Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ПРИОБРЕТЕННОЙ ТОКСИЧЕСКОЙ ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ АНЕМИИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

Изобретение относится к экспериментальной медицине, патологической физиологии, гематологии.

С целью моделирования приобретенной токсической гемолитической анемии применяют различные химические агенты.

Традиционным является способ моделирования приобретенной токсической гемолитической анемии путем введения в организм экспериментального животного гемолитического яда - фенилгидразина, с использованием разных способов введения (Репина Е.Н., 2007; Иванкова Ж.Е., 2007; Улитко М.В., 2008; Жернов Ю.В., 2009). Недостатком фенилгидразиновых моделей является разная выраженность гемолитической анемии у животных разного возраста (Пахрова О.А., 2002).

В литературе есть данные о применении других веществ для моделирования приобретенной токсической гемолитической анемии. Модель, предлагаемая E1-Ashmawy I.M. et al., 2010, подразумевает введение экспериментальным животным азатиоприна (25 мг/кг массы тела) (E1-Ashmawy I.M. et al., 2010). Недостатком является очень высокая токсичность вводимого вещества, вследствие чего гемолиз эритроцитов сопровождается развитием полиорганной патологии на фоне токсического воздействия.

Bazzoni G.B. et al., 2005, в качестве токсического агента для моделирования токсической гемолитической анемии рекомендуют использование алюминия (Al III) - металла без какой-либо определенной биологической функции, тем не менее его накопление в организме может привести к токсическому воздействию. Недостатком модели является необходимость длительного (в течение трех месяцев) введения алюминия экспериментальным животным.

Прототипом является экспериментальная модель Moreira-Rodrigues M. et al., 2010, основанная на введении экспериментальным животным (крысам) сулемы (HgCl₂). Но эта модель, помимо формирования гемолитической анемии у экспериментальных животных, характеризуется системным аутоиммунным процессом, приводящим через 14-21 день к развитию грубой полиорганной патологии со стороны сердечно-сосудистой системы и почек (Moreira-Rodrigues M. et al., 2010), что не обеспечивает соответствия модели клиническому течению приобретенной гемолитической анемии.

Технический результат: повышение специфичности способа моделирования приобретенной токсической гемолитической анемии в эксперименте.

Указанная задача достигается путем однократного внутрибрюшинного введения нелинейным белым крысам 2-бутоксиэтанола (C₆H₁₄O₂) в эмпирически выбранной дозировке 20 мг/кг массы тела (в среднем 4 мг на животное).

2-Бутоксиэтанол (C₆H₁₄O₂) - широко используемый во многих отраслях промышленности реагент; к настоящему времени в условиях in vitro установлено, что метаболиты 2-бутоксиэтанола являются сильными гемолитическими ядами (Ghanayem B.I., Sullivan Ch.A., 2002). Однако способа экспериментального моделирования приобретенной токсической гемолитической анемии с использованием 2-бутоксиэтанола в зарубежной и отечественной литературе не найдено.

Способ осуществляют следующим образом. Лабораторному животному (нелинейной белой крысе) однократно под легким эфирным наркозом внутрибрюшинно вводят 2-бутоксиэтанол (C₆H₁₄O₂) в эмпирически выбранной дозировке 20 мг/кг массы тела животного (4 мг на животное). Рабочий раствор (0,4%) получают следующим способом: 180 мкл чистого 2-бутоксиэтанола (в 1 мл 1 г вещества) разводят 45 мл воды для инъекций. В результате 1 мл полученного рабочего раствора содержит 4 мг 2-бутоксиэтанола (дозировка на одно животное). Внутрибрюшинно вводят 1 мл рабочего раствора однократно.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. Крыса, самец, масса 210 г. Перед началом эксперимента проведен забор периферической крови из хвостовой вены - с целью анализа исходных показателей, а также 100 мкл крови дополнительно - для получения эритромассы с последующим замораживанием при температуре -18°C (для последующей постановки реакции агглютинации сывороткой животного аутологичных эритроцитов - по окончании эксперимента). После чего внутрибрюшинно под эфирным наркозом введено 4,0 мг 2-бутоксиэтанола (1 мл 0,4%-ного рабочего раствора). Спустя 10 суток наблюдения у животного взята кровь из хвостовой вены - с целью анализа показателей периферической крови. После забора крови животное выведено из эксперимента под эфирным наркозом с соблюдением правил эвтаназии. Проведен забор крови из полости сердца - для получения сыворотки. Проведен забор органов (печень, селезенка, почки) для гистологического исследования.

Показатели периферической крови до начала эксперимента: количество эритроцитов - 6,332·10⁹ в 1 мкл крови, концентрация гемоглобина - 124 г/л, количество ретикулоцитов - 1,378%, количество лейкоцитов - 6232 в 1 мкл крови, лимфоциты - 68%, абс. - 4237, нейтрофилы сегментоядерные - 23%, абс. - 1433, нейтрофилы палочкоядерные - 2%, абс. - 125, нейтрофилы юные - 0%, абс. - 0, моноциты - 3%, абс. - 187, эозинофилы - 4%, абс. - 250, базофилы - 0%, абс. - 0. Показатели периферической крови к концу эксперимента (10-е сутки после введения бутоксиэтанола): количество эритроцитов - 4,567·10⁹ в 1 мкл крови, концентрация гемоглобина - 86 г/л, количество ретикулоцитов - 4,2%, количество лейкоцитов - 4810, лимфоциты - 60, абс. - 2790, нейтрофилы сегментоядерные - 27%, абс. - 1299, нейтрофилы палочкоядерные - 4%, абс. - 192, нейтрофилы юные - 1%, абс. - 48, моноциты - 6%, абс. - 289, эозинофилы - 2%, абс. - 96, базофилы - 2%, абс. - 96.

То есть к концу эксперимента у экспериментального животного отмечалось уменьшение концентрации гемоглобина, количества эритроцитов, рост количества ретикулоцитов, что свидетельствует о развитии у животного гемолитической анемии; в лейкоцитарной формуле - уменьшение относительного и абсолютного количества лимфоцитов, увеличение суммарного количества (относительного и абсолютного) нейтрофилов, увеличение количества моноцитов.

Результаты реакции агглютинации сывороткой животного аутологичных эритроцитов: гемолиз, титр - разведение 1:64, log=6.

Результаты гистологического исследования: в селезенке животного выявлен гемосидероз красной пульпы, что является типичным проявлением гемолитической анемии. В ткани почек патологических изменений не обнаружено. В печени животного выявлены ограниченные участки зернистой и жировой дистрофии гепатоцитов.

Таким образом, у экспериментального животного, которому был введен однократно внутрибрюшинно 2-бутоксиэтанол, отмечалось развитие приобретенной токсической гемолитической анемии, о чем свидетельствовало значительное уменьшение концентрации гемоглобина, количества эритроцитов, наличие реакции агглютинации собственной сывороткой животного аутологичных эритроцитов, а также ретикулоцитоз периферической крови и гемосидероз красной пульпы селезенки. В то же время в печени и почках животного не выявлено значимых изменений токсического характера.

Пример 2. Крыса, самка, масса 186 г. Перед началом эксперимента проведен забор периферической крови из хвостовой вены - с целью анализа исходных показателей, а также 100 мкл крови дополнительно - для получения эритромассы с последующим замораживанием при температуре -18°C (для последующей постановки реакции агглютинации сывороткой животного аутологичных эритроцитов - по окончании эксперимента). После чего внутрибрюшинно под эфирным наркозом введено 4,0 мг 2-бутоксиэтанола (1 мл 0,4%-ного рабочего раствора). Спустя 10 суток наблюдения у животного взята кровь из хвостовой вены - с целью анализа показателей периферической крови. После забора крови животное выведено из эксперимента под эфирным наркозом с соблюдением правил эвтаназии. Проведен забор крови из полости сердца - для получения сыворотки. Проведен забор органов (печень, селезенка, почки) для гистологического исследования.

Показатели периферической крови до начала эксперимента: количество эритроцитов - 6,579·10⁹ в 1 мкл крови, концентрация гемоглобина - 118 г/л, количество ретикулоцитов - 1,5%, количество лейкоцитов - 6232 в 1 мкл крови, лимфоциты - 72%, абс. - 4487, нейтрофилы сегментоядерные - 21%, абс. - 1309, нейтрофилы палочкоядерные - 1%, абс. - 62, нейтрофилы юные - 0%, абс. - 0, моноциты - 2%, абс. - 124, эозинофилы - 3%, абс. - 188, базофилы - 1%, абс. - 62. Показатели периферической крови к концу эксперимента (10-е сутки после введения бутоксиэтанола): количество эритроцитов - 3,247·10⁹ в 1 мкл крови, концентрация гемоглобина - 78 г/л, количество ретикулоцитов - 4,12%, количество лейкоцитов - 4810, лимфоциты - 61, абс. - 2934, нейтрофилы сегментоядерные - 18%, абс. - 866, нейтрофилы палочкоядерные - 3%, абс. - 144, нейтрофилы юные - 4%, абс. - 192, моноциты - 8%, абс. - 386, эозинофилы - 5%, абс. - 240, базофилы - 1%, абс. - 48.

То есть к концу эксперимента у экспериментального животного отмечалось уменьшение концентрации гемоглобина, количества эритроцитов, рост количества ретикулоцитов, что свидетельствует о развитии у животного приобретенной токсической гемолитической анемии; в лейкоцитарной формуле - уменьшение относительного и абсолютного количества лимфоцитов, увеличение суммарного количества (относительного и абсолютного) нейтрофилов, увеличение количества моноцитов.

Результаты реакции агглютинации сывороткой животного аутологичных эритроцитов: гемолиз, титр - разведение 1:128, log=7.

Следовательно, у экспериментального животного, которому был введен однократно внутрибрюшинно 2-бутоксиэтанол, отмечалось развитие приобретенной токсической гемолитической анемии, о чем свидетельствовало значительное уменьшение концентрации гемоглобина, количества эритроцитов, наличие реакции агглютинации собственной сывороткой животного аутологичных эритроцитов, а также ретикулоцитоз периферической крови.

Результаты гистологического исследования: в селезенке животного выявлен гемосидероз красной пульпы, что является типичным проявлением гемолитической анемии. В ткани почек патологических изменений не обнаружено. В печени животного выявлены ограниченные участки зернистой дистрофии гепатоцитов и умеренное расширение синусоидных капилляров.

Таким образом, у экспериментального животного, которому был введен однократно внутрибрюшинно 2-бутоксиэтанол, отмечалось развитие приобретенной токсической гемолитической анемии, о чем свидетельствовало значительное уменьшение концентрации гемоглобина, количества эритроцитов, наличие реакции агглютинации собственной сывороткой животного аутологичных эритроцитов, а также ретикулоцитоз периферической крови и гемосидероз красной пульпы селезенки. В то же время в печени и почках животного не выявлено значимых изменений токсического характера.

Пример 3. Крыса, самец, масса 232 г. Перед началом эксперимента проведен забор периферической крови из хвостовой вены - с целью анализа исходных показателей, а также 100 мкл крови дополнительно - для получения эритромассы с последующим замораживанием при температуре -18°C (для последующей постановки реакции агглютинации сывороткой животного аутологичных эритроцитов - по окончании эксперимента). После чего внутрибрюшинно под эфирным наркозом введено 4,0 мг 2-бутоксиэтанола (1 мл 0,4%-ного рабочего раствора). Спустя 10 суток наблюдения у животного взята кровь из хвостовой вены - с целью анализа показателей периферической крови. После забора крови животное выведено из эксперимента под эфирным наркозом с соблюдением правил эвтаназии. Проведен забор крови из полости сердца - для получения сыворотки. Проведен забор органов (печень, селезенка, почки) для гистологического исследования.

Показатели периферической крови до начала эксперимента: количество эритроцитов - 6,779·10⁹ в 1 мкл крови, концентрация гемоглобина - 138 г/л, количество ретикулоцитов - 1,62%, количество лейкоцитов - 7734 в 1 мкл крови, лимфоциты - 69%, абс. - 5336, нейтрофилы сегментоядерные - 22%, абс. - 1701, нейтрофилы палочкоядерные - 2%, абс. - 155, нейтрофилы юные - 1%, абс. - 77, моноциты - 4%, абс. - 310, эозинофилы - 2%, абс. - 155, базофилы - 0%, абс. - 0. Показатели периферической крови к концу эксперимента (10-е сутки после введения бутоксиэтанола): количество эритроцитов -3,182·10⁹ в 1 мкл крови, концентрация гемоглобина - 81 г/л, количество ретикулоцитов - 4,55%, количество лейкоцитов - 3980, лимфоциты - 59, абс. - 2348, нейтрофилы сегментоядерные - 22%, абс. - 876, нейтрофилы палочкоядерные - 5%, абс. - 199, нейтрофилы юные - 1%, абс. - 40, моноциты - 9%, абс. - 358, эозинофилы - 3%, абс. - 119, базофилы - 1%, абс. - 40.

То есть к концу эксперимента у экспериментального животного отмечалось уменьшение концентрации гемоглобина, количества эритроцитов, рост количества ретикулоцитов, что свидетельствует в пользу развития у животного приобретенной гемолитической анемии; в лейкоцитарной формуле отмечалось уменьшение относительного и абсолютного количества лимфоцитов, увеличение суммарного количества (относительного и абсолютного) нейтрофилов, увеличение количества моноцитов.

Результаты реакции агглютинации сывороткой животного аутологичных эритроцитов: гемолиз, титр - разведение 1:64, log=6.

Результаты гистологического исследования: в селезенке животного выявлен гемосидероз красной пульпы, что является характерным признаком гемолитической анемии. В ткани почек патологических изменений не обнаружено. В печени животного выявлены ограниченные участки жировой дистрофии гепатоцитов и умеренное расширение синусоидных капилляров.

Таким образом, у экспериментального животного, которому был введен однократно внутрибрюшинно 2-бутоксиэтанол, отмечалось развитие приобретенной токсической гемолитической анемии, о чем свидетельствовало значительное уменьшение концентрации гемоглобина, количества эритроцитов, наличие реакции агглютинации собственной сывороткой животного аутологичных эритроцитов, а также ретикулоцитоз периферической крови и гемосидероз красной пульпы селезенки. В то же время в печени и почках животного не выявлено значимых изменений токсического характера.