СРЕДСТВО ПРОТИВ ПЕРЕДАЧИ ВИЧ/СПИД ПОЛОВЫМ ПУТЕМ

Изобретение относится к медицине, а именно к вирусологии, иммунологии, гинекологии, фармакологии и биотехнологии, и может быть использовано при создании вагинальных и ректальных микробицидов - препаратов местного применения, предотвращающих передачу возбудителя СПИДа (вируса иммунодефицита человека, ВИЧ) половым путем.

СПИД представляет собой заболевание со 100%-ной летальностью, существующая терапия не приводит к удалению вируса из организма и излечению, а потому требует пожизненного применения, токсична, приводит к селекции резистентных к лечению форм вируса. Характерной особенностью ВИЧ-инфекции/СПИДа, важной для социальных, экономических и демографических последствий, является то, что, в отличие от рака и сердечно-сосудистых заболеваний, ВИЧ-инфекция поражает, главным образом, молодое трудоспособное сексуально активное население.

Половой путь является основным путем передачи ВИЧ-инфекции [Доклад ЮНЭЙДС, 2010. Доклад ЮНЭЙДС о глобальной эпидемии СПИДа, 2010, UNAIDS Report on the global AIDS epidemic-2010, www/unaids.org/ru]. На половые контакты в мире приходится более 80% новых ВИЧ-инфекций [Доклад ЮНЭЙДС о глобальной эпидемии СПИДа, 2010, UNAIDS Report on the global AIDS epidemic-2010, www/unaids.org/ru]. В связи с этим среди комплекса мер по противодействию эпидемии ВИЧ-инфекции/СПИДа важнейшими являются профилактические меры, направленные на пресечение полового пути передачи. К этим мерам относятся разработка и использование микробицидов - средств местного применения для предотвращения передачи ВИЧ-инфекции половым путем.

Известны неспецифические микробициды, включающие субстанции, действующие как спермициды или поверхностные дезинфектанаты, такие, как Nonoxynol-9 (N-9), octoxynol-9, benzalkonium chloride, menfegol [WHO/CONRAD Technical Consultation on Nonoxynol-9, WHO, Geneva, 9-10 - October 2001, Summary Report.WHO/CONRAD, 2001]. Однако клинические испытания ноноксинола показали, что он не способен препятствовать трансмиссии ВИЧ, поскольку ноноксинол вызывает физические повреждения влагалищного эпителия [Phillips D.M., et al, 2000 Phillips D.M., Taylor C.L., Zacharopoulos V.R., Maguire R.A. Nonoxinol-9 causes rapid exfoliation of sheets of rectal epithelium. Contraception, 2000 Sep; 62(3): 149-54]. Это привело к более частому заражению ВИЧ в группе женщин, применяющих N-9, по сравнению с контрольной группой [WHO/CONRAD 2001, Summary Report WHO/CONRAD Technical Consultation on Nonoxynol-9, WHO, Geneva, 9-10 - October 2001, Summary Report. WHO/CONRAD, 2001].

Известны экспериментальные микробициды на основе специфических антиретровирусных препаратов, например, аналога аденозинмонофосфата, Тенофовира. Обычно такие препараты применяются перорально в ходе специфической высокоактивной антиретровирусной терапии (ВААРТ). Клинические исследования Тенофовира (CAPRISA-004, фаза IIb) показали, что вагинальный микробицид в форме 1%-ного Тенофовира (TDF) оказался способен на 39% снизить число случаев заражения в группе из 889 женщин из ЮАР, входящих в группу высокого риска инфицирования [Abdool Karim Q. et al., 2010 Abdool Karim Q, Abdool Karim SS, Frohlich JA, Grobler AC, Baxter C, Mansoor LE, Kharsany AB, Sibeko S, Mlisana KP, Omar Z, Gengiah TN, Maarschalk S, Arulappan N, Mlotshwa M, Morris L, Taylor D; CAPRISA 004 Trial Group. Effectiveness and Safety of Tenofovir Gel, an Antiretroviral Microbicide, for the Prevention of HIV Infection in Women // Science. 2010; 329(5996): 1168-1174. doi:10.1126/science.1193748]. Однако в процессе проведения других клинических испытаниях подобного препарата - VOICE - часть исследований, в которых проводились испытания 1%-ного геля Тенофовира - была досрочно прекращена, поскольку не была обнаружена разница по числу новых случаев заражения по сравнению с группой плацебо [http://data.avac.org/TrialDetailReport.aspx?TrialID=141]. Потенциальной опасностью использования микробицидов на основе специфических антиретровирусных препаратов является возможность образования лекарственно устойчивых форм вируса.

В патенте US 2004/0137085 A1 [US Patent, МПК А61К 35/78, U.S. Cl. 424/725, опубл. 15 июля 2004 г.] предложено применение природных коммерчески доступных препаратов гуминовой кислоты, выделенных из почвы, для лечения ВИЧ-инфекции благодаря показанному автором анти-ВИЧ-действию in vitro, действию, направленному против образования синцитиев и/или иммуностимулирующему действию препарата. В последнем случае показано усиление под действием препарата синтеза интерлейкина-2 (IL-2) лимфоцитами периферической крови человека, стимулированными in vitro растительными лектинами (фитогемагглютинином или конканавалином А). Обсуждается метод подавления ВИЧ-инфекции при контакте лейкоцитов ВИЧ-инфицированного человека с препаратом гуминовой кислоты, метод иммуностимуляции IL-2, метод усиления иммунного ответа на вакцинацию с использованием гуминовой кислоты в качестве адъюванта при вакцинации пациента с ВИЧ-инфекцией или СПИДом или пациента со сниженной функцией иммунной системы. В качестве предпочтительного способа введения обсуждается внутривенное введение препарата, хотя не исключаются и другие методы, например, пероральный, вагинальный и ректальный и внутримышечный. Однако использование препаратов гуминовой кислоты в качестве активной субстанции микробицида в виде суппозитория не рассматривается.

Наиболее близким к настоящему изобретению является документ ЕА 11298 от 27.02.2009, где раскрыто лекарственное микробицидное средство против передачи или заражения ВИЧ, которые происходят через половую связь при интимном контакте партнеров, которое может быть выполнено в виде суппозитория, и содержит фармакологически активное вещество (4-[[4-[(2,4,6-триметилфенил)амино]-2-пиримидинил]амино]бензонитрила) и фармацевтически приемлемый носитель. Способ профилактики заражения ВИЧ заключается во введении указанного средства интравагинально за 15-20 мин до полового контакта. Однако используемое в этом патенте средство включает синтетическое фармакологически активное вещество, которое наряду с микробицидным действием может вызывать нежелательные побочные эффекты. Активная субстанция является ненуклеозидным ингибитором обратной транскриптазы, представляет собой лекарственное средство для специфической антиретровирусной терапии, при применении такого препарата для профилактики (как и для терапии) существует значительный риск образования лекарственно устойчивых форм вируса, причем возникновение резистентности является неизбежным следствием монотерапии.

Таким образом, технический результат, получаемый при реализации настоящего изобретения, состоит в создании безопасного микробицида с анти-ВИЧ-активностью - средства против передачи ВИЧ/СПИД половым путем на основе веществ, выделенных из природных источников.

Для решения поставленной задачи создания анти-ВИЧ-микробицида используются суппозитории, активной субстанцией которых является средство с анти-ВИЧ-активностью - фракция гуминовых кислот, выделенных из окисленного бурого угля.

Указанный технический результат достигается тем, что микробицид содержит в качестве активной субстанции с анти-ВИЧ-активностью фракцию гуминовых кислот, выделенных из окисленного бурого угля, и фармакологически приемлемую основу, а в качестве основы содержит масло какао или кондитерский жир и эмульгатор. Еще одним из аспектов изобретения является способ профилактики ВИЧ-инфекции путем введения суппозитория, отличающийся тем, что суппозиторий, содержащий гуминовое вещество с анти-ВИЧ-активностью, вводят интравагинально за 30 мин до полового контакта. Изобретение иллюстрируется следующим примером.

Фракцию гуминовых кислот выделяют из высоко окисленного бурого угля путем добавления раствора гидроксида натрия и с последующим прогреванием на кипящей водяной бане. После охлаждения содержимое центрифугируют, раствор декантируют, нерастворившийся остаток промывают раствором гидроксида натрия и вновь центрифугируют, собирая основной экстракт и промывные воды в один приемник. К полученному раствору добавляют раствор концентрированной соляной кислоты до pH 2 для осаждения гуминовых кислот. Образовавшийся осадок гуминовых кислот отделяют центрифугированием и обессоливают с помощью диализа. Полученный препарат гуминовых кислот высушивают при 80°C в сушильном шкафу.

Готовят раствор сухого препарата в воде с концентрацией 10 мг/мл, стерилизуют фильтрацией через фильтр 0,25 mµ, готовят разведения и используют для определения цитотоксичности и анти-ВИЧ-активности.

Оценку цитотоксичности и анти-ВИЧ-активности проводят в культуре in vitro. Цитотоксические свойства препаратов определяют колориметрическим методом MTT по Mossman и по результатам окрашивания трипановым синим.

Анти-ВИЧ-активность препарата определяют по ингибированию развития инфекции в клетках, зараженных ВИЧ. Клетки человека, чувствительные к ВИЧ, инкубируют in vitro с различными концентрациями препарата (фракции гуминовых кислот), а затем заражают вирусом. Уровень ингибирования инфекции в опытных образцах по отношению к контролю инфекции (без препарата) определяют с помощью p24 ИФА (иммуноферментного анализа для определения содержания основного белка вириона ВИЧ1 - маркера ВИЧ-инфекции капсидного белка р24).

Ниже представлены примеры реализации описываемого изобретения, где в примере 1 показан способ получения фракции гуминовых кислот, в примерах 2-6 показаны результаты определения цитотоксических свойств и анти-ВИЧ-активности, а в примере 7 описано приготовление суппозиториев, содержащих препарат фракции гуминовых кислот.

Здесь и далее препарат обозначен как HAC-1 (от humic acid coal).

Примеры конкретного осуществления изобретения

Пример 1. Выделение фракции гуминовых кислот (НАС-1) из высоко окисленного бурого угля

Навеску угля (2-5 г) помещают в коническую колбу вместимостью 250 мл, приливают 100 мл 1%-го раствора гидроксида натрия и нагревают в течение 2 часов на кипящей водяной бане (при температуре 80°C). После охлаждения содержимое колбы центрифугируют, раствор декантируют, нерастворившийся остаток промывают один - два раза 100 мл 1%-ого раствора гидроксида натрия и вновь центрифугируют, собирая основной экстракт и промывные воды в один приемник. К полученному раствору добавляют раствор концентрированной соляной кислоты до pH 2 для осаждения гуминовых кислот. Образовавшийся осадок гуминовых кислот отделяют центрифугированием и обессоливают с помощью диализа. Полученный препарат гуминовых кислот высушивают при 80°C в сушильном шкафу.

Пример 2. Определение цитотоксичности препарата НАС-1

Цитотоксическое действие препарата оценивают, сравнивая жизнеспособность клеток в присутствии различных доз препарата с жизнеспособностью клеток без препарата. Клетки вносят в стерильный 96-луночный планшет в концентрации 450×10³ и культивируют в присутствии различных доз соединений в течение 3-4 дней. Для каждой концентрации выполняют три параллельных определения (3 лунки). По истечении указанных сроков определяют жизнеспособность клеток колориметрическим методом МТТ по T. Mossmann [Mosmann, Т. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays// J. Immunol. Methods - 1983. - 65:55-63] и по результатам окрашивания трипановым синим.

Определение цитотоксических свойств препаратов колориметрическим методом МТТ

Суть метода МТТ заключается в способности живых клеток превращать хорошо растворимый желтый бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия (МТТ) в нерастворимые внутриклеточные кристаллы МТТ-формазана. Эффективность такого превращения отражает общий уровень дегидрогеназной активности исследуемых клеток и в известных пределах пропорциональна концентрации живых (но не мертвых) клеток.

В лунки 96-луночного планшета с исследуемым материалом вносят 20 мкл раствора МТТ (с концентрацией 11 мг/мл в ФСБ) и помещают на 3 часа в термостат при 37°C, 5% CO₂. Из лунок отбирают 175 мкл супернатанта, вносят по 175 мкл DMSO (для растворения кристаллов МТТ-формазана) и помещают на 20-30 мин в термостат при 37°C, 5% CO₂. После растворения кристаллов измеряют оптическую плотность при 630 нм (ОП₆₃₀, OD₆₃₀) на спектрофотометре-ридере ImmunoChem-2100 Microplate Reader (США).

За 100% принимают оптическую плотность в МТТ-тесте, установленную для контрольных клеток (без препарата), и определяют жизнеспособность клеток, культивировавшихся в присутствии различных доз препаратов по формуле 1:

Формула 1

,

где ОП₆₃₀ образец - среднее значение для трех параллельных определений (лунок) с данной концентрацией анализируемого препарата, а

ОП₆₃₀ контроль - среднее значение для параллельных определений (лунок) без анализируемого препарата (не менее трех параллельных определений).

Рассчитывают 50%-ную токсическую дозу препарата. 50%-ная цитотоксическая доза (TD₅₀) - доза, при которой 50% исследуемых клеток сохраняют жизнеспособность.

Определение жизнеспособности клеток по окрашиванию трипановым синим

Исследуемые растворы потенциальных активных субстанций микробицидов могут быть окрашены. Эта окрашенность может исказить результаты колориметрического теста МТТ. В связи с этим жизнеспособность клеток при наиболее высокой (1000 мкг/мл) концентрации веществ дополнительно определяют путем подсчета живых и мертвых клеток в камере Горяева после окрашивания 0.2% раствором трипанового синего. Раствор трипанового синего 0,4% смешивают в лунке 96-ти луночного планшета с равным объемом клеточной суспензии и 10 мкл смеси с помощью микропипетки вносят в камеру Горяева. Трипановый синий проникает в мертвые клетки, окрашивая их в голубой цвет. Соотношение живых и мертвых клеток при подсчете 100 единиц определяет жизнеспособность клеток в процентах.

Пример 3. Определение цитотоксичности препарата НАС-1 для клеток СЕМ SS

Клетки CEM SS представляют собой перевиваемую суспензионную Т-лимфобластоидную линию клеток человека. Клетки вносят в стерильный 96-луночный планшет в концентрации 300-500 тысяч и культивируют в присутствии различных доз препарата в течение 3 дней. По истечении этого срока определяют жизнеспособность клеток методом МТТ, как указано в примере 2. Результаты показаны в таблицах 1 и 2.

Таким образом, препарат фракции гуминовых кислот НАС-1, являющийся предметом данного изобретения, характеризуется низкой цитотоксичностью: жизнеспособность культивируемых клеток СЕМ SS снижается менее чем на 5%.

Пример 4. Определение цитотоксичности препарата НАС-1 для мононуклеаров периферической крови человека (МПК)

Мононуклеары выделяют из венозной крови человека путем центрифугирования в одноступенчатом градиенте плотности фиколл d=1.077 по обычной методике [Boyum А. Separation of leucocytes from blood and bone marrow. //Scand. J. Clin, and Lab. Invest. - 1968. - Vol.21, Suppl. 97 - P.77-821]. Вакутайнеры с антикоагулянтом (ЭДТА), содержащие 10 мл донорской крови, центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин. После отделения плазмы клетки стерильно собирают в 50 мл центрифужные пробирки и разводят 1:1 фосфатно-солевым буфером без Mg²⁺ и Ca²⁺ (ФСБ). Клетки наслаивают на фиколл и центрифугируют при 2000 об/мин в течение 30 мин при комнатной температуре. После центрифугирования на границе раздела фаз наблюдается кольцо лимфоцитов. Собранные МПК помещают в стерильную пробирку, разбавляют ФСБ, суспендируют и центрифугируют при 1000 об/мин при 4°C в течение 10 мин. Осадок клеток собирают и повторяют отмывку еще раз. Осадок клеток суспендируют в ростовой среде (полной питательной среде, в состав которой входит среда RPMI, дополненная 10% фетальной телячьей сывороткой, 2 mM L-глутамина, 20 mM HEPES-буфера pH 7,4 и 10 мкг/мл гентамицина). Выделенные лимфоциты в полной питательной среде помещают в 25-мл культуральные флаконы из расчета 1-2×10⁶ кл/мл, добавляют митогенный стимулятор фитогемагглютинин (ФГА) из расчета 5 мкг/мл и инкубируют 72 час при 37°C и 5% CO₂. Затем лимфоциты переводят в ростовую среду, содержащую 200 ед/мл интерлейкина-2 (ИЛ-2). Замену среды проводят каждые 3-4 дня.

Результаты определения цитотоксичности препарата НАС-1 для МПК человека приведены в таблицах 3 и 4.

Таким образом, препарат фракции гуминовых кислот НАС-1, являющийся предметом данного изобретения, характеризуется низкой цитотоксичностью: жизнеспособность МПК даже при самой высокой концентрации препарата снижается примерно на 5%.

В культуре МПК 50%-ная цитотоксическая доза препарата НАС-1 не была достигнута. Препарат нетоксичен для МПК даже при концентрациях 1000 мкг/мл.

Пример 5. Анти-ВИЧ-активность препарата НАС-1 на модели HIV-1_BRU/CEM SS

Модель представляет собой Т-лимфобластоидную линию CD4+ клеток СЕМ SS, в которых активно реплицируется референс-штамм ВИЧ HIV-1_BRU.

Клетки СЕМ SS в течение 2 часов инкубируют при 37°C с различными концентрациями НАС-1, а затем заражают вирусом HTV-1_BRU с множественностью заражения 100 TCID₅₀. Через 24 часа планшеты центрифугируют для удаления несвязавшегося вируса при 1200 об/мин 10 мин, и к клеткам добавляют свежую ростовую среду с соответствующими концентрациями НАС-1. Аналогичную процедуру проводят на вторые и третьи сутки. За развитием инфекции наблюдают визуально, оценивая цитопатическое действие.

На 6-7-е сутки отбирают пробы надосадочной жидкости и определяют уровень ингибирования инфекции в опытных образцах по отношению к контролю инфекции (без препарата) на основании данных р24 ИФА по формуле 2.

Формула 2

, где

ОП₄₅₀ опыт - оптическая плотность в ИФА в лунке с препаратом,

ОП₄₅₀ контроль инфекции - оптическая плотность в ИФА в лунке без добавления препарата

ОП₄₅₀ контроль клеток - оптическая плотность в ИФА в лунке без добавления вируса.

Постановку анализа р24 ИФА выполняют в соответствии с инструкцией производителя диагностических наборов. В каждую постановку включают положительный контроль (К+) из набора и две параллели отрицательного контроля (К-) из набора.

Результаты определения анти-ВИЧ-активности препарата НАС-1 на модели HIV-1_BRU/CEM SS приведены в таблице 5.

Как видно из таблицы 5, препарат НАС-1 в концентрации 10 мкг/мл подавляет ВИЧ-инфекцию в культуре in vitro на 96,9% и в концентрации 1 мкг/мл - на 95,6. В культуре СЕМ SS 50%-ная цитотоксическая доза препарата НАС-1 не была достигнута. Для него характерна низкая цитотоксичность. Препарат нетоксичен для клеток СЕМ SS при концентрации 1000 мкг/мл. Значение IS находится в пределах 2000 - 4000.

Таким образом, препарат фракции гуминовых кислот НАС-1, являющийся предметом данного изобретения, проявляет сильную анти-ВИЧ-активность при низкой цитотоксичности.

Пример 6. Анти-ВИЧ-активность препарата НАС-1 на модели первичный изолят ВИЧ1/МПК

МПК получают и стимулируют, как описано в примере 4. МПК, полученные от трех здоровых неинфицированных ВИЧ доноров, смешивают непосредственно перед заражением, инкубируют с различными концентрациями препарата и заражают клиническим изолятом с множественностью инфекции 100 TCID₅₀. Культивирование и определение ингибирования инфекции выполняют, как описано в примере 5. Результаты определения анти-ВИЧ-активности препарата НАС-1 на модели первичный изолят ВИЧ1/МПК приведены в табл.6.

Как видно из таблицы 6, препарат НАС-1 на модели первичный изолят ВИЧ1/МПК подавляет ВИЧ-инфекцию в культуре in vitro в концентрации 10 мкг/мл на 98% и при концентрации 1 мкг/мл на 95,6%. Значение индекса селективности (IS), который представляет собой отношение 50-процентной токсической дозы к 50-процентной эффективной дозе (TD₅₀/ED₅₀) и отражает терапевтическую ценность препарата, превышает 3000.

Таким образом, препарат фракции гуминовых кислот НАС-1, являющийся предметом данного изобретения, является малотоксичным и обладает высоким ингибирующим действием на ВИЧ-инфекцию.

Пример 7. Приготовление суппозиториев, содержащих препарат НАС-1

Суппозитории массой 1,3 г готовят на основе масла какао или твердого кондитерского жира с эмульгатором, которые легко высвобождают активную субстанцию при температуре тела человека. С учетом того, что доза активной субстанции (препарата НАС-1) 100 мкг/мл нетоксична и эффективна in vitro, эта доза может быть рекомендована для использования в составе суппозиториев.

Предыдущие описания и примеры приведены в качестве иллюстрации и не исчерпывают возможностей данного изобретения.