Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ФОРМИРОВАНИЯ МНОГОФУНКЦИОНАЛЬНЫХ МИКРОСИСТЕМ

Изобретение относится к области химии высокомолекулярных соединений, в частности к способам получения полимерных носителей путем химической модификации исходных полимерных микросфер на основе акролеина и стирола

Изобретение предназначается для использования в биотехнологии, медицине, ветеринарии, биохимии, аналитической химии, мониторинге состояния окружающей среды и других отраслях для получения носителей для иммобилизации физиологически активных лигандов.

Описание изобретения

Полимерные синтетические микросферы с узким распределением по размерам применяют в различных областях науки и техники, например, в качестве калибровочных эталонов в электронной и оптической микроскопии, при подсчете аэрозольных частиц, при малоугловой рефракции рентгеновских лучей, для счета вирусных частиц, для стимулирования клеточного продуцирования антител и их очистки, в качестве модельных коллоидных систем для изучения их реологии, стабильности, седиментации и т.д. В последние годы микросферы монодисперсных суспензий нашли широкое применение в качестве носителей биологических лигандов при создании реагентов для биоаналитических исследований, основанных на детекции специфических взаимодействий биообъектов. Основные требования, которым в этом случае должны удовлетворять полимерные микросферы, - это биологическая, химическая и коллоидная устойчивость в физиологических жидкостях, узкое распределение частиц по размерам, функционализация поверхности, определяющая направленность действия микросфер. Кроме того, необходимо уметь получать дисперсии с заданными размерами микросфер, которые содержат визуализурующие метки, которые определяют их применение в различных видах анализа с визуальной или инструментальной детекцией результатов биоспецифических реакций.

К настоящему времени разработаны способы включения гидрофобных визуализирующих меток в процессе эмульсионной полимеризации стирола, по которому получают частицы с диаметром от 400 нм и широким распределением по размерам. [Yang X, Zhang Y. Encapsulation of quantum nanodots in polystyrene and silica micro-nanoparticles. Langmuir. 20, 6071-6073 (2004)]. Однако частицы характеризовались низкой интенсивностью флуоресценции, вероятно, из-за отсутствия эффективного транспорта визуализирующие метки из капель мономера в растущие полимерно-мономерные частицы.

Известен способ миниэмульсионной полимеризации стирола, который позволяет вводить визуализирующие метки на стадии полимеризации, при этом получают интенсивно флуоресцирующие частицы. [А.С.С. Esteves, A. Barros-Timmons, Т. Monteiro, Т. Trindade, J. Nanosci. Nanotechnol. 2005, 5, 766-771]. Полученные полимерные дисперсии предлагалось использовать в качестве носителя для флуоресцентного иммуноанализа, но наличие двух пулов частиц с различными диаметрами, из которых частицы с наименьшем диаметром на содержат визуализирующие метки, ограничивает область их применения.

Кроме того, описанные подходы трудоемки и многоступенчаты, а полученные микросферы не содержат функциональные группы, необходимые для использования микросфер в биоаналитических исследованиях.

Известен способ введения визуализирующих меток в функционализированные полимерные микросферы, согласно которому водную среду предварительно синтезированной дисперсии сополимерных микросфер на основе акролеина и стирола заменяют на водно-органическую (вода:пропанол-2, 20:10). В процессе набухания сополимерных микросфер к ним добавляют визуализирующие метки в смеси растворителей хлороформ:пропанол-2, 1:20 после удаления триоктилфосфин оксида, который стабилизирует визуализирующие метки в процессе их получения [А.N Generalova, S.V. Sizova, Т.A. Zdobnova., М.М. Zarifullina, М.V. Artemyev, А.V. Baranov, V.A. Oleinikov, V.P. Zubov, S.М. Deyev, Submicron polymer particles containing fluorescent semiconductor nanocrystals CdSe/ZnS for bioassays, Nanomedicine, 2011, V. 6, №2, p. 195-209.], Полученные флуоресцентные микросферы отвечают необходимым требованиях для их использования в биоанализе, однако наблюдается снижение интенсивности флуоресценции и смещение пика эмиссии в красную область по сравнению с исходными визуализирующими метками.

Изобретение решает задачу - разработать эффективный способ получения функционализированных частиц регулируемого диаметра без указанных недостатков. Поставленная задача решается за счет введения визуализирующих меток в состав полиэлектролитных (ПЭ) комплексов, сформированных на поверхности полимерных частиц, так называемый метод послойной адсорбции ПЭ, который является простым методом самосборки, позволяющим исключить сложные химические реакции; предлагает большой выбор ПЭ для внешнего слоя (белки, ферменты и т.д.), который определяет применение полимерных частиц в биоанализе; дает возможность подобрать размер и структуру многослойных частиц в соответствии с требованиями дальнейшего их применения.

Визуализирующие метки могут быть включены в состав полимерных микросфер на стадии синтеза. В Авторском свидетельстве №1565845 // Ю.В. Лукин, В.А. Сочилин, В.Н. Бахарев, И.А. Грицкова, В.П. Зубов, М.К. Клявиньш, А.С. Роска, А.Х. Зицманис, 22.01.1990 описан способ получения полиакролеиновых микросфер путем полимеризации акролеина в водно-щелочной среде в присутствии в присутствии водорастворимых органических красителей, который позволяет получать окрашенные и флуоресцентные микросферы. Кроме того, эти микросферы содержат функциональные группы (альдегидные), посредством которых может осуществляться присоединение направляющих биоспецифических модулей. Однако эти микросферы характеризовались недостаточной химической стабильностью. Полупроводниковые нанокристаллы включали в процессе эмульсионной полимеризации стирола, в результате чего получены полимерные микросферы с очень низкой флуоресценцией, вероятно, из-за отсутствия эффективного транспорта нанокристаллов из капель мономера в растущие полимерно-мономерные частицы [Yang X, Zhang Y.: Encapsulation ofquantum nanodots in polystyrene and silica micro-nanoparticles. Langmuir. 20, 6071-6073 (2004)]. Метод миниэмульсионной полимеризации стирола позволил решить эти проблемы, но не дал возможности получить интенсивно флуоресцирующие, коллоидно-устойчивые частицы [Joumaa N, Lansalot М, Theretz A, et al.: Synthesis of quantum dot-tagged submicrometer polystyrene particles by miniemulsion polymerization. Langmur. 22, 1810-1816 (2006). Однако эти подходы трудоемки и многоступенчаты, а введение визуализирующих меток на стадии синтеза снижает агрегативную устойчивость полимерных микросфер, усложняет процесс регулирования их свойств и диаметров.

Известен способ получения полимерных частиц, содержащих визуализирующие метки, которые основаны на введении этих меток в уже сформированные микросферы в процессе их набухания в растворителе. Описаны способы введения маслорастворимых органических красителей в полистирольные микросферы, после их предварительного набухания в растворителе. По другому способу полупроводниковые нанокристаллы включали в микросферы на основе сополимера акролеина и стирола, которые находились в пропаноле-2. Нанокристаллы вводили в виде суспензии в смеси растворителей хлороформ/пропанол-2. [А.Н. Генералова, С.В. Сизова, М.С. Гонцова, А.В. Баранов, В.Г. Маслов, М.В. Артемьев, Д.В. Клинов, К.Е. Мочалов, В.П. Зубов, В.А. Олейников. Синтез субмикронных сополимерных (акролеин/стирол) микросфер, содержащих флуоресцентные полупроводниковые CgSe/ZnS нанокристаллы // Российские нанотехнологии, 2 (7-8), 2007, 144-154].

Изобретение предлагает такой способ модификации полимерных микросфер на основе акролеина и стирола, который позволяет унифицировать процедуру введения визуализирующих меток, используя предварительно синтезированные коллоидно и химически устойчивые микросферы, модифицированные ПЭК и содержащие на поверхности направляющий модуль.

Прототипом может служить способ включения полупроводниковых нанокристаллов CdSe/ZnS в слои ПЭК, сформированные на поверхности полиакролеиновых частиц [A.N. Generalova, М.М. Zarifullina, E.V. Lankina, S.V. Sizova, M.V. Artemyev, V.P. Zubov, V.A. Oleinikov, Optical sensing quantum dot-labeled polyacrolein particles prepared by layer-by-layer deposition technique, J. of Colloid and Interface Science, 2011, V. 357, 265-272]. Задачей этой работы являлось получение полимерных частиц диаметром 1.2 мкм методом осадительной полимеризацией акролеина в водно-щелочной среде. Полиакролеиновые микросферы играют роль ядра, на которой формируются ПЭК за счет последовательной адсорбции полиэлектролитов: поли-L-лизина и полистиролсульфоната натрия (1 мг/мл в 0,15 М NaCl).

После двухкратного формирования ПЭК проводили адсорбцию положительно заряженного поли-L-лизина, на который адсорбируют нанокристаллы, модифицированные полистиролсульфонатом натрия при участии тетраметиламмоний гидроксида. Адсорбция ПЭК и нанокристаллов, как одного, так и разных диаметров, может быть проведены два и более раз. Последним наносился слой бычьего сывороточного альбумина (БСА), который является направляющим модулем и определяет рН-чувствительные свойства полученных микросфер, а также позволяет использовать эти микросферы для селективного определения ионов меди.

Изобретение решает задачу получения коллоидно устойчивых микросфер с заданными свойствами на основе акролеина и стирола, получаемых безэмульгаторной радикальной полимеризацией в присутствии вещественного инициатора персульфата калия (K₂S₂O₈). Это позволяет, изменяя соотношение мономеров акролеин/стирол в процессе синтеза, получать полимерные частицы различного диаметра (0.15-0.8 мкм), с различным содержанием функциональных групп (альдегидных) и, соответственно, различным гидрофильно-липофильным балансом и различным зарядом поверхности, что даст возможность использовать в качестве первого слоя сильные (например, полидиаллилдиметиламмоний хлорид, т.д.) и слабые (полизин, полиэтилеиимин, т.д.) полиэлектролиты без потери полимерными частицами коллоидной стабильности (это важно).

Кроме того, в эти исходные частицы можно вводить визуализирующие метки, магнетит, метки на основе комплексов с ионами редкоземельных металлов, что позволит получить гибридные частицы (например, флуоресцентно-магнитные). Порядок введения может быть различным в зависимости от задач.

В качестве внешнего слоя можно использовать полиэлектролиты, содержащие карбоксильную группу, например полиакриловую кислоту, Na-соль сополимера акриловой и малеиновой кислот, т.д. Применяя карбодиимидную активацию карбоксильной группы, можно получить конъюгаты описанных выше частиц с направляющими модулями (белками, антителами, ферментами) и использовать их в различных видах биоанализа.

Техническими результатами изобретения является способ получения коллоидно-устойчивых микросфер на основе акролеина и стирола, содержащих на поверхности полиэлектролитные комплексы (ПЭК), которые повышают коллоидную устойчивость микросфер и позволяют вводить агенты для визуализации и направленной доставки микросфер.

Способ осуществляют следующим образом. Полимерные микросферы получают безэмульгаторной радикальной сополимеризацией акролеина и стирола при объемном соотношении мономер-вода, равном 1:9, в присутствии инициатора персульфата калия при перемешивании в атмосфере инертного газа при температуре 65°C в течение 8 часов. Синтез проводят при мольном соотношении мономеров акролеинхтирол от 0.25:1 до 10:1. Выход полимера составляет порядка 75%, диаметры получаемых частиц от 100 до 600 нм. Полученные суспензии являются коллоидно-устойчивыми в 0.1М растворе электролита NaCl. Затем микросферы на основе сополимера акролеина со стиролом последовательно обрабатывают положительно заряженным полиэлектролитом, а затем отрицательно заряженным полиэлектролитом, что приводит к формированию ПЭК на поверхности частиц, и после двукратного повторения процедуры последовательного осаждения ПЭК, вводят агенты, обеспечивающие визуализацию и направленность доставки микросистем (органические красители, полупроводниковые нанокристаллы, соли редкоземельных металлов, магнитные наночастицы), в один или более слоев ПЭК, регулируя свойства поверхности микросфер с помощью ПЭК внешнего слоя. Агенты могут включать полупроводниковые нанокристаллы, такие как селенид кадмия, селенид кадмия/сульфид цинка, теллурид кадмия, или органические красители из класса флуоресцеина, или комплексы редкоземельных металлов, такие как иттрий фосфаты европия, эрбия, тербия; п-сульфонатотиакаликс[4]арены европия, тербия, гадолиния; фенантролин европия, или магнитные наночастицы, такие как оксид железа (II), оксид железа (III), оксид кобальта (II).

Изобретение иллюстрируется следующими примерами:

Пример 1. В термостатированную колбу, снабженную механической мешалкой и вводом для инертного газа, помещают 5,8 мл свежеперегнанного акролеина, 1 мл стирола (мольное соотношение мономеров 10:1), 61,2 мл дистиллированной воды с растворенным инициатором персульфатом калия (0,1% в расчете на мономеры). Смесь перемешивают в атмосфере инертного газа при температуре 65°C в течение 8 часов. Выход полимера составляет порядка 75%. Получают белую дисперсию частиц на основе сополимера акролеина и стирола со средним диаметром 198±9,7 нм. Полученную дисперсию трижды промывают дистиллированной водой от непрореагировавших компонентов центрифугированием при 8000 об/мин в течение 10 мин. Для получения ПЭ комплекса отмытый осадок редиспергируют в воде до 0,1% концентрации. 0,2 мл полученной дисперсии осаждают центрифугированием и добавляют 0,2 мл Na-боратного буфера рН 8.2 и 0,1 мл положительно заряженного ПЭ поли-L-лизина (0,1%, Мм 120000) в Na-боратного буфере рН 8.2. Выдерживают при комнатной температуре при перемешивании в течение 15 мин, затем трижды промывают центрифугированием. К отмытому осадку добавляют 0,2 мл Na-боратного буфера рН 8.2 и 0,1 мл отрицательно заряженного ПЭ полистиролсульфонат натрия (0,1%, Мм 70000) в Na-боратного буфере рН 8.2. Выдерживают при комнатной температуре при перемешивании в течение 15 мин, затем трижды промывают центрифугированием. Затем дважды повторяют процедуру получения ПЭ комплекса и добавляют поли-L-лизина (0,1%) в Na-боратном буфере рН 8.2, выдерживают при комнатной температуре при перемешивании в течение 15 мин, затем трижды промывают центрифугированием. Добавляют 0,1 мл отрицательно заряженного модифицированного агента в 0,1 М Na-боратном буфере рН 8,2, стабилизированном полистиролсульфонатом натрия (0,1%). Выдерживают при комнатной температуре при перемешивании в течение 30 мин, затем трижды промывают центрифугированием. Формируют ПЭ комплекс поли-L-лизииа (0,1 мл, 0,1%) и полиакриловой кислоты (0,1 мл, 0,1%).

Пример 2. Процесс проводят аналогично описанному в примере 1, для синтеза берут 2,5 мл акролеина, 4,3 мл стирола (мольное соотношение 1:1). Выход полимера составляет порядка 85%. Получают белую дисперсию частиц на основе сополимера акролеина и стирола со средним диаметром 500±20 нм.

Пример 3. Процесс проводят аналогично описанному в примере 1, для синтеза берут 1,3 мл акролеина, 5,5 мл стирола (мольное соотношение 0,5:1). Выход полимера составляет порядка 81%. Получают белую дисперсию частиц на основе сополимера акролеина и стирола со средним диаметром 800±35 нм.

Пример 4. Процесс проводят аналогично описанному в примере 1, для синтеза берут 2,9 мл акролеина, 3,9 мл стирола (мольное соотношение 5:1). Выход полимера составляет порядка 78%. Получают белую дисперсию частиц на основе сополимера акролеина и стирола со средним диаметром 300±15 нм.

Пример 5. Процесс проводят аналогично описанному в примере 1, для синтеза берут 6,35 мл акролеина, 0,45 мл стирола (мольное соотношение 15:1). Выход полимера составляет порядка 65%. Получают белую дисперсию частиц на основе сополимера акролеина и стирола со средним диаметром 120±7 нм.