных для быстрого, эффективного, упрощенного тестирования.

Высокая продолжительность эпидемического подъема заболевания (в среднем по РФ 4-6 недель), масштаб его негативного влияния на социально-экономическую сферу обуславливают необходимость совершенствования методов серологической диагностики, которые позволили бы более оперативно, и в то же время с высокой степенью надежности, производить мониторинг состояния противогриппозного иммунитета среди населения в условиях напряженной эпидемической ситуации.

Основным и наиболее близким по технической сущности к разработанному способу является метод серологического анализа гриппа при помощи сухого гриппозного диагностикума, используемого в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) (Рег. номер 94/161/330 ФС 42-310 ВС-90, утв. приказом Минздравмедпрома РФ от 10.08.1994 №161).

Сущность способа-прототипа заключается в следующем.

Диагностикум представляет собой лиофильно высушенные штаммы вируса гриппа. Реакция основывается на способности иммунной сыворотки ингибировать инициированную вирусом агглютинацию эритроцитов кур.

Реакцию проводят в U-образных лунках полистирольного планшета. Готовят серию двукратных разведений исследуемого образца, к каждому разведению добавляют диагностикум. Инкубацию проводят в течение часа при температуре 25°C. После этого в лунки вносят 1% суспензию эритроцитов, предварительно трехкратно отмытых физиологическим раствором и центрифугированием. При наличии в сыворотке антител к вирусу гриппа агглютинации эритроцитов не наблюдается.

Основными недостатками описанного метода является:

- необходимость наличия и предварительной подготовки эритроцитов кур;

- необходимость длительной подготовки пробы и диагностикума перед процедурой анализа (титрование раствора антигена, истощение пробы в отношении неспецифических индукторов агглютинации);

- нестабильность при хранении эритроцитарного диагностикума;

- невозможность сохранения (документирования) результатов анализа;

- потребность в постановке дополнительных контрольных опытов, демонстрирующих отсутствие неспецифической агглютинации.

Предлагаемое изобретение решает задачу по созданию более простой, высокочувствительной, оперативной, наглядной и надежной диагностической системы для оценки напряженности поствакцинального иммунитета к вирусу гриппа.

Решение задачи осуществляется благодаря тому, что процедурный формат тест-системы носит безинструментальный характер и предусматривает использование для сенсибилизации твердой фазы противогриппозной вакцины, при том что визуализация сформировавшихся в ходе инкубации сенсибилизированной поверхности иммуносорбента с тестируемой сывороткой, содержащей антитела к вирусу гриппа, комплексов антиген-антитело проводят при помощи оптически контрастного конъюгата G белок-углерод в течение 10-15 минут.

Новизна разработанного способа заключается в использовании противогриппозной вакцины в качестве сенситина. Идентичность антигенов, используемых в вакцине и применяемых для сенсибилизации твердой фазы, обеспечивает высокую чувствительность и специфичность разработанной системы. Высокие показатели чувствительности, позволяющие определять наличие антител в разведении сыворотки 1/51200, делают возможным использование разработанного способа не только для анализа поствакцинального иммунитета, но и для качественной характеристики вакцин, выпускаемых различными производителями.

Описание разработанного способа. В качестве твердой фазы используется мембрана из нитроцеллюлозы с диаметром пор 0,45 мкм (Bio-Rad, США).

На диски из нитроцеллюлозной мембраны диаметром 5 мм наносили сенситин (вакцину) по 5 мкл в забуференном фосфатами физиологическом растворе с азидом натрия (ЗФР). В качестве внутреннего отрицательного контроля сорбировали бычий сывороточный альбумин (БСА) в концентрации 0,1 мг/мл.

После подсушивания мембраны и инкубации (5 мин) в блокирующем растворе, в качестве которого использовали забуференный фосфатами физиологический раствор, содержащий 0,05% твина-20 (ЗФРТ), мембраны помещали в лунки планшета, заполненные сыворотками вакцинированных пациентов с серийным разведением, кратным двум, начиная с разведения 1:50 на 30 минут. После чего мембраны промывали ЗФРТ и осуществляли детекцию конъюгатом G белок-углерод в течение 10-15 минут. Конъюгат G белок-углерод готовили по оригинальному способу (Раев М.Б. Частицы коллоидного углерода в качестве меток диагностических реагентов // Вестник уральской медицинской академической науки. 2006. №3(1). С.202-205). В качестве источника частиц углерода использовали аморфный углерод, который получали в виде сажи путем конденсирования из пламени горящего толуола на стеклянной поверхности с последующей тщательной промывкой и высушиванием.

В процессе получения суспензии углеродных частиц к 2-х процентному раствору белка G в ЗФР добавляли аморфный углерод до конечной концентрации 5% в условиях вихревого перемешивания на магнитной мешалке. Полученную суспензию озвучивали в ультразвуковом дезинтеграторе, центрифугировали, активировали при помощи глутарового альдегида в присутствии G белка. Процесс конъюгирования проводили в течение 1 часа 40 минут при комнатной температуре и интенсивном перемешивании, после чего реагент центрифугировали при 6000 g и освобождали от избытка глутарового альдегида и несвязавшегося анти-лиганда гель-фильтрацией на колонке с Сефарозой CL-6B. Полученный конъюгат использовали для детекции в системах анализа.

Пример

На диски из нитроцеллюлозной мембраны диаметром 5 мм наносили сенситин (вакцину противогриппозную «Ваксигрипп», разведенную в ЗФР 1:16) по 5 мкл. В качестве внутреннего отрицательного контроля сорбировали бычий сывороточный альбумин (БСА) в концентрации 0,1 мг/мл.

После подсушивания мембраны и инкубации (5 мин) в блокирующем растворе, в качестве которого использовали забуференный фосфатами физиологический раствор, содержащий 0,05% твина-20 (ЗФРТ), мембраны помещали в лунки планшета, заполненные сывороткой вакцинированных с серийным разведением, кратным двум, начиная с разведения 1:50. Тестированию подвергали по четыре сыворотки от каждого пациента: взятые в день вакцинации, спустя 3, 4 и 5 недель после нее. В качестве внешнего положительного контроля использовали сыворотку здорового кролика в аналогичных разведениях в том же буфере. После этого мембраны промывали ЗФРТ и осуществляли детекцию конъюгатом G белок-углерод в течение 10-15 минут.

Результаты представлены на рисунке 1. Чувствительность сконструированной системы превышает на 2 порядка чувствительность РТГА - стандартного метода серологической диагностики гриппа, длительность аналитической процедуры не превышает 45 минут, результаты исследования можно хранить бесконечно долго и использовать при необходимости мониторинга качественных показателей иммуногенности вакцин и иммунореактивности вакцинируемых пациентов.

Каждый ряд дисков на рис.1 соответствует одной исследованной сыворотке, в верхней части рисунка указаны их разведения, на все диски нанесена вакцина в разведении 1:16. 0, 3, 4, 5 - сыворотки пациента, полученные соответственно в день вакцинации, спустя 3, 4 и пять недель после нее; Кр - сыворотка здорового кролика; ОК - внутренний отрицательный контроль - диск с нанесенным БСА в концентрации 0,1 мг/мл, инкубированный с сывороткой пациента, полученной в день вакцинации. Стрелками обозначены последние визуализированные точки в рядах серийных разведений.

На рисунке видно, что с помощью разработанной системы были выявлены восьмикратный прирост титра антител в сыворотке крови пациента спустя 3 недели после вакцинации и его сохранение в течение последующих двух недель. Максимальное разведение сыворотки, в котором были обнаружены антитела против вируса гриппа, составило 1:51200, что на 2 порядка выше, чем в стандартном методе анализа (РТГА).

Таким образом, разработанный метод позволяет усовершенствовать оценку состояния поствакцинального противогриппозного иммунитета, упростить ее на фоне существенного повышения чувствительности тестирования, создав условия для возможности тотальной оценки эффективности профилактических мер. Важнейшими составляющими результатов внедрения разработанного способа является возможность своевременного внесения коррекции в процесс вакцинации и/или оценить качество вакцинного препарата.

Таким образом, предложенный способ позволяет существенно улучшить и сократить по времени оценку напряженности иммунитета в ответ на вакцинацию, за счет высокой чувствительности системы определения специфических антител в сыворотке: 1:51200, и увеличить специфичность оценки за счет использования в качестве сенситина противогриппозной вакцины.

Технический результат от использования изобретения заключается в повышении диагностической эффективности при сохранении высокой чувствительности и видоспецифичности способа, сокращении времени на проведение исследования, неинструментальной визуализации результатов исследования и возможности сохранения (документирования) результата исследования в течение длительного времени.

Заявляемое техническое решение соответствует критерию «промышленное применение», так как применяемые реагенты доступны, а исследования легко выполняемы.