Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ГЕСТАЦИОННОГО ПИЕЛОНЕФРИТА

Изобретение относится к области медицины, а именно к экспериментальному акушерству и нефрологии, и может быть использовано при моделировании гестационного пиелонефрита.

Гестационный пиелонефрит (ГП) - одно из самых распространенных заболеваний почек у беременных женщин, частота встречаемости данной патологии в акушерской практике составляет от 5 до 10% (Степин И.И., Тютюнник В.П. Гестационный пиелонефрит: особенности течения и основные принципы лечения // Русский медицинский журнал. - 2005. - №17. - С.10). ГП - это неспецифический воспалительный процесс, в который вовлекаются интерстициальная ткань почек и чашечно-лоханочная система (Серов В.Н., Тютюнник В.Л. Гестационный пиелонефрит: Диагностика, профилактика, лечение // Русский медицинский журнал. - 2008. - №1. - С.153). Возникновению ГП способствуют гормональные изменения, свойственные беременности, сдавление мочеточников растущей маткой, наличие очагов инфекции в организме. Под влиянием прогестерона, продуцируемого плацентой, наблюдается расслабление гладкой мускулатуры кишечника, мочевого пузыря и мочеточников. При этом отмечается склонность к запорам и значительное замедление пассажа мочи из-за расширения, удлинения, искривления мочеточников с перегибами и петлеобразованием, увеличения полости лоханок. Нарушается уродинамика верхних мочевыводящих путей и кровообращение в почках. В этих условиях создается благоприятный фон для распространения инфекции гематогенным путем, а также восходящим путем из уретры, мочевого пузыря по субэпителиальному слою ткани в почечные лоханки. В то же время дизурия, нарушение функции мочевого пузыря, увеличение его объема в результате снижения тонуса, ухудшает эвакуацию мочи из верхних отделов мочевых путей, что способствует ее задержке и развитию воспаления в почках.

ГП оказывает неблагоприятное влияние на течение беременности и состояние плода, проявляющееся в значительной частоте угрозы прерывания беременности, преждевременных родов, плацентарной недостаточности, гипоксии плода, его внутриутробного инфицирования, гестоза и осложненного течения периода адаптации у новорожденного (Schaeffer A.J., Rajan N., Cao Q., et al. Host pathogenesis in urinary tract infections. // Int. Int. J. Antimicrob. Agents. - 2001. - V.17. - P.245-251).

В настоящее время в роли сохранения беременности большое внимание уделяется прогестерону (Pr). Антагонистом действия Pr является кортизол (K), который конкурирует с Pr в регуляции гена кортикотропинрелизинггормона (КРГ) (Karalis K., Goodwin G., Majzoub J.A. Cortizol blockade of progesterone: a possible molecular mechanism involved in the initiation of human labor // Nat. Med. - 1996. - Vol.2. - P.556-560). Кортизол блокирует активность простагландиндегидрогеназы (PGDH) в плаценте и хорионе, усиливая секрецию простагландинов. Действие K на активность PGDH может быть устранено применением Pr, благодаря конкурентному действию последнего с рецепторами глюкокортикоидов (Patel F.A., Clifton V.L., Chwalisz K., Challis J.R. Steroid regulation of prostaglandin degydrogenase activity and expression in human term placenta andchoriodecidua in relation to labor // J. Clin. Endocrinal. Metab. - 1999. - Vol.84. - P.291-299; Challis J.R.G. Endocrine and paracrine regulation of birth at term and preterm // Endocrinal. Rev. - 2000. - Vol.21 (5). - Р.514-550). Кроме того, глюкокортикоиды стимулируют синтез кортикотропинрелизинггормона (КРГ), который образуется в синцитиотрофобласте (Jones S.А., Challis J.R.G. Steroid, corticotrophin-releasing hormone, ACTH and prostaglandin interactions in amnion and placenta of early pregnancy in man // J. Endocrinol. - 1990. - Vol.125. - P.153-159). He только стресс плода, но и матери сопровождается повышением КРГ, что приводит к риску развития патологии беременности (Hobel С.J., Dunkel-Schetter C.S., Roesch S.C. et al. Material plasma corticotropin-releasing hormone associated with stress at 20 weeks' gestation in pregnancies ending in preterm delivery // Am. J. Obstet. Gynecol. - 1999. - Vol.180. - P.257-263). Полагают, что в процессе беременности КРГ может действовать и как релаксант (Challis J.R.G. Endocrine and paracrine regulation of birth at term and preterm // Endocrinol. Rev. - 2000. - Vol.21 (5). - P.514-550). Это создает неблагоприятный преморбидный фон для развития микробно-воспалительного процесса в мочевыделительной системе вследствие транслокации патогенной флоры из различных биотопов. Вышеизложенные теоретические механизмы развития осложненного течения беременности на фоне расстройств глюкокортикоидной регуляции легли в основу экспериментальной модели гестационного пиелонефрита.

В основе решения проблемы развития ГП важное место занимает биологическое моделирование, при этом общность физиологических процессов регуляции половой системы у человека и крыс позволяет использовать данные, полученные на животных, для изучения механизмов развития репродуктивных нарушений (В.Н. Серов, А.А. Кожин, В.П. Прилепская. Клинико-физиологические основы гинекологической эндокринологии. - Ростов-на-Дону: изд-во «Эверест», 1998 г. - С.94). Несмотря на наличие множества современных исследований в области моделирования ГП, всем им присущ ряд недостатков, таких как недостаточное патогенетическое обоснование, отсутствие способов моделирования данной патологии, обладающих простотой выполнения. Таким образом, разработка новых высокоэффективных способов моделирования ГП является актуальной задачей современной медицины.

Проведенными исследованиями по научно-медицинской и патентной литературе найдены различные способы моделирования пиелонефрита.

Так, патентом РФ №2149463 (2000 г., БИПМ №14) защищен "Способ моделирования пиелонефрита", включающий введение в почечную ткань лабораторного животного - белой крысы, липополисахарида Клебсиеллы (ЛПС) в дозе 1,75 мкг (0,1 мл). Через 24 ч внутривенно вводят разрешающую дозу ЛПС 17,5 мкг (1,0 мл) и взвесь штамма кишечной палочки, взятого от больного пиелонефритом. Недостатками данного способа являются: развитие септической патологии при использовании токсичных веществ; ограниченные функциональные возможности, способ включает в себя труднодоступные для практического использования методики, требует определенных хирургических навыков и не может быть применен для получения модели гестационного пиелонефрита.

В патенте РФ №2289852 (2006 г., БИПМ №35) описан "Способ моделирования пиелонефрита". Кроликам после нижнесрединной лапаротомии выделяют и перевязывают мочеточник в нижней трети, после чего проксимальнее места перевязки в мочеточник путем пункции вводят 1 мл культуры микроорганизмов Escherichia coli в титре ≥105, или Chlamydia trachomatis в титре ≥104, или Ureaplasma urealyticum в титре ≥104, или эти микроорганизмы в сочетании. При этом перевязывают мочеточник проксимальнее места пункции. Недостатками данного способа являются: данный способ трудновыполним в условиях эксперимента, требует определенных хирургических навыков и оперативного, инвазивного вмешательства, выполним в условиях соблюдения стерильных условий, имеет технические сложности в необходимости выращивания культуры микроорганизмов Escherichia coli, возможно развитие септической патологии при использовании культуры микроорганизмов Escherichia coli. Вышеперечисленные недостатки создают сложность использования данного способа для моделирования гестационного пиелонефрита.

Наиболее близким техническим решением, принятым нами за прототип, является защищенный патентом РФ на изобретение №2202834 "Способ моделирования гестационного пиелонефрита на фоне инфекционного воспалительного процесса мочевыводящих путей" (2003 г., БИПМ №11), предусматривающий выполнение воздействия на подопытное животное - беременную крысу. Способ осуществляют путем трехразового введения взвеси микроорганизмов Escherichia coli штамма O6 в мочевой пузырь беременной крысы. Недостатками прототипа являются техническая сложность выполнения, а также возможность развития септического шока во время беременности, поскольку данные штаммы обладают высокой токсичностью.

Задачей предложенного нами изобретения является разработка простого способа моделирования гестационного пиелонефрита на фоне нарушения глюкокортикоидной регуляции, что позволит уточнить патогенетические механизмы гестационного пиелонефрита, протекающего при патологическом течении беременности.

Техническим результатом, объективно проявляющимся при осуществлении предлагаемого способа моделирования, является упрощение способа, исключение септического шока, инфицирования и травматизации животных.

Технический результат достигается выполнением воздействия на экспериментальное животное. В качестве экспериментального животного используют беременную самку крыс линии Vistar в возрасте 5 месяцев весом 250 г. Экспериментальное животное, начиная с 3-го и по 11-й день беременности, в 8 часов утра кормят смесью, содержащей 0,55 мг порошка синтетического глюкокортикоидного препарата «Преднизолон» и 10 г манной крупы.

Препарат «Преднизолон», регистрационный номер ЛС-001000, международное непатентованное название: преднизолон. Лекарственная форма: таблетки, содержащие 5 мг активного вещества преднизолона. Фармакотерапевтическая группа: глюкокортикостероидное средство. Преднизолон - синтетический глюкокортикостероидный препарат, дегидрированный аналог гидрокортизона.

Оказывает противовоспалительное, противоаллергическое, иммунодепрессивное действие, повышает чувствительность бета-адренорецепторов к эндогенным катехоламинам.

Подавляет высвобождение гипофизом адренокортикотропного гормона (АКТГ) и вторично - синтез эндогенных глюкокортикостероидов.

Подробное описание способа.

В качестве экспериментального животного используют беременную самку крыс линии Vistar в возрасте 5 месяцев, весом 250-300 г. Животное помещают в клетку во время всего эксперимента. Пищевой рацион представлен специализированным кормом для грызунов типа «Karma», производство Польши. В первые два дня беременности крысу кормят специализированным кормом в 8, 12, 16 и 20 часов. Начиная с 3-го и по 11 день беременности, крысу в 8 часов утра кормят смесью, содержащей 0,55 мг порошка синтетического глюкокортикоидного препарата «Преднизолон» и 10 г манной крупы. В 12, 16 и 20 часов крысу кормят специализированным кормом для грызунов типа «Karma». Смесь получают следующим образом: одну таблетку преднизолона, содержащую 5 мг активного вещества Преднизолон, растирают и получают порошок. Дозу 0,55 мг порошка синтетического глюкокортикоидного препарата «Преднизолон» отмеряют путем взвешивания порошка преднизолона на аналитических весах. Затем 0,55 мг порошка синтетического глюкокортикоидного препарата «Преднизолон» тщательно перемешивают с 10 г манной крупы. С 12 по 21 день беременности и в 8 часов утра животное кормят специализированным кормом для грызунов типа «Karma».

По данным литературы (Серая крыса: Систематика, экология, регуляция численности / Под ред. В.Е. Соколова, Е.В. Карасевой. - М.: Наука, 1990. - 456 с.), беременность у крыс длится 20-24 дня. На 21 день беременности проводят забой крысы. Перед забоем животное анестезируют путем внутрибрюшинного введения 0,2 мл нембутала. Применявшиеся в эксперименте методы обезболивания и умерщвления животных строго соответствуют принципам Хельсинкской декларации о гуманном отношении к животным. Проводят забор почек крысы для изучения морфологических изменений. Почки очищают от жировой клетчатки и помещают в 4% раствор формальдегида. Затем делают гистологические препараты с окраской гематоксилин-эозином. Наличие в гистологическом препарате ткани почки выраженной дистрофии тубулярного нефротелия с участками паранекроза и некробиоза, полиморфноклеточной лейкоцитарной инфильтрации интерстиция, клубочков с неравномерной пролиферацией мезангиальных клеток и фокусами коагуляционного некроза, выраженного перегламерулярного отека, эктазии сосудов со склерозом и гиалинозом стенок, свидетельствует о развитии гестационного пиелонефрита у экспериментального животного.

Реализуемость предложенного способа иллюстрируется следующим примером.

Пример: экспериментальное животное - беременную самку крыс линии Vistar в возрасте 5 месяцев весом 258 г поместили в клетку. Первые два дня беременности крысу кормили специализированным кормом для грызунов типа «Karma», производство Польши. С 3-го по 11 день беременности в 8 часов утра крысу кормили смесью, содержащей 0,55 мг порошка синтетического глюкокортикоидного препарата «Преднизолон» и 10 г манной крупы. В 12, 16 и 20 часов крысу кормили специализированным кормом для грызунов типа «Karma». С 12 по 21 день беременности и в 8 часов утра животное кормили специализированным кормом для грызунов типа «Karma». В процессе проведения эксперимента не было зарегистрировано развитие септического шока и инфицирования подопытного животного. На 21 день беременности провели забой крысы, предварительно введя внутрибрюшинно 0,2 мл нембутала. Применявшиеся в эксперименте методы обезболивания и умерщвления животного строго соответствовали принципам Хельсинкской декларации о гуманном отношении к животным. Произвели забор почек крысы для изучения морфологических изменений. Почки очистили от жировой клетчатки и поместили в 4% раствор формальдегида. Затем сделали гистологические препараты с окраской гематоксилин-эозином. При исследовании были выявлены следующие морфологические признаки: выраженная дистрофия тубулярного нефротелия с участками паранекроза и некробиоза, полиморфноклеточная лейкоцитарная инфильтрация интерстиция, клубочки с неравномерной пролиферацией мезангиальных клеток и фокусами коагуляционного некроза, выраженный перегламерулярный отек, эктазия сосудов со склерозом и гиалинозом стенок, которые подтвердили наличие у экспериментального животного гестационного пиелонефрита.

Предлагаемый способ был апробирован на кафедре патологической физиологии Ростовского государственного медицинского университета. Был проведен эксперимент на 30 беременных самках крыс линии Vistar в возрасте 5 месяцев весом 250-300 г. Все крысы были разделены на 2 группы: основную группу составили 20 крыс, контрольную группу - 10 крыс.

Животные контрольной группы были помещены в клетки. С 1-го по 21 день беременности в 8, 12, 16 и 20 часов их кормили специализированным кормом для грызунов типа «Karma», производство Польши.

Каждое животное основной группы было помещено в отдельную клетку. С 1 по 2 день беременности включительно животных кормили аналогично с контрольной группой. Начиная с 3-го и по 11 день беременности, каждую из них кормили в 8 часов утра смесью, содержащей 0,55 мг порошка синтетического глюкокортикоидного препарата «Преднизолон» и 10 г манной крупы. В 12, 16 и 20 часов их кормили специализированным кормом для грызунов типа «Karma». С 12 по 21 день беременности и в 8 часов утра всех животных основной группы кормили специализированным кормом для грызунов типа «Karma». В процессе проведения эксперимента не было зарегистрировано ни одного случая развития септического шока и инфицирования экспериментальных животных основной группы. На 21 день беременности провели забой всех крыс обеих групп. Перед забоем все животные были анестезированы путем внутрибрюшинного введения каждой крысе 0,2 мл нембутала. Применявшиеся в эксперименте методы обезболивания и умерщвления животных строго соответствовали принципам Хельсинкской декларации о гуманном отношении к животным. Провели забор почек у всех крыс для изучения морфологических изменений. Почки очистили от жировой клетчатки и поместили в 4% раствор формальдегида. Затем из каждой почки сделали гистологические препараты с окраской гематоксилин-эозином.

Проведенное гистологическое исследование в контрольной группе у всех 10 крыс показало: почки имеют обычное строение; извитые канальцы не изменены, с нормальным эпителиальным покровом, клубочки обычного строения, без патологических изменений. Данную морфологическую и гистологическую картину можно рассматривать как норму.

В основной группе у всех 20 (100%) крыс при гистологическом исследовании были выявлены следующие морфологические признаки: выраженная дистрофия тубулярного нефротелия с участками паранекроза и некробиоза, полиморфноклеточная лейкоцитарная инфильтрация интерстиция, клубочки с неравномерной пролиферацией мезангиальных клеток и фокусами коагуляционного некроза, выраженный перегламерулярный отек, эктазия сосудов со склерозом и гиалинозом стенок, которые подтвердили наличие гестационного пиелонефрита у всех крыс основной группы.

На фиг.1 представлена микрофотография гистологического препарата почки одной из крыс контрольной группы, где позиция 1 - извитые канальцы, позиция 2 - клубочки. Как видно из фиг.1, извитые канальцы 1 не изменены и имеют нормальный эпителиальный покров; клубочки 2 имеют обычное строение, патологические изменения отсутствуют, что подтверждает отсутствие гестационного пиелонефрита у крыс контрольной группы.

На фиг.2 отображена микрофотография гистологического препарата почки одной из крыс основной группы, где позиция 1 - извитые канальцы, позиция 2 - клубочки, позиция 3 - интерстиций. Как видно из фиг.2, извитые канальцы 1 имеют выраженную дистрофию тубулярного нефротелия; клубочки 2 имеют «лапчатую» структуру с неравномерной пролиферацией мезангиальных клеток; интерстиций 3 имеет полиморфноклеточную лейкоцитарную инфильтрацию, что подтверждает наличие гестационного пиелонефрита у крыс основной группы.

Таким образом, предлагаемый способ прост в реализации, достоверно позволяет моделировать гестационный пиелонефрит, исключить инфицирование и травматизацию животных.