×
20.09.2014
216.012.f5b5

НОВЫЙ ВАРИАНТ ЭКСЕНДИНА И ЕГО КОНЪЮГАТ

Вид РИД

Изобретение

Юридическая информация Свернуть Развернуть
№ охранного документа
0002528734
Дата охранного документа
20.09.2014
Краткое описание РИД Свернуть Развернуть
Аннотация: Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к конъюгату варианта эксендина с молекулой ПЭГ, и может быть использовано в медицине. Указанный конъюгат включает эксендин с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 4 и одну молекулу ПЭГ с молекулярным весом от 21 кДа до 29 кДа, конъюгированную с остатком цистеина в эксендине. Изобретение относится также к способу получения конъюгата эксендина, фармацевтической композиции и набору для снижения уровня глюкозы в крови, предусматривающим использование конъюгата эксендина. Изобретение позволяет получить конъюгат эксендина с ПЭГ с активностью агониста рецептора GLP-1 и с сохранением максимального эффекта в отношении стимуляции продукции цАМФ (E) при ПЭГилировании. 4 н. и 3 з.п. ф-лы, 44 ил., 5 табл., 26 пр.
Реферат Свернуть Развернуть

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к новым вариантам эксендина, его конъюгатам с полимерами и содержащей их фармацевтической композиции, а также к применению вариантов, конъюгатов и фармацевтических композиций эксендина для снижения уровня глюкозы в крови, особенно при лечении диабета (в частности, диабета II типа). Настоящее изобретение также относится к применению конъюгатов эксендина для снижения веса тела.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Во всем мире по мере социального развития, увеличения продолжительности жизни и изменения стиля жизни диабет стал одним из лидирующих проблем со здоровьем. Заболеваемость сахарным диабетом стремительно растет как в развитых, так и в развивающихся странах. В 2007 году в мире насчитывалось около 246 миллионов пациентов с диабетом, и каждые 10 секунд в мире один пациент умирает от диабета. Прогнозируется, что популяция пациентов с диабетом в мире вырастет до 333 миллионов в 2025 году. Китай является проблемным регионом по диабету. На сегодняшний день в Китае популяция пациентов с диабетом составляет 40 миллионов, по числу больных диабетом Китай с заболеваемостью, составляющий около 5%, находится на втором месте в мире (после Индии). Сахарный диабет бывает двух типов: один является инсулинзависимым сахарным диабетом (диабет 1 типа), а второй является инсулиннезависимым сахарным диабетом (диабет 2 типа). Из них диабет 2 типа составляет более 90% от всех случаев заболеваний диабетом. Диабет 2 типа отличается неконтролируемой секрецией или функцией инсулина, а также нарушением функций β-клеток, что приводит к нарушениям в метаболизме липидов, углеводов и белков. Это может привести к хронической гипергликемии и со временем вызвать осложнения в микро- и макрососудистой системе и различных органах. В настоящий момент существуют два класса лекарственных соединений для контроля сахарного диабета: 1) усилители секреции инсулина, такие как сульфонилмочевина, меглитиниды и ингибиторы дипептидил-пептидазы, аналоги GLP-1; и 2) усилители секреции других соединений, помимо инсулина, такие как инсулин, ингибиторы α-гликозидазы, бигуаниды, тиазолидиндионы и аналоги инсулина. В настоящий момент большинство противодиабетических лекарственных средств, обычно используемых в клинической практике, менее эффективны в отношении диабета 2 типа. Они не способны ни остановить прогрессирующие повреждения β-клеток, ни понизить уровень HbA1c в крови, ни предупредить осложнения, вызываемые диабетом, такие как сердечные заболевания и почечную недостаточность. Кроме того, они имеют до известной степени выраженные токсичные побочные эффекты. Соответственно, существует необходимость в исследованиях новых лекарственных средств для лечения диабета 2 типа.

В 1985 году был открыт гормон желудочно-кишечного тракта, глюкагоноподобный пептид-1 (GLP-1). GLP-1 является продуктом экспрессии гена проглюкагона после еды и в основном секретируется L-клетками слизистой желудочно-кишечного тракта. GLP-1 стимулирует секрецию инсулина островковыми β-клетками поджелудочной железы (J. Med. Chem., 47, 4128-4134, 2004) и играет важную роль в стабилизации уровня глюкозы в крови. У пациентов с сахарным диабетом 2 типа введение GLP-1 может стабилизировать содержание глюкозы в крови на нормальном уровне (Diabetes Care, 15, 270-276, 1992; Lancet, 359, 824-830, 2002; Endoer. Rev, 16, 390-410, 1996; Diabetologia, 28, 565-573, 1985). В организме GLP-1 выполняет следующие функции: глюкозозависимо действует на островковые β-клетки поджелудочной железы, усиливая транскрипцию гена инсулина и биосинтез и секрецию инсулина; стимулирует пролиферацию и дифференцировку β-клеток и ингибирует апоптоз β-клеток, увеличивая количество островковых β-клеткок поджелудочной железы; ингибирует секрецию глюкагонов; увеличивает чувствительность инсулиновых рецепторов в периферических клетках; снижает уровень HbA1c; подавляет аппетит и уменьшает количество потребляемой пищи; задерживает ощущение пустоты в желудке (Diabetic Med., 18, 144-149, 2001; Diabetes, 51, 1443-1452, 2002; Diabetologia, 45, 1263-1273, 2002; Diabetes, 50, 525-529, 2001; Diabetes, 50, 725, 2001; Diabetes, 52, 365-371, 2003; Recent Prog. Hormne Res. 56, 377-399, 2001; Disbetologia, 39, 1546-1553, 1996; Am. J. Physic. Endocrinol. Metab, 281, E242-247, 2001; U.S. patent 477967, 478017, 478425; Diabetes Care, 22, 403-408, 1999; J. Clin. Endocrinology and Metabolism, 88, 3082-3089, 2003; Diabetes, 44, 1295, 1995). Однако в организме GLP-1 быстро разрушается под действием дипептидилпептидазы (DPP IV), а его время полужизни составляет меньше 2 минут, и поэтому GLP-1 невозможно использовать в качестве эффективного противодиабетического лекарственного средства.

Эксендин-4 представляет собой полипептид, найденный в слюне аризонского ядозуба, ядовитой ящерицы, обитающей в штатах Аризоне и Нью-Мексико США (J. Biol. Chem., 265, 20259-20262, 1990; J. Biol. Chem., 267, 7402-7405, 1992). Эксендин-4 имеет высокую степень гомологии с GLP-1 (7-36) (53%). Опубликовано, что эксендин-4 может связывать рецептор GLP-1 и проявлять фармакологический агонистический эффект, аналогичный эффекту GLP-1, например, увеличивая синтез инсулина, усиливая глюкозозависимую секрецию инсулина; стимулируя пролиферацию и регенерацию, а также ингибируя апоптоз β-клеток, тем самым увеличивая их количество; ингибируя секрецию глюкагонов; ингибируя образование гликогена, не вызывая при этом острую гипогликемию; угнетая моторику и секрецию желудочно-кишечного тракта после еды; снижая аппетит и количество потребляемой пищи; защищая нервные клетки (Nat. Biotech, 23, 857-861, 2005; J. Biol. Chem., 266, 2897-2902, 1991; J. Biol. Chem., 266, 21432-21437, 1992; Diabetes, 44, 16-19, 1995; Nature, 379, 69-72, 1996). Способность эксендина-4 усиливать секрецию инсулина и ингибировать секрецию глюкагона после еды зависит от уровня глюкозы в крови, что предпочтительно по сравнению с используемыми на текущий момент сульфонилмочевинами, и, в частности, эксендин-4 в меньшей степени вызывает гипогликемию и значительно снижает частоту проверок уровня глюкозы в крови, а также снижает вес тела. Препарат эксендина-4 для приема дважды в сутки (Эксенатид, продаваемый под наименованием Баетта), разработанный совместно Amylin и Eli Lilly, допущен к продаже в Соединенных Штатах и Европе (патенты США № 5424286, 6858576, 6872700, 6902744, 6956026, 7297761). Соответственно, этот тип лекарственных препаратов широко используется для лечения диабета и ожирения во всем мире.

Фармацевтические пептиды требуют многократных инъекций в течение дня, поскольку эти фармакологические препараты имеют короткое время полужизни в организме и плохую физическую и химическую стабильность, а также они подвержены деградации различными протеазами. Экзанатид вводится дважды в день с помощью подкожных инъекций, что приводит к тяжелой нагрузке на организм, психику и финансовое состояние пациента, и поэтому пациенты плохо соблюдают режим лечения. Соответственно, современные исследования в области противодиабетических лекарственных средств сосредоточены на структурной модификации эксендина-4 и разработке новых лекарственных форм для увеличения времени полужизни эксендина-4 в плазме крови и увеличения системной доступности лекарственного соединения.

Модификация полимерами является многообещающей методикой, разработанной в 1970 годы, причем типичной модификацией является ПЭГилирование (модификация молекулами полиэтиленгликоля, ПЭГ). Эта методика представляет собой химическую конъюгацию ПЭГ и фармакологического белка для модификации поверхности белка. После ПЭГ-модификации увеличивается молекулярный вес белка, а скорость его выведения почками снижается. Кроме того, конъюгированные цепи ПЭГ стерически затрудняют доступ к поверхности молекулы белка, что приводит к уменьшению его гидролиза протеазами крови. Поэтому это эффективно увеличивает срок жизни белка в кровотоке и приводит к увеличению времени полужизни в плазме крови и системной доступности лекарственного соединения, повышая его эффективность.

На настоящий момент уже разработано второе поколение методик ПЭГилирования - сайт-направленное ПЭГилирование. Сайт-направленное ПЭГилирование можно использовать для специфичной модификации некоторых аминокислот в белках, предупреждая, таким образом, неспецифичную модификацию. Фактически в меньшей степени затрагивается структура активного центра белков, а некоторые антигенные сайты нарушаются избирательно, что уменьшает ряд недостатков, таких как снижение биологической активности и увеличение гетерогенности вследствие неспецифичного ПЭГилирования.

Учеными были проведены некоторые исследования по модификации эксендина-4 полимерами. Young и Prickett (CN1372570A) доказали, что метаболизм эксендина-4 в основном осуществляется через почки. Поэтому они модифицировали эксендин-4, используя ПЭГ с молекулярным весом в диапазоне от 500 до 20000 дальтон (Да). Wenchao Bao, Hongjing Xu, Gang Yu, Yajun Zuo (CN 101125207 A) провели модификацию аминокислот эксендина-4, используя ПЭГ с молекулярным весом в диапазоне от 20 кДа до 50 кДа.

Однако у существующих на сегодняшний день эксендина-4 и его вариантов и различных модифицированных форм имеются недостатки, в том числе высокая частота введения, что приводит к тяжелой нагрузке на организм, психику и финансовое состояние пациента. Поэтому пациенты плохо соблюдают режим лечения и невозможно широко использовать эти лекарственные средства. Соответственно, до сих пор существует необходимость в новых вариантах эксендина-4 и вариантах, модифицированных полимерами.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном аспекте настоящее изобретение относится к варианту эксендина, имеющему активность агониста рецептора GLP-1, в котором один или несколько аминокислотных остатков замещены цистеином по сравнению с последовательностью эксендина дикого типа. Необязательно, в варианте эксендина одна или несколько аминокислот дополнительно могут быть удалены, вставлены и/или замещены, причем вставляемые или замещающие аминокислоты могут представлять собой природные аминокислоты или аналоги аминокислот.

В варианте осуществления изобретения вариант эксендина имеет аминокислотную последовательность, в которой один или несколько аминокислотных остатков замещены цистеином, и, необязательно, другой аминокислотой, по сравнению с последовательностью эксендина-4 дикого типа

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser (SEQ ID NO: 1)

Или последовательностью эксендина-3 дикого типа

His-Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser (SEQ ID NO: 2), или аналогичной им последовательностью. Аминокислотные замены, каждая независимо, расположены в N-концевой, С-концевой и/или во внутренней части аминокислотной последовательности дикого типа.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения вариант эксендина имеет цистеиновую замену по меньшей мере на С-конце варианта. Кроме того, предпочтительно, чтобы последняя аминокислота С-конца варианта эксендина была замещена цистеином. Кроме того, вариант эксендина, предпочтительно, имеет цистеиновую замену по меньшей мере по одной или нескольким позициям, выбранным из группы, состоящей из позиций, соответствующих Arg в позиции 20, Trp в позиции 25, Ala в позиции 35 и Ser в позиции 39 эксендина-4 или эксендина-3.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к конъюгату варианта эксендина, в котором одна или несколько молекул полимера (предпочтительно, физиологически приемлемого полимера, такого как полиалкиленгликоль, более конкретно, ПЭГ) конъюгированы с вариантом эксендина. В варианте осуществления изобретения конъюгат содержит данные многочисленные молекулы полимера, причем молекулы полимера могут быть одинаковыми или нет. Предпочтительно, чтобы молекула полимера была конъюгирована с вариантом эксендина через один или несколько цистеинов. В варианте осуществления изобретения молекула полимера конъюгирована с вариантом эксендина через тиоэфирную связь.

Опытному специалисту известно, что при конъюгации молекулы полимера с биомолекулой биологическая активность конъюгированной биомолекулы снижается экспоненциально при увеличении молекулярного веса конъюгирующей молекулы (например, начиная с 4 кДа) (Bailon et al. Rational design of potent, long-lasting form of interferon: A 40 kDa branched polyethylene glycol-conjugated interferon α-2a for the treatment of hepatitis C. Bioconjugate Chem., 2001, 12: 195-202; Bowen et al. Relationship between molecular weight and duration of activity of polyethylene glycol conjugated granulocyte colony-stimulating factor mutein. Experimental Hematology 1999, 27:425-32; Bailon et al. PEG-modified biopharmaceuticals. Expert Opin. Deliv., 2009, 6: 1-16). Опытному специалисту также известно, что биологический период полужизни и/или период полужизни в плазме, а также системная доступность конъюгированной молекулы удлиняется или увеличивается постепенно по мере увеличения молекулярного веса конъюгирующей молекулы.

Однако авторы изобретения неожиданно обнаружили, что по сравнению с неконъюгированным вариантом эксендина молекула конъюгата варианта эксендина по настоящему изобретению все еще сохраняет большую часть активности агониста рецептора GLP-1 даже при увеличении молекулярного веса полимерной молекулы до 30 кДа. Даже при увеличении молекулярного веса молекулы ПЭГ до 40 кДа или выше конъюгат варианта эксендина по настоящему изобретению все еще сохраняет существенную активность агониста рецептора GLP-1. В частности, при увеличении молекулярного веса полимерной молекулы с 5 кДа до 27 кДа, активность конъюгата варианта эксендина как агониста рецептора GLP-1, по существу, не меняется по сравнению с неконъюгированным вариантом эксендина.

Поэтому в предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к конъюгату варианта эксендина с увеличенным биологическим периодом полужизни и/или периодом полужизни в плазме и существенной активностью агониста рецептора GLP-1.

В варианте осуществления изобретения полимером является полиалкиленгликоль и включает inter alia, например, полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль. Одна или несколько молекул полимера могут иметь любой подходящий молекулярный вес, например, от 2 кДа до 50 кДа, предпочтительно, от 5 кДа до 30 кДа, более предпочтительно, от 20 кДа до 30 кДа, например, 21 кДа, 22 кДа, 23 кДа, 24 кДа, 25 кДа, 26 кДа, 27 кДа, 28 кДа, 29 кДа и 30 кДа, а также любое значение между вышеуказанными значениями молекулярного веса.

Необязательно, конъюгат варианта эксендина может также быть конъюгирован с одним или несколькими из вышеуказанных полимеров, одинаковыми или нет, по одному или нескольким другим аминокислотным остаткам. Один или несколько аминокислотных остатков могут, каждый независимо, располагаться в N-концевой, С-концевой и/или во внутренней части варианта эксендина.

В настоящем изобретении полимер для конъюгации может находиться в любой соответствующей конфигурации, в том числе, например, однолучевой, двухлучевой, многолучевой и/или разветвленной, в которой каждый из лучей или ответвлений могут быть одинаковыми или нет.

Настоящее изобретение дополнительно относится к способу получения конъюгата варианта эксендина, описанного выше, включающему контактирование варианта эксендина с полимером; для конъюгации активированного полимера с одним или несколькими остатками цистеина в варианте эксендина предпочтительно, чтобы на момент контакта к полимеру была присоединена реакционноспособная группа или он был активирован. В варианте осуществления изобретения цистеины в варианте эксендина специфично модифицированы ПЭГ с различной длиной полимерной цепи и структурой полимера в результате подбора специфичных активирующих групп и соответствующего рН. В конкретном варианте осуществления изобретения специфичной активирующей группой является малеимид.

Настоящее изобретение дополнительно относится к фармацевтической композиции, содержащей вариант эксендина и/или конъюгат варианта эксендина по настоящему изобретению, а также, необязательно, фармацевтически приемлемый носитель.

Настоящее изобретение дополнительно относится к способу лечения заболеваний, включающему введение терапевтически эффективного количества варианта эксендина, и/или конъюгата варианта эксендина, и/или фармацевтической композиции по настоящему изобретению, нуждающемуся в этом субъекту. Аналогичным образом настоящее изобретение также относится к применению варианта эксендина, и/или конъюгата варианта эксендина, и/или фармацевтической композиции по настоящему изобретению в изготовлении лекарственного препарата для лечения заболеваний. Заболевания могут быть выбраны из группы, состоящей из постпрандиального демпинг-синдрома, постпрандиальной гипергликемии, непереносимости глюкозы, расстройств или заболеваний, течение которых может облегчить ингибирование секреции глюкагона, регулирование уровня триглицеридов и/или снижение количества потребляемой пищи, ожирения, расстройств питания, синдрома инсулинорезистентности, диабета, гипергликемии и гипогликемии. Предпочтительным заболеванием является диабет. Более предпочтительно заболеванием является диабет 1 типа или диабет 2 типа, в особенности диабет 2 типа.

Хорошо известно, что эксендин снижает вес тела у пациентов с ожирением и вызывает тошноту и рвоту, механизм возникновения которых ассоциирован с ингибированием пищевого центра и активацией рвотного центра в центральной нервной системе (Larsen. Mechanisms behind GLP-1 induced weight loss. Br J Diabetes Vasc Dis 2008; 8: S34-S41; Schick et al. Glucagon like peptide 1 (7-36)-amide acts at lateral and medial hypothalamic sites to suppress feeding in rats. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2003; 284:R1427-35). Благодаря своему увеличившемуся весу конъюгат эксендина или его варианта не может пересечь гематоэнцефалический барьер и поэтому меньше вызывает рвоту по сравнению с эксендином. Соответственно, перед выполнением настоящего изобретения авторы естественно ожидали, что конъюгат эксендина или его варианта также будет проявлять более слабые эффекты в отношении снижения потребления пищи и уменьшения веса тела, опосредованные центральной нервной системой. Однако авторы неожиданно обнаружили, что конъюгат эксендина или его варианта значительно усиливал эффекты снижения веса тела и уменьшения потребления пищи, хотя эксендин дикого типа и неконъюгированный вариант эксендина, оба снижали вес тела и потребление пищи.

Поэтому в другом аспекте настоящее изобретение относится к способу снижения веса тела путем введения конъюгата эксендина, или его варианта, и/или содержащей их фармацевтической композиции. Кроме того, настоящее изобретение также относится к применению конъюгата эксендина, или его варианта, и/или содержащей их фармацевтической композиции в изготовлении лекарственного препарата для снижения веса тела. В варианте осуществления изобретения конъюгат эксендина или его варианта представляет собой конъюгат варианта эксендина по настоящему изобретению, описанный выше.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг.1 показан масс-спектр соединения РВ-105, полученного в примере 1.

На фиг.2 показана молекулярная структура ПЭГ.

На фиг.3 показан результат ВЭЖХ-анализа чистоты РВ-110 (ПЭГ5000-РВ-105), полученного в примере 2.

На фиг.4 показана молекулярная структура ПЭГ5000b.

На фиг.5 показана молекулярная структура ПЭГ5000с.

На фиг.6 показано (А) изображение, полученное окрашиванием йодом, и (В) изображение, полученное окрашиванием Кумасси бриллиантовым синим, ПЭГилированного конъюгата РВ-105; в соответствующих дорожках нанесены: 1) стандарты молекулярного веса; 2) РВ-106 (ПЭГ20000-PB-105); 3) PB-107 (ПЭГ30000-PB-105); 4) PB-108 (ПЭГ40000-PB-105); и 5) PB-109 (ПЭГ20000×2-PB-105).

На фиг.7 показан результат ВЭЖХ-анализа чистоты РВ-106 (ПЭГ20000-РВ-105), полученного в примере 3.

На фиг.8 показана молекулярная структура ПЭГ20000b.

На фиг.9 показана молекулярная структура ПЭГ20000с.

На фиг.10 показана молекулярная структура ПЭГ20000d.

На фиг.11 показана молекулярная структура ПЭГ20000e.

На фиг.12 показан результат ВЭЖХ-анализа чистоты РВ-112 (ПЭГ20000-РВ-111), полученного в примере 3.

На фиг.13 показан результат ВЭЖХ-анализа чистоты РВ-107 (ПЭГ30000-РВ-105), полученного в примере 4.

На фиг.14 показан результат ВЭЖХ-анализа чистоты РВ-108 (ПЭГ40000-РВ-105), полученного в примере 5.

На фиг.15 показан результат ВЭЖХ-анализа чистоты РВ-114 (ПЭГ40000-РВ-113), полученного в примере 5.

На фиг.16 показана молекулярная структура ПЭГ20000×2.

На фиг.17 показан результат ВЭЖХ-анализа чистоты РВ-109 (ПЭГ20000×2-РВ-105), полученного в примере 6.

На фиг.18 показана молекулярная структура ПЭГ20000×2b.

На фиг.19 показана молекулярная структура ПЭГ20000×2c.

На фиг.20 показана молекулярная структура ПЭГ20000×2d.

На фиг.21 показан результат ВЭЖХ-анализа чистоты РВ-119 (ПЭГ23000-РВ-105), полученного в примере 7.

На фиг.22 показан результат ВЭЖХ-анализа чистоты РВ-120 (ПЭГ27000-РВ-105), полученного в примере 8.

На фиг.23А показан результат ВЭЖХ-анализа РВ-106 (ПЭГ20000-РВ-105) после хранения при рН 4,5, -20°С в течение 60 дней.

На фиг.23В показан результат ВЭЖХ-анализа РВ-106 (ПЭГ20000-РВ-105) после хранения при рН 7,0, 4°С в течение 60 дней.

На фиг.23С показан результат ВЭЖХ-анализа РВ-106 (ПЭГ20000-РВ-105) после хранения при рН 7,0, -20°С в течение 60 дней.

На фиг.24 показана зависимость от дозы эффектов РВ-101 и РВ-105 на внутриклеточный уровень цАМФ в клетках РС12.

На фиг.25 показаны эффекты РВ-105 и его ПЭГилированного конъюгата на внутриклеточный уровень цАМФ in vitro.

На фиг.26А показана взаимосвязь между молекулярным весом (MW) ПЭГ в ПЭГилированном конъюгате и фармакологической активностью in vitro (Log EC50).

На фиг.26В показана взаимосвязь между молекулярным весом (MW) ПЭГ в ПЭГилированном конъюгате и максимальной фармакологической активностью (Emax).

На фиг.27 показан эффект РВ-105 и его ПЭГилированного конъюгата на внутриклеточный уровень цАМФ in vitro.

На фиг.28 показана зависимость от времени эффекта снижения уровня глюкозы в крови для РВ-101 и РВ-105.

На фиг.29 показана зависимость от дозы эффекта снижения уровня глюкозы в крови для РВ-101 и РВ-105.

На фиг.30 показана зависимость от дозы эффекта снижения уровня глюкозы в крови для РВ-101 и его варианта РВ-102.

На фиг.31 показана зависимость от времени эффекта снижения уровня глюкозы в крови для РВ-105 и его ПЭГилированного конъюгата.

На фиг.32А показана зависимость между молекулярным весом ПЭГ в ПЭГилированном варианте эксендина и биологическим периодом полужизни (Т1/2).

На фиг.32В показана зависимость между молекулярным весом ПЭГ в ПЭГилированном варианте эксендина и максимальным эффектом снижения уровня глюкозы в крови (в % от концентрации глюкозы в крови до введения дозы соединения).

На фиг.32С показана зависимость между молекулярным весом ПЭГ в ПЭГилированном варианте эксендина и площади над кривой (ААС) для кривой снижения уровня глюкозы в крови.

На фиг.33 показана зависимость от времени эквивалентного эффекта снижения уровня глюкозы в крови для РВ-105 и его ПЭГилированного (ПЭГ30000) конъюгата, РВ-107.

На фиг.34 показана зависимость от дозы эффекта снижения уровня глюкозы в крови для РВ-105 и его ПЭГилированного (ПЭГ20000) конъюгата, РВ-106.

На фиг.35 показана зависимость от времени эквивалентного эффекта снижения уровня глюкозы в крови для РВ-105, РВ-111 и их ПЭГилированных конъюгатов. Экспериментальные данные представлены как среднее ± SEM (стандартная ошибка среднего).

На фиг.36 показана зависимость от времени эффекта снижения уровня глюкозы в крови для РВ-101, его вариантов РВ-105, РВ-111 и РВ-113, а также ПЭГилированных конъюгатов, РВ-106, РВ-112 и РВ-114. Экспериментальные данные представлены как среднее ± SEM.

На фиг.37 показана зависимость от времени эквивалентного эффекта снижения уровня глюкозы в крови для РВ-105 и его ПЭГилированного конъюгата. Экспериментальные данные представлены как среднее ± SEM. * представляет статистически достоверную разницу по сравнению с группой РВ-105 (р<0,05).

На фиг.38 показаны эффекты РВ-101, РВ-105, РВ-106 и РВ-120, соответственно, на задержку рвоты (А) и время рвоты (В) у голубей. Экспериментальные данные представлены как среднее ± SEM, a) представляет статистически достоверную разницу в дозировке 3 мг/кг по сравнению с группой РВ-105 (р<0,05); b) представляет статистически достоверную разницу в дозировке 6 мг/кг как по сравнению с группой РВ-101, так и с группой РВ-105 (р<0,05).

На фиг.39 показаны эффекты РВ-101, РВ-105 и РВ-106 на аллергический ответ у системно иммунизированных морских свинок. Экспериментальные данные представлены как среднее ± SEM, a) представляет статистически достоверную разницу по сравнению с группой, которой вводили физиологический раствор (р<0,05); b) представляет статистически достоверную разницу по сравнению с группой РВ-101 или с группой РВ-105 (р<0,05).

На фиг.40 показаны эффекты на увеличение веса тела у морских свинок в течение (А) 0-18 дней и (В) 0-4 дней после введения РВ-101, РВ-105 и РВ-106. Экспериментальные данные представлены как среднее ± SEM, a) представляет статистически достоверную разницу по сравнению с группой, которой вводили физиологический раствор (р<0,05); b) представляет статистически достоверную разницу по сравнению с Экзенатидом или с группой РВ-105 (р<0,05).

На фиг.41 показаны эффекты на (А) вес тела и на (С) потребление пищи у крыс после введения РВ-105, РВ-106, РВ-119 и РВ-120. На В и D показана площадь под кривой для кривой зависимости веса тела от времени и кривой зависимости потребления пищи от времени для соответствующих групп после введения соединений. Экспериментальные данные представлены как среднее ± SEM, a) представляет статистически достоверную разницу по сравнению с группой, которой вводили физиологический раствор (р<0,05); b) представляет статистически достоверную разницу по сравнению с группой РВ-105 (р<0,05).

На фиг.42 показана кривая зависимости концентрации от времени при болюсной инъекции Эксенатида и РВ-105.

На фиг.43 показана кривая зависимости концентрации от времени при болюсной инъекции РВ-105 и ПЭГилированного конъюгата эксендина.

На фиг.44А показана взаимосвязь между MW ПЭГ в ПЭГилированном варианте эксендина и периодом полужизни в плазме.

На фиг.44В показана взаимосвязь между MW ПЭГ в ПЭГилированном варианте эксендина и площадью под кривой (AUC) для кривой зависимости концентрации от времени.

ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Определения

Используемый в настоящем документе термин «аминокислота» включает природные аминокислоты, неприродные аминокислоты и аналоги аминокислот, а также все их D- и L-стереоизомеры. Неприродные аминокислоты включают, но не ограничены этим, азетидинкарбоновую кислоту, 2-аминоадипиновую кислоту, 3-аминоадипиновую кислоту, β-аланин, аланин, 2-аминомасляную кислоту, 4-аминомасляную кислоту, 6-аминокапроновую кислоту, 2-аминогептановую кислоту, 2-аминоизомасляную кислоту, 3-аминоизомасляную кислоту, 2-аминогептандионовую кислоту, трет-бутилглицин, 2,4-аминоизомасляную кислоту, 2,2'-диаминогептандионовую кислоту, 2,3-диаминопропионовую кислоту, N-этилглицин, N-этиласпарагин, гомопролин, гидроксилизин, аллогидроксилизин, 3-гидроксипролин, 4-гидроксипролин, изодесмозин, аллоизолейцин, N-метилаланин, N-метилглицин, N-метилизолейцин, N-метиламилглицин, N-метилвалин, аланиннафталин, норвалин, норлейцин, орнитин, глицинамил, 2-пиперидиновая кислота и тиопролин. Аналоги аминокислот включают природные аминокислоты и неприродные аминокислоты, в которых карбоксильная группа на С-конце, аминогруппа на N-конце или боковая группа обратимо или необратимо химически блокированы или химически модифицированы до другой функциональной группы, такой как, например, метионинсульфоксид, метионинсульфон, S-(карбоксиметил)цистеин, S-(карбоксиметил)цистеинсульфоксид и S-(карбоксиметил)цистеинсульфоксид.

Используемый в настоящем документе термин «полипептид» или «белок» взаимозаменяемо означает цепочку по меньшей мере из двух аминокислотных остатков, соединенных друг с другом ковалентными связями (такими как пептидная связь), которая может представлять собой рекомбинантный полипептид, природный полипептид или синтетический полипептид.

Используемый в настоящем документе термин «цистеиновая замена» означает замещение одного или нескольких других аминокислотных остатков в природном полипептиде (таком как эксендин-4) остатком цистеина с помощью генной инженерии или химического синтеза.

Используемые в настоящем документе термины «вариант полипептида», «вариант» или «аналог» означают полипептид, в котором аминокислотная последовательность отличается вследствие наличия одной или нескольких замен, делеций, вставок, слияний, укорочений или любой их комбинации. Вариант полипептида может быть полностью функциональным, или у него может отсутствовать одна или несколько функций. Полностью функциональный вариант может содержать изменения, например, только консервативные изменения либо по незначимым остаткам, либо в незначимой области. Функциональный вариант может содержать замену аналогичной аминокислотой, не приводящей или приводящей к несущественному изменению функций. Функционально важные аминокислоты можно идентифицировать способами, известными в данной области, такими как сайт-направленный мутагенез или глицин-сканирующий мутагенез (Cunningham Β. and Wells J., Science, 244: 1081-1085, 1989). Позицию, ключевую для активности полипептидов, можно определить, например, с помощью структурного анализа, такого как кристаллизация, ЯМР или фотоаффинное мечение (Smith L. et al., J. Mol. Biol., 224: 899-904, 1992; de Vos, A. et al., Science, 255: 306-312, 1992). Термин «тиольный вариант» означает варианты полипептида, в которых тиол присутствует в аминокислотной последовательности в результате замены, вставки, слияния или любой их комбинации.

Используемый в настоящем документе термин «конъюгат» означает продукт, образующийся в результате ковалентного или нековалентного соединения полипептида или варианта полипептида и модифицирующей группы по настоящему изобретению. Модифицирующая группа включает, но не ограничена этим, вышеуказанные примеры.

Используемый в настоящем документе термин «модифицированный полипептид» или «модифицированный вариант полипептида» означает полипептид или вариант полипептида, в котором одна или несколько аминокислот химически модифицированы, причем модификация представляет собой ковалентную или нековалентную модификации различных групп, включая, но не ограниченные этим, фосфорилирование, гликозилирование, метилирование, ПЭГилирование, биотинилирование, SUMOилирование (присоединение молекулы SUMO), ацетилирование и т.п.

Используемый в настоящем документе термин «алкил» означает замещенный или незамещенный, неразветвленный или разветвленный алкил, такой как С1-С30-алкил, С1-С20-алкил, С2-С15-алкил или С3-С10-алкил, необязательно замещенный одним или несколькими заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей, например, из галогеногруппы, аминогруппы, нитрогруппы и т.п.

Используемый в настоящем документе термин «циклоалкил» означает замещенный или незамещенный С3-С8-циклоалкил, необязательно замещенный одним или несколькими заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей, например, из С1-С10-алкила, С2-С10-алкенила, С2-С10-алкинила, галогеногруппы, аминогруппы и нитрогруппы.

Используемый в настоящем документе термин «алкенил» означает замещенный или незамещенный, неразветвленный или разветвленный алкенил, имеющий одну углерод-углеродную двойную связь, который может состоять, например, из 2-20, 3-15, 4-10 атомов углерода, и который, необязательно, может быть замещен одним или несколькими заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей, например, из галогеногруппы, аминогруппы и нитрогруппы.

Используемый в настоящем документе термин «арил» означает С6-С10-арил, необязательно замещенный одним или несколькими заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей, например, из С1-С10-алкила, С2-С10-алкенила, С2-С10-алкинила, галогеногруппы, аминогруппы и нитрогруппы.

Используемый в настоящем документе термин «линкер» означает органическую группу, которая присоединяет ПЭГ к эксендину. В настоящем изобретении линкер может быть алкилом, простым эфиром, амидом, сложным эфиром, тиолом и т.п., а линкер может содержать, например, до 30 атомов углерода, например, 1-25, 2-20, 3-15 или 3-10 атомов углерода.

В общем, используемый в настоящем документе термин «полиэтиленгликоль» имеет значение, которое обычно понимает под этим термином опытный специалист в данной области, и, если не указано иное, включает как полиэтиленгликоль per se, так и его производные с модификациями на концах.

Кроме того, для полимера, такого как полиэтиленгликоль, существует набор способов определения молекулярного веса. Для представления молекулярного веса полимера обычно используется средний молекулярный вес (в частности, среднечисловой молекулярный вес или средневесовой молекулярный вес), поскольку полимер состоит из молекул с различной степенью полимеризации в диапазоне распределения. Среднечисловой молекулярный вес и средневесовой молекулярный вес обычно бывают равны для полимеров с узким диапазоном распределения, хотя они могут до некоторой степени отличаться при больших различиях степени полимеризации в полимерах. Для полимеров, таких как полиэтиленгликоль, упомянутых в настоящем документе, указанный молекулярный вес может быть либо среднечисловым молекулярным весом, либо средневесовым молекулярным весом.

Варианты эксендина

В одном аспекте настоящее изобретение относится к варианту эксендина с активностью агониста рецептора GLP-1, в котором один или несколько (например, 1, 2, 3, 4, 5 или больше) аминокислотных остатков замещены цистеином по сравнению с последовательностью эксендина дикого типа. Цистеиновые замены, каждая независимо, находятся в N-концевой, С-концевой и/или во внутренней части последовательности варианта эксендина. В некоторых вариантах осуществления изобретения в варианте эксендина по меньшей мере 1, 2, 3 или 4 аминокислотных остатка его С-концевой части замещены цистеинами. Предпочтительно, чтобы вариант эксендина имел цистеиновую замену последней аминокислоты С-конца. В некоторых других вариантах осуществления изобретения предпочтительно, чтобы эксендин имел цистеиновую замену 1, 2, 3, 4 или больше аминокислотных остатков С-концевой, N-концевой и/или во внутренней части последовательности варианта эксендина.

Последовательность эксендина дикого типа или аналогичная последовательность, описанные в настоящем изобретении, могут быть любой известной последовательностью в данной области, включая их различные варианты или аналоги, или последовательности их агонистов. Информацию по эксендину можно найти, например, в материалах Eng J. et al., J. Biol. Chem., 265: 20259-62, 1990; Eng J. et al., J. Biol. Chem., 267: 7402-05, 1992; WO 00/66629 и WO 00/41546, каждый из которых полностью включен в настоящий документ путем ссылки.

Вариант эксендина, необязательно, также может иметь одну или несколько (например, 1, 2, 3, 4, 5 или более) дополнительных модификаций аминокислот, включая, например, замену, делецию, вставку и/или добавление аминокислот. Аналогичным образом дополнительная аминокислотная модификация может независимо находиться в N-концевой, С-концевой и/или во внутренней части последовательности эксендина. Замещающей, вставленной и/или добавленной аминокислотой может быть любая природная аминокислота, неприродная аминокислота или аналог аминокислоты, или D- или L-стереоизомер аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления изобретения дополнительная аминокислотная модификация представляет собой консервативную аминокислотную замену, например, замену между Ala/Gly, Ser/Thr, Glu/Asp, Gln/Asn, Ala/Val/Ile/Leu, Arg/Lys, Phe/Tyr и т.п. Относительно консервативных аминокислотных замены большое количество информации присутствует в прототипах, например, см. WO/2006/083301, который полностью включен в настоящий документ путем ссылки.

В настоящем изобретении эксендином дикого типа могут быть эксендин-3 или эксендин-4. Поэтому в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к таким вариантам эксендина, в которых один или несколько (например, 1, 2, 3, 4, 5 или более) аминокислотных остатков замещены цистеином, по сравнению с

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser (SEQ ID NO: 1; эксендин-4) или

His-Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser (SEQ ID NO: 2; эксендин-3) или аналогичной последовательностью. Предпочтительно, чтобы вариант эксендина имел цистеиновую замену по меньшей мере одной или нескольких позиций, выбранных из группы, состоящей из позиций, соответствующих Arg (аргинину) в позиции 20, Trp (триптофану) в позиции 25, Ala (аланину) в позиции 35 и Ser (серину) в позиции 39 последовательностей SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения вариант эксендина имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из

Как указано выше, вариант эксендина по настоящему изобретению необязательно также может иметь одну или несколько (например, 1, 2, 3, 4, 5 или более) дополнительных модификаций аминокислот, включая, например, замену, делецию, вставку и/или добавление аминокислот. Дополнительная аминокислотная модификация может независимо быть расположена в N-концевой, С-концевой и/или во внутренней части последовательности эксендина. Замещающей, вставленной и/или добавленной аминокислотой может быть любая природная аминокислота, неприродная аминокислота или аналог аминокислоты, или D- или L-стереоизомер аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления изобретения дополнительная аминокислотная модификация представляет собой консервативную аминокислотную замену, например, замену между Ala/Gly, Ser/Thr, Glu/Asp, Gln/Asn, Ala/Val/Ile/Leu, Arg/Lys, Phe/Tyr и т.п.

Вариант эксендина можно получить рядом способов, известных в данной области, включая, например, рекомбинантные способы получения, химический синтез и т.д.

В варианте осуществления изобретения вариант эксендина синтезирован с помощью твердофазного пептидного синтеза и затем очищен в лабораторном масштабе, например, одностадийной очисткой на обращенно-фазовой ВЭЖХ-колонке или другими подходящими хроматографическими способами.

В другом варианте осуществления изобретения вариант эксендина получают рекомбинантным способом, включающим, например, экспрессию в соответствующих прокариотических или эукариотических клетках, а затем вариант эксендина по настоящему изобретению выделяют стандартными методиками. Например, сначала химически синтезируют нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид, и последовательность клонируют в соответствующий экспрессионный вектор для экспрессии под контролем соответствующего промотора. В альтернативном варианте нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант эксендина, можно получить из эксендина дикого типа с помощью мутагенеза, такого как ПЦР-мутагенез, а затем последовательность клонируют в соответствующий экспрессионный вектор для экспрессии под контролем соответствующего промотора. Эти методики входят в объем навыков опытного специалиста в данной области, а также в данной области существует множество методической литературы.

Подходящие эукариотические клетки-хозяева включают клетки млекопитающих, например, СНО, COS, НЕК 293, ВНК, SK-Hep и HepG2. Клетки предпочтительно выращивать в условиях, которые подходят для экспрессии варианта эксендина по настоящему изобретению. Относительно реагентов и условий для получения или выделения варианта эксендина по настоящему изобретению нет конкретных ограничений, и можно использовать любую известную или доступную в продаже систему. В предпочтительном варианте осуществления изобретения вариант эксендина получают способом, описанным в данной области.

Для получения эксендина и/или его варианта можно использовать многие экспрессионные векторы, которые можно выбрать из группы, состоящей из эукариотических и прокариотических экспрессионных векторов. Прокариотические экспрессионные векторы могут включать, например, плазмиды, такие как pRSET, pET и pBAD и т.п., в которых подходящие промоторы включают, например, промоторы lac, trc, trp, recA или araBAD и т.п. Эукариотические экспрессионные векторы включают (i) векторы, используемые для экспрессии в дрожжах, такие как рАО, pPIC, pYES, рМЕТ, в которых можно использовать промоторы, такие как АОХ1, GAP, GAL1, AUG1 и т.п.; (ii) векторы, используемые для экспрессии в клетках насекомых, такие как рМТ, рАс[delta], plB, pMIB, рВАС и т.п., в которых можно использовать промоторы, такие как РН, р10, МТ, Ас5, OplE2, gp64, polh и т.п.; и (iii) векторы, используемые для экспрессии в клетках млекопитающих, такие как pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3, pBPV и т.п., и векторы, полученные из вирусных систем, такие как вакциния-вирус, аденоассоциированный вирус, вирус герпеса, ретровирусы и т.п., в которых можно использовать промоторы, такие как CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV и β-актин. В предпочтительном варианте осуществления изобретения вариант эксендина экспрессируют в системе прокариотических или эукариотических клеток, и используют кодирующие последовательности после оптимизации кодонов. В предпочтительном варианте осуществления изобретения последовательность для экспрессии варианта эксендина содержит лидерный пептид и/или сигнальный пептид для облегчения секреции варианта эксендина из клеток во внеклеточное пространство с последующими выделением и очисткой. В другом предпочтительном варианте осуществления последовательность для экспрессии варианта эксендина не содержит лидерного и/или сигнального пептида. Вариант эксендина не секретируется во внеклеточное пространство, а его выделение и очистку осуществляют лизисом клеток.

Конъюгаты вариантов эксендина

Вариант эксендина можно конъюгировать с одной или несколькими полимерными молекулами, образующими конъюгат с вариантом эксендина. Используемый в настоящем изобретении «полимер» предпочтительно является физиологически приемлемым и включает полимеры, растворимые в водном растворе или суспензии, и не имеет отрицательных эффектов, таких как побочные эффекты, на млекопитающих после введения конъюгата полимера с эксендином в фармацевтически эффективном количестве. Для полимеров, которые можно использовать в настоящем изобретении, отсутствуют конкретные ограничения. Предпочтительно, чтобы полимеры имели от 2 до примерно 3000 повторяющихся звеньев. Полимерная молекула может быть выбрана из природных или синтетических полимеров, например, в том числе, но не ограниченных этим, полисахаридов, полиалкиленгликолей, например, полиэтиленгликоля (ПЭГ), полипропиленгликоля (ППГ), полиэтиленоксида (ПЭО), сополимера этиленгликоля и пропиленгликоля, поливинилового спирта и любой их комбинации. В предпочтительном варианте осуществления изобретения для модификации с помощью конъюгации в конъюгате варианта эксендина по настоящему изобретению используют одну или несколько молекул ПЭГ.

В настоящем изобретение полимер не ограничен конкретной структурой и может быть линейным (таким как алкокси-ПЭГ или бифункциональный ПЭГ), разветвленным или лучевым (вилкообразным ПЭГ или ПЭГ, соединенным с мономером полиатомного спирта), дендритным или иметь разлагаемую связь. Кроме того, внутренняя структура полимера может иметь любой тип организации, который может быть выбран из группы, состоящей из гомополимеров, чередующихся сополимеров, случайных сополимеров, блок-сополимеров, чередующихся терполимеров, случайных терполимеров и блок-тримеров. Полимер может дополнительно включать полиалкиленоксидные полимеры, полималеиновую кислоту и поли(D,L-аланин).

В некоторых вариантах осуществления изобретения полимером является полиэтиленгликоль (ПЭГ) или его производные, такие как метоксиполиэтиленгликоль (мПЭГ). Если не указано иное, то используемый в настоящем изобретении полиэтиленгликоль (ПЭГ) включает ПЭГ с концевыми гидроксильными группами и ПЭГ с другими концевыми группами. Указанные другие концевые группы включают, но не ограничены этим, алкокси-, циклоалкокси-, циклоалкилокси-, алкенил-, арилокси- или арилалкилоксигруппы. Такие молекулы ПЭГ широко известны в данной области и обычно используются при модификации полипептидов. Боковые цепи ПЭГ могут быть линейными, разветвленными, вилкообразными или лучевыми. Различные полиэтиленгликоли могут иметь различную длину полимерной цепи и различную полимерную структуру.

Молекулярный вес ПЭГ, используемого в настоящем изобретении, конкретно не ограничен, и может находиться в диапазоне от 0,1 до 200 кДа, например, от 1 до 150 кДа, от 2 до 100 кДа, от 3 до 80 кДа или от 4 до 50 кДа, а также может находиться в диапазоне от 5 до 40 кДа. Особенно пригодный ПЭГ имеет молекулярный вес в диапазоне от 5 до 30 кДа. Некоторые другие пригодные молекулы ПЭГ включают ПЭГ, раскрытые, например, в WO 03/040211, US 6566506, US 6864350 и US 6455639. В частности, ПЭГ имеет общую формулу НО-СН2СН2О-(СН2СН2О)n-СН2СН2-ОН, в которой n находится в диапазоне от 5 до 4000. Как описано выше, ПЭГ, используемый в настоящем изобретении, включает ПЭГ с другими концевыми группами, например, метоксиПЭГ, разветвленный ПЭГ и вилкообразный ПЭГ. Соответствующий разветвленный ПЭГ можно получить, как описано в патенте США № 5932462, полное содержание которого включено в настоящий документ путем ссылки. Разветвленный ПЭГ представляет собой ПЭГ, который разветвлен на участке рядом с концом полимерной цепи, и основная цепь разветвленного ПЭГ может быть линейной или разветвленной.

Опытному специалисту в данной области известно, что в случае биологически активных молекул, конъюгированных с молекулами полимеров, биологическая активность конъюгированной молекулы снижается с повышением молекулярного веса полимерной молекулы (Bailon et al. Rational design of potent, long-lasting form of interferon: A 40 kDa branched polyethylene glycol-conjugated interferon α-2a for the treatment of hepatitis C. Bioconjugate Chem. 2001; 12:195-202; Bowen et al. Relationship between molecular weight and duration of activity of polyethylene glycol conjugated granulocyte colony-stimulating factor mutein. Experimental Hematology 1999; 27:425-32; Bailon et al. PEG-modified biopharmaceuticals. Expert Opin Deliv. 2009; 6:1-16). Также опытному специалисту известно, что биологический период полужизни и/или период полужизни в плазме увеличиваются с увеличением молекулярного веса полимерных молекул.

Однако неожиданно было обнаружено, что в настоящем изобретении конъюгат варианта эксендина по настоящему изобретению все еще сохраняет большую часть активности агониста рецептора GLP-1 (например, in vivo активности) по сравнению с неконъюгированным вариантом эксендина даже при увеличении молекулярного веса полимерной молекулы (такой как ПЭГ) до 30 кДа. Даже при увеличении молекулярного веса молекулы ПЭГ до 40 кДа или более конъюгат варианта эксендина по настоящему изобретению все еще сохраняет существенную активность агониста рецептора GLP-1 (например, in vivo активность). В частности, при увеличении молекулярного веса полимерной молекулы с 5 кДа до 27 кДа, активность конъюгата варианта эксендина как агониста рецептора GLP-1, по существу, остается такой же, как для неконъюгированного варианта эксендина.

Для обеспечения стабильного терапевтического эффекта в течение длительного времени и снижения частоты дозирования для улучшения соблюдения пациентами режима лечения желательно максимально увеличить биологический период полужизни конъюгата варианта эксендина, сохраняя при этом значительную активность агониста рецептора GLP-1. Соответственно, в варианте осуществления настоящее изобретение относится к конъюгату варианта эксендина с увеличенным биологическим периодом полужизни и значительной активностью агониста рецептора GLP-1.

В конкретном варианте осуществления изобретения молекулярный вес одной или нескольких полимерных молекул (таких как ПЭГ) в конъюгате варианта эксендина составляет от 2 кДа до 50 кДа, предпочтительно, от 3 кДа до 40 кДа, более предпочтительно, от 4 кДа до 35 кДа, еще более предпочтительно, от 5 кДа до 30 кДа, например, 5 кДа, 10 кДа, 15 кДа, 20 кДа, 30 кДа и 40 кДа, а также любое значение между вышеуказанными значениями молекулярного веса. Следует отметить, что если не указано иное, то молекулярный вес полимерных молекул, конъюгированных с конъюгатом варианта эксендина, вычисляют как общий молекулярный вес всех конъюгированных полимерных молекул в конъюгате, если конъюгат содержит более одной конъюгированной полимерной молекулы.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения молекулярный вес одной или нескольких полимерных молекул (таких как ПЭГ) в конъюгате варианта эксендина составляет от 20 кДа до 30 кДа, предпочтительно, от 21 кДа до 29 кДа, более предпочтительно, от 23 кДа до 27 кДа, например, 20 кДа, 21 кДа, 22 кДа, 23 кДа, 24 кДа, 25 кДа, 26 кДа, 27 кДа, 28 кДа, 29 кДа, 30 кДа, а также любое значение между вышеуказанными значениями молекулярного веса.

В данной области известно, что полимер, используемый в настоящем изобретении, можно получить различными средствами, в том числе, с помощью коммерческих фирм, таких как CarboMer Ink., J.T. Baker, The Dow Chemical Company и т.п.; в альтернативном варианте его можно получить способами, известными в данной области, такими как описанные в ЕР1245608. Настоящее изобретение не ограничено полимерами, полученными какими-либо конкретными способами.

В конъюгате по настоящему изобретению по меньшей мере один полимер может быть присоединен к эксендину через аминогруппу, карбоксильную группу, гидроксильную группу и/или тиольную группу и т.п. в эксендине. Такие группы часто расположены в α-амино, α-карбокси и боковых группах аминокислотных остатков, таких как лизин, аспартат, глутамат, цистеин и т.д.

В некоторых вариантах осуществления изобретения одна или несколько молекул полимера соединены с вариантом эксендина через тиольную группу цистеина в варианте эксендина. Модификация полимером, таким как полиэтиленгликоль, тиола из остатка цистеина в белках может увеличить избирательность процесса модификации, поскольку существует ряд реагентов, специфично реагирующих с тиольной группой, а в белке подходящие для модификации тиольные группы встречаются гораздо реже свободных аминогрупп, например, из остатков лизина.

Соответственно, в предпочтительном варианте осуществления изобретения одна или несколько молекул полимера могут быть конъюгированы с остатком цистеина в варианте эксендина, более предпочтительно, конъюгированы с остатком цистеина в варианте эксендина через тиоэфирную связь.

Предпочтительно, чтобы эксендин имел одну или несколько цистеиновых замен в позициях, соответствующих позиции 20, позиции 25, позиции 35 и/или позиции 39 эксендина-3 или эксендина-4 дикого типа, и вариант эксендина был присоединен к полимеру, такому как полиэтиленгликоль, через тиольную группу. Более предпочтительно, чтобы вариант эксендина имел цистеиновые замены в позициях, соответствующих позиции 35 и/или позиции 39 эксендина-3 или эксендина-4 дикого типа. Наиболее предпочтительно, чтобы вариант эксендина имел цистеиновую замену в позиции, соответствующей позиции 39 эксендина-3 или эксендина-4 дикого типа.

В конкретном варианте осуществления изобретения молекула полимера конъюгирована с остатком цистеина в варианте эксендина по настоящему изобретению через тиоэфирную связь. Например, в случае молекулы полиэтиленгликоля с малеимидной активирующей группой тиоэфирная связь может быть образована алкенилом малеимида и тиолом цистеина для конъюгации одной или нескольких молекул полиэтиленгликоля с остатком цистеина в варианте эксендина по настоящему изобретению. В некоторых других вариантах осуществления изобретения ПЭГилирование остатков цистеина можно проводить, например, с использованием ПЭГ-винилсульфона, ПЭГ-йодацетамида или ПЭГ-пиридиндисульфида. В данной области существует ряд способов конъюгации молекул полимеров, таких как ПЭГ, с полипептидами, и все эти способы можно использовать в настоящем изобретении.

Используемые в настоящем документе термины «ПЭГилированный эксендин», «ПЭГ-модифицированный эксендин» или «ПЭГ-конъюгат варианта эксендина» включают вариант эксендина, конъюгированный с одной или несколькими молекулами ПЭГ. Используемые в настоящем документе термины «ПЭГилирование» или «ПЭГ-модификация» включают конъюгацию одной или нескольких молекул ПЭГ с эксендином. Подходящий способ ПЭГилирования раскрыт, например, в US 5122614 и US 5539063, в которых все раскрытые способы ПЭГилирования полностью включены в настоящий документ путем ссылки.

В некоторых вариантах осуществления изобретения конъюгат имеет структуру нижеследующей формулы I

в которой эксендин представляет собой вариант эксендина по настоящему изобретению, Y является Н или RPEG-Х-, и каждый из Х и Z, независимо, представляют собой линкер, PEG представляет собой -(ОСН2СН2)n-, n является положительным целым числом, R представляет концевую группу ПЭГ, предпочтительно, каждый R независимо выбран из группы, состоящей из водорода, алкила, циклоалкила, циклоалкилалкила, алкенила, арила или арилалкила.

В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения алкил может быть С1-С6-алкилом, предпочтительно, С1-С4-алкилом, таким как метил, этил, N-пропил, изопропил, бутил, изобутил и трет-бутил; циклоалкил может быть С3-С7-циклоалкилом, таким как циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил и циклогептил; циклоалкилалкил может быть циклоалкил-С1-С4-алкилом, таким как циклоалкилметил и циклоалкилэтил, включая циклогексилметил и циклогексилэтил, и т.п.; арил может быть фенилом, метилфенилом и нафтилом, и т.п.; арилалкил может быть фенилметилом, фенилэтилом и нафтилметилом, нафтилэтилом, и т.п. В данной области известны молекулы ПЭГ с различными концевыми группами, и при желании можно выбрать их или другие молекулы ПЭГ. Молекулы ПЭГ с требуемой концевой группой можно при необходимости синтезировать известными способами.

В некоторых вариантах осуществления изобретения каждый элемент «RPEG-» в описанной формуле I независимо имеет следующую структуру:

в которой k и n являются целыми числами, k=0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6; n=40, 41,..., 45, 46, 47, 48,......, 1200.

В некоторых других предпочтительных вариантах осуществления изобретения каждый элемент «RPEG-» в формуле (I) независимо имеет следующую структуру:

в которой k и n являются целыми числами, k=0, 1, 2 или 3; n=40, 41,..., 45, 46, 47, 48,......, 1200.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения каждый элемент «-Х-» в формуле (I) независимо имеет следующую структуру:

в которой p и m являются целыми числами, p=0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12; m=0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12.

В некоторых других вариантах осуществления изобретения каждый элемент «-Х-» в формуле (I) независимо имеет следующую структуру:

в которой p и m являются целыми числами, p = 0, 1, 2, 3, 4 или 5; m = 0, 1, 2, 3 или 4.

В некоторых других вариантах осуществления изобретения каждый элемент «-Z-эксендин» в формуле (I) независимо имеет следующую структуру:

Предпочтительно «-Z-эксендин» в формуле (I) имеет следующую структуру:

в которой i, j, q, w являются целыми числами, i=0 или 1; j=1, 2, 3, 4, 5 или 6; q=1, 2, 3, 4, 5 или 6; w=1, 2, 3, 4, 5 или 6.

Конъюгаты варианта эксендина по настоящему изобретению можно синтезировать любым подходящим способом. В данной области известен ряд способов конъюгации полимеров с белками или пептидами, включая инкубацию полимеров (предпочтительно, активированных полимеров) с вариантом эксендина по настоящему изобретению. В варианте осуществления изобретения полимером является полиэтиленгликоль, который можно активировать и конъюгировать с вариантом эксендина, например, цианобромидным способом, карбонилдиимидазольным способом, N-гидроксисукцинимидным способом, цианурхлоридным способом и т.п. В качестве альтернативного варианта ПЭГ можно специфично конъюгировать с тиолом остатка цистеина в варианте эксендина, используя ПЭГ-винилсульфон, ПЭГ-йодацетамид или ПЭГ-пиридиндисульфид.

В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения активированный ПЭГ можно инкубировать с вариантом эксендина по настоящему изобретению при нижеследующих условиях: реакцию проводят в течение 0,5-12 ч при рН 5,0-7,0, молярном соотношении ПЭГ к пептиду 1-10, температуре 0-50°С, например, 2-40°С или 4-37°С.

После проведения реакции конъюгации конъюгат можно выделить подходящими способами. Подходящие способы включают, например, ультрафильтрацию, диализ или хроматографию, и т.п., причем все эти способы входят в объем навыков опытного специалиста в данной области.

Фармацевтическая композиция

Вариант эксендина и/или конъюгат варианта эксендина по настоящему изобретению можно применять для различных целей, включая, например, снижение уровня глюкозы в крови. Поэтому настоящее изобретение дополнительно относится к фармацевтической композиции для снижения уровня глюкозы в крови, включающей терапевтически эффективное количество варианта эксендина и/или конъюгата варианта эксендина по настоящему изобретению, а также, необязательно, фармацевтически приемлемый носитель. Предпочтительно, чтобы фармацевтическая композиция была пригодна для лечения диабета, более предпочтительно, диабета 1 и/или 2 типа, в частности, предпочтительно, для лечения диабета 2 типа.

Терапевтически эффективное количество варианта эксендина и/или конъюгата варианта эксендина по настоящему изобретению зависит от пути введения, типа субъекта и физиологических параметров конкретного рассматриваемого млекопитающего. Опытному специалисту хорошо известны эти факторы и взаимосвязь между ними, а также конкретное количество в определенном случае. Количество и путь введения можно подбирать для достижения оптимального эффекта, приводящего в результате к доставке пептидов субъекту. Однако все это зависит от известных факторов, таких как вес тела, питание, сопутствующие лекарственные препараты и других факторы, хорошо известные опытному медику.

Фармацевтическую композицию можно вводить в комбинированной схеме лечения, то есть фармацевтическую композицию вводят в комбинации с одним или несколькими другими лекарственными препаратами, причем их вводят совместно или поочередно. В других вариантах осуществления изобретения указанные другие лекарственные препараты можно вводить перед введением, в течение или после введения одного или нескольких из варианта эксендина и/или конъюгата варианта эксендина по настоящему изобретению, или другой фармацевтической композиции. Указанные другие лекарственные препараты, пригодные в настоящем изобретении, включают, например, лекарственные препараты для снижения уровня глюкозы в крови, такие как инсулин, аналоги инсулина, агонисты декстрина и холецистокинин, и/или другие соединения или композиции, которые используются для лечения заболеваний. Предпочтительно, чтобы такое комбинированное введение давало комбинированный или даже синергетический эффект.

Используемые в настоящем документе термины «фармацевтически приемлемый носитель» или «физиологически приемлемый носитель» можно использовать взаимозаменяемо, и они включают одну или несколько из всех без исключения физиологически совместимых солей, растворителей, дисперсионных сред, покрытый, антибактериальных агентов и противогрибковых агентов, изотонических агентов и задерживающих всасывание агентов, и т.п. В некоторых вариантах осуществления изобретения носитель подходит для внутривенного, внутримышечного, подкожного, спинномозгового или кожного введения (например, с помощью инъекций или инфузий). В зависимости от пути введения терапевтический агент может быть покрыт некоторыми материалами для защиты терапевтического агента от кислот или другого природного окружения, которые могут инактивировать терапевтический агент.

При введении фармацевтический состав по настоящему изобретению вводят в фармацевтической композиции в фармацевтически приемлемом количестве. Термин «фармацевтически приемлемый» означает нетоксичные вещества, которые не нарушают биологическую активность действующих компонентов. Состав всегда содержит соли, буферы, консерванты, совместимый носитель и, необязательно, другие терапевтические агенты, такие как дополнительные усилители иммунного ответа, в том числе адъюванты, хемокины и цитокины. Для использования в лекарственном препарате соль должна быть фармацевтически приемлемой, а соли, которые не подходят для фармацевтического применения, можно использовать при получении фармацевтически приемлемой соли, поэтому они не исключены из объема настоящего изобретения.

При необходимости вариант эксендина или конъюгат варианта эксендина по настоящему изобретению можно объединить с фармацевтически приемлемым носителем. Используемый в настоящем документе термин «фармацевтически приемлемый носитель» означает один или несколько из совместимых твердых или жидких наполнителей, разбавителей или упаковочных материалов, которые подходят для применения у млекопитающих, например у человека. Термин «носитель» представляет органические или неорганические, природные или синтетические компоненты, которые объединены с действующими компонентами для облегчения применения. Компоненты фармацевтической композиции также могут быть смешаны в форме, в которой отсутствует взаимодействие, значительно нарушающее требуемую эффективность лекарственного препарата.

Предпочтительно, чтобы фармацевтическая композиция по настоящему изобретению могла содержать буферную систему, и, предпочтительно, чтобы буферная система была ацетатным буферным раствором с рН от примерно 3,0 до примерно 6,0, или фосфатным буферным раствором с рН от примерно 5,0 до примерно 9,0. В некоторых определенных вариантах осуществления изобретения подходящий буфер включает ацетат, цитрат, борат, фосфат.

Необязательно, фармацевтическая композиция может также содержать подходящий консервант, такой как хлорид бензалкония; хлорид трет-бутиловый спирт; парабены и тимеросал.

Фармацевтическая композиция обычно может представлять собой стандартную дозу, и ее можно получить любым способом, хорошо известным в области фармацевтики. Все способы включают стадию объединения действующего агента с носителем, и носитель содержит один или несколько вспомогательных компонентов. В общем, действующий агент и жидкий носитель, тонко измельченный твердый носитель или оба носителя тщательно смешивают для получения композиции и, при необходимости, потом придают продукту форму.

Фармацевтическая композиция, которая подходит для парентерального введения, может представлять собой асептический водный или неводный состав, содержащий один или несколько вариантов эксендина или конъюгатов вариантов эксендина. В некоторых вариантах осуществления изобретения состав является изотоничным относительно крови субъектов. Для получения состава по известным способам можно использовать подходящий дисперсионный агент или увлажняющий агент и суспендирующий агент. Асептический состав для инъекций также может представлять собой асептический раствор или асептическую суспензию для инъекций в нетоксичном подходящем для парентерального введения в разбавителе или растворителе, например, раствор в 1,3-бутандиоле. Приемлемые носители и растворители, которые пригодны для использования, включают воду, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, в качестве растворителя или суспензионной среды часто используется асептическое нелетучее масло. Соответственно, можно использовать любое легкое нелетучее масло, включая синтетические моноглицериды или диглицериды. Кроме того, в составе для инъекций можно использовать жирные кислоты, такие как олеиновая кислота. Состав носителей, подходящих для перорального, подкожного, внутривенного, внутримышечного и т.п. введения можно найти в Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA.

Вариант эксендина или конъюгат варианта эксендина по настоящему изобретению можно получить совместно с носителем, таким как состав с контролируемым высвобождением соединений (включая импланты, трансдермальные пластыри и систему доставки в микрокапсулах), который защищает вариант эксендина или конъюгат варианта эксендина от быстрой деградации. Могут подойти биологически разлагаемые, биологически совместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. В данной области известен ряд способов для получения таких составов, см., например, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978 и т.п.

Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить любым удобным путем, включая инъекцию или постепенную инфузию. Например, введение можно осуществлять пероральным, внутривенным, внутрибрюшинным, внутримышечным, внутриполостным, внутриопухолевым или трансдермальным путем.

Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению вводят в эффективном количестве. Эффективное количество представляет собой количество любого варианта эксендина или конъюгата варианта эксендина, приведенного в настоящем документе, которое вызывает желаемый ответ (например, снижает уровень глюкозы в крови субъекта) отдельно или совместно с другим терапевтическим агентом. Этот эффект может включать только временную задержку развития диабета, и в качестве альтернативы, в некоторых вариантах осуществления изобретения этот эффект может включать полную остановку развития диабета.

Такое количество безусловно зависит от конкретного заболевания, против которого проводится лечение, тяжести течения заболевания, персональных параметров пациентов (в том числе возраста, физиологического состояния, роста и веса), длительности лечения, свойств проводимого одновременно лечения (при наличии такового), определенных путей введения и аналогичных факторов, известных медицинским работникам. Эти факторы хорошо известны опытному специалисту, и их легко получить с помощью обычных экспериментов. В общем, предпочтительно использовать максимальную дозу каждого компонента или их комбинации, то есть наибольшую безопасную дозу, определенную в соответствии с медицинской целесообразностью. Однако опытный специалист будет понимать, что для пациента может потребоваться более низкая доза или допустимая доза по медицинским, физиологическим или любым другим причинам.

Предпочтительно, чтобы фармацевтическая композиция, используемая в вышеуказанных способах, была асептической и содержала эффективное количество варианта эксендина или конъюгата варианта эксендина, по весу или по объему подходящее для введения пациентам, которое отдельно или объединенное с другим составом вызывает в организме требуемый ответ, такой как снижение уровня глюкозы в крови.

Вводимую субъектам дозу варианта эксендина или конъюгата варианта эксендина можно выбрать в соответствии с различными параметрами, в частности, в соответствии с используемым путем введения и состоянием субъекта. Другие факторы включают требуемую длительность лечения. Если ответ субъекта недостаточен при используемой исходной дозе, то можно использовать более высокую дозу в диапазоне, допустимом степенью переносимости пациента (или можно повысить эффективную дозу за счет другого пути введения (более локального)).

В некоторых вариантах осуществления изобретения фармацевтическая композиция содержит 0,20 мг/мл ~ 5 мг/мл варианта эксендина и/или содержит 4 мг/мл ~ 40 мг/мл конъюгата варианта эксендина, предпочтительно 0,20 мг/мл ~ 5 мг/мл варианта эксендина и/или 4 мг/мл ~ 40 мг/мл конъюгата варианта эксендина, более предпочтительно 0,5 мг/мл ~ 2 мг/мл варианта эксендина и/или 10 мг/мл ~ 20 мг/мл конъюгата варианта эксендина. В общем, диапазон дозировок варианта эксендина или конъюгата варианта эксендина по настоящему изобретению может составлять от примерно 10 мкг/кг веса тела пациента до примерно 100000 мкг/кг веса тела пациента. В некоторых вариантах осуществления изобретения диапазон дозировок может составлять от примерно 0,1 мг/кг до примерно 20 мг/кг. В других вариантах осуществления изобретения диапазон дозировок может составлять от примерно 0,1 мг/кг до примерно 5 мг/кг, от 0,1 мг/кг до 10 мг/кг или от 0,1 мг/кг до 15 мг/кг. В других вариантах осуществления изобретения диапазон дозировок может составлять от примерно 1 мг/кг до 5 мг/кг, от 5 мг/кг до 10 мг/кг, от 10 мг/кг до 15 мг/кг или от 15 мг/кг до 20 мг/кг. В других вариантах осуществления изобретения дозировка может составлять примерно 0,1 мг/кг, 0,5 мг/кг, 1 мг/кг, 2 мг/кг, 3 мг/кг, 5 мг/кг, 7 мг/кг, 10 мг/кг, 12 мг/кг, 15 мг/кг, 17 мг/кг, 20 мг/кг, 25 мг/кг или 30 мг/кг. В другом варианте осуществления изобретения дозировка может составлять примерно 1 мг/кг, 3 мг/кг, 5 мг/кг или 6 мг/кг. В зависимости от композиции дозировку можно вводить непрерывно (например, с помощью непрерывного насоса) или периодически. В некоторых вариантах осуществления изобретения при внутривенном введении дозировка варианта эксендина или конъюгата варианта эксендина по настоящему изобретению может составлять от 0,1 до 20 мг/кг или может равняться любому значению в этом интервале. Опытный специалист без проведения дополнительных экспериментов может определить желаемый интервал между многократным введением конкретной композиции. Опытному специалисту известны другие схемы введения композиций, описанных в настоящем документе, в которых доза, схема, место, путь введения и т.д. могут отличаться от описанных выше. В варианте осуществления изобретения дозировку вводят внутривенно. В другом варианте осуществления изобретения протокол введения представляет собой введение дозировки с помощью внутривенного болюса.

Также в объем настоящего изобретения входит набор, содержащий вариант эксендина или конъюгат варианта эксендина (например, в фармацевтической композиции) и инструкцию. Набор может дополнительно содержать по меньшей мере один другой реагент, например, один или несколько лекарственных препаратов для снижения уровня глюкозы в крови. В другом варианте осуществления изобретения набор может содержать основание, разделенное для плотной фиксации контейнеров или наборов контейнеров (таких как пробирки, тюбики, флаконы, бутыли, шприцы и т.п.). Компоненты набора могут быть упакованы в водной среде или могут находиться в лиофилизированной форме.

Композиция, описанная в настоящем изобретении, может быть лиофилизированной или может находиться в водной среде.

Предпочтительно, чтобы субъект был позвоночным. Более предпочтительно, чтобы субъект был млекопитающим. Наиболее предпочтительно, чтобы субъект был человеком. Однако субъект может быть животным, таким как животное-компаньон (например, собака, кошка и т.п.), домашнее животное (например, крупный рогатый скот, овцы, свиньи, лошади и т.п.) или лабораторное животное (например, обезьяна, крыса, мышь, кролик, морская свинка и т.п.).

Вариант эксендина и/или конъюгат варианта эксендина по настоящему изобретению можно применять индивидуально. Однако их предпочтительно применять в виде фармацевтической композиции, которая всегда содержит подходящие фармацевтические вспомогательное вещество, разбавитель или носитель, выбранные в зависимости от предполагаемого пути введения. Их можно применять у пациентов/субъектов, нуждающихся в этом, с помощью любых подходящих средств. Точная дозировка будет зависеть от различных факторов, включая точные характеристики варианта эксендина и конъюгата варианта эксендина.

Некоторые подходящие пути введения включают (но не ограничены ими) пероральное, ректальное, назальное, местное (включая буккальное и сублингвальное), подкожное, вагинальное или парентеральное (включая подкожное, внутримышечное, внутривенное, интрадермальное, интратекальное и эпидуральное) введение.

В некоторых вариантах осуществления изобретения фармацевтическая композиция по настоящему изобретению содержит изотонический агент и/или консервант, предпочтительно, чтобы изотоническим раствором были одно соединение или несколько из сахарозы, маннита, хлорида натрия и глицерина, а консервант был выбран из группы, состоящей из м-крезола, бензилового спирта, метил-п-гидроксибензоатпарабенов, этил-п-гидроксибензоата, пропил-п-гидроксибензоата и бутил-п-гидроксибензоата. Опытный специалист в данной области способен получить подходящий раствор варианта эксендина или конъюгата варианта эксендина по настоящему изобретению, используя, например, изотоническое вспомогательное вещество, такое как физиологический раствор, раствор Рингера или раствор Рингера-лактат и т.п. При необходимости можно добавить стабилизирующий агент, буферный агент, антиоксидант и/или другую добавку. Фармацевтическая композиция для перорального введения может находиться в форме таблетки, капсулы, порошка или жидкости, и т.п. Таблетка может содержать твердый носитель, такой как желатин, или адъювант. Жидкая фармацевтическая композиция всегда содержит жидкий носитель, такой как вода, вазелин, животное масло или растительное масло, минеральное масло или синтетическое масло. Она также может содержать физиологический раствор, раствор глюкозы или другого углевода, или двухатомные спирты, такие как этиленгликоль, пропиленгликоль или полиэтиленгликоль. В некоторых вариантах осуществления изобретения фармацевтическая композиция представляет собой жидкий состав и/или лиофилизированный состав. Предпочтительно, чтобы лиофилизированный состав содержал защитный агент при лиофилизации. Более предпочтительно, чтобы защитный агент при лиофилизации был выбран из группы, состоящей из сахарозы, лактозы, маннита, трегалозы и других углеводов.

Вариант эксендина и/или конъюгат варианта эксендина предпочтительно вводить субъектам в «терапевтически эффективном количестве» или «эффективном количестве». Композицию предпочтительно вводить субъектам в «терапевтически эффективном количестве», а «терапевтически эффективного количества» или «эффективного количества» достаточно для проявления эффекта композиции у субъектов. Фактическое количество вводимой композиции и скорость и процесс введения будут зависеть от состояния и тяжести заболевания субъектов, которых будут лечить. Лечение (например, определение дозировки и т.п.) назначается медицинскими специалистами с учетом заболеваний, против которых предполагается проводить лечение, индивидуального состояния пациентов, места введения соединения, способа введения и других факторов, известных лечащему врачу.

В некоторых вариантах осуществления изобретения диапазон дозировок для варианта эксендина и/или конъюгата варианта эксендина может составлять от 30 мг/кг веса тела в день до 0,00001 мг/кг веса тела в день, или от 3 мг/кг/день до 0,0001 мг/кг/день, или от 0,3 мг/кг/день до 0,01 мг/кг/день.

Настоящее изобретение дополнительно относится к способу лечения заболевания, включающему введения терапевтически эффективного количества варианта эксендина и/или конъюгата варианта эксендина нуждающимся в этом субъектам. В некоторых вариантах осуществления изобретения заболевание выбрано из группы, состоящей из постпрандиального демпинг-синдрома, постпрандиальной гипергликемии, непереносимости глюкозы, ожирения, расстройств питания, синдрома инсулинорезистентности, диабета и гипергликемии. В предпочтительном варианте осуществления изобретения заболеванием является диабет 2 типа.

Как хорошо известно, эксендин может снижать вес тела пациентов с ожирением и может вызывать тошноту и рвоту, причем механизм действия эксендина связан с ингибированием пищевого центра и активацией рвотного центра в центральной нервной системе (Larsen. Mechanisms behind GLP-1 induced weight loss. Br. J. Diabetes Vasc. Dis. 2008; 8: S34-S41; Schick et al. Glucagonlike peptide 1 (7-36)-amide acts at lateral and medial hypothalamic sites to suppress feeding in rats. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 2003; 284: R1427-35). Благодаря увеличившемуся молекулярному весу конъюгаты эксендина или его вариантов не могут пересечь гематоэнцефалический барьер и поэтому меньше вызывают рвоту по сравнению с эксендином. Соответственно, перед началом настоящего изобретения автор ожидал, что конъюгаты эксендина или его вариантов также будут уменьшать эффекты эксендина в отношении снижения потребления пищи и веса тела, опосредованные центральной нервной системой. Однако автор неожиданно обнаружил, что конъюгаты эксендина или его вариантов значительно увеличивали эффекты снижения веса тела и потребления пищи, несмотря на то, что эксендин дикого типа и неконъюгированный вариант эксендина, оба, снижали вес тела и потребление пищи.

Поэтому в другом аспекте настоящее изобретение относится к способу снижения веса тела с использованием конъюгатов эксендина или его вариантов, и/или содержащей их фармацевтической композиции. Кроме того, настоящее изобретение также относится к применению конъюгатов эксендина или его вариантов, и/или содержащей их фармацевтической композиции в изготовлении лекарственного препарата для снижения веса тела. В варианте осуществления изобретения конъюгаты эксендина или его вариантов представляют собой конъюгат варианта эксендина по настоящему изобретению, описанный выше.

Настоящее изобретение далее проиллюстрировано примерами, которые никоим образом не следует считать ограничительными. Все цитируемые в настоящей заявке ссылки (включая документы, выданные патенты, опубликованные патентные заявки и патентные заявки, одновременно находящиеся на рассмотрении) ясно включены в настоящий документ в полном объеме. Реагенты и материалы, используемые в примерах ниже, являются доступными в продаже продуктами, которые по меньшей мере имеют аналитическую степень чистоты (или аналогичный уровень чистоты).

ПРИМЕРЫ

Порядковые номера и краткое описание используемых в примерах эксендинов, вариантов эксендинов и их конъюгатов приведены в таблице ниже для облегчения понимания технических решений в нижеследующих примерах.

Порядковый номер Краткое описание
РВ-101 эксендин-4 дикого типа, также именуемый Эксенатид
РВ-102 эксендин-4, с заменой аминокислоты в 35-й позиции на Cys
РВ-103 эксендин-4, с заменой аминокислоты в 30-й позиции на Cys
РВ-104 эксендин-4, с заменой аминокислоты в 25-й позиции на Cys
РВ-105 эксендин-4, с заменой аминокислоты в 39-й позиции на Cys
РВ-106 РВ-105, конъюгированный с ПЭГ20000
РВ-106b РВ-105, конъюгированный с ПЭГ20000, двухлучевой ПЭГb
РВ-106c РВ-105, конъюгированный с ПЭГ20000, двухлучевой ПЭГc
РВ-106d РВ-105, конъюгированный с ПЭГ20000, двухлучевой ПЭГd
РВ-106e РВ-105, конъюгированный с ПЭГ20000, двухлучевой ПЭГe
РВ-107 РВ-105, конъюгированный с ПЭГ30000
РВ-108 РВ-105, конъюгированный с ПЭГ40000
РВ-109 РВ-105, конъюгированный с ПЭГ20000×2, двухлучевой ПЭГ
РВ-109b РВ-105, конъюгированный с ПЭГ20000×2, двухлучевой ПЭГb
РВ-109c РВ-105, конъюгированный с ПЭГ20000×2, двухлучевой ПЭГc
РВ-109d РВ-105, конъюгированный с ПЭГ20000×2, двухлучевой ПЭГd
РВ-110 РВ-105, конъюгированный с ПЭГ5000
РВ-110b РВ-105, конъюгированный с ПЭГ5000b
РВ-110c РВ-105, конъюгированный с ПЭГ5000c
РВ-111 РВ-105, Tyr добавлен на С-конце
РВ-112 РВ-111, конъюгированный с ПЭГ20000
РВ-113 РВ-105, Gly в позиции 2 замещен на dAla
РВ-114 РВ-113, конъюгированный с ПЭГ40000
РВ-119 РВ-105, конъюгированный с ПЭГ23000
РВ-120 РВ-105, конъюгированный с ПЭГ27000

Пример 1. Твердофазный синтез эксендина-4 и его вариантов

Полипептидный синтез является стандартной методикой в области биохимии и фармацевтики. Различные типы полипептидных синтезаторов доступны в продаже от ряда коммерческих организаций (таких как GE HealthCare, Applied Biosystems и т.п.), и многие коммерческие организации (такие как Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd., Shanghai Biocolor BioScience&Technology Company) предоставляют услуги по синтезу полипептидов. Например, полипептиды с определенной последовательностью можно синтезировать на полипептидном синтезаторе, используя следующую процедуру.

Эксендин-4 и его варианты с тиолом синтезировали, используя для защиты аминогруппы Fmoc-стратеги, а в качестве твердой подложки смолу Fmoc-Rinker Amide MBHA. Первая стадия: проводили реакцию с Fmoc-защищенной аминокислотой в растворителе N,N-метилформамиде (DMF) в течение 1-5 ч с использованием HBTU/DIPEA в качестве конденсирующего агента, а полноту прохождения реакции контролировали с помощью нингидриновой пробы. Вторая стадия: реакцию проводили в DMF с использованием 10-30%-го пиперидина в качестве агента для снятия защиты в течение 10-30 мин, а полноту снятия защиты с аминогруппы контролировали с помощью нингидриновой пробы. Третья стадия: повторяли первую и вторую стадию с использованием аминокислоты, соответствующей целевой полипептидной последовательности до присоединения последней аминокислоты в последовательности. Четвертая стадия: для отщепления полипептидов от твердой подложки и одновременно для снятия защиты проводили реакцию, используя TFA в качестве отщепляющего агента, в течение 1-5 ч. Пятая стадия: после отщепления раствор полипептида осаждали с использованием этилового эфира и отфильтровывали. Собирали фильтрат. Использовали хроматографию на колонке С18 для элюции раствором 0,1% TFA/ацетонитрила в воде в качестве подвижной фазы, и для получения продукта собирали и лиофилизировали фракции. Шестая стадия: чистоту продукта определяли с помощью ВЭЖХ, а структуру продукта определяли с помощью аминокислотного секвенирования и масс-спектрометрии.

Автор заявки заказал в биомедицинской научной компании Chengdu Kaijie синтез полипептидов по вышеуказанному способу с последовательностями, приведенными ниже:

РВ-101: эксендин-4 дикого типа со следующей аминокислотной последовательностью:

РВ-102: вариант эксендина-4 со следующей аминокислотной последовательностью, в которой в позиции 35 С-конца находится Cys:

РВ-105: вариант эксендина-4 со следующей аминокислотной последовательностью, в которой в позиции 39 С-конца находится Cys:

РВ-103: вариант эксендина-4 со следующей аминокислотной последовательностью, в которой в позиции 30 С-конца находится Cys:

РВ-104: вариант эксендина-4 со следующей аминокислотной последовательностью, в которой в позиции 25 С-конца находится Cys:

РВ-111: вариант эксендина-4 со следующей аминокислотной последовательностью, в которой позиция 39 С-конца замещена Cys и соединена с Tyr:

РВ-113: вариант эксендина-4 со следующей аминокислотной последовательностью, в которой Gly в позиции 2 N-конца замещен на dAla, и позиция 39 С-конца замещена на Cys:

В качестве примера на фиг.1 приведены результаты масс-спектрометрического анализа РВ-105: пик М+1 (масса + 1) для РВ-105 составляет 4203,3 Да, определенный с помощью MALDI-TOF-масс-спектрометрии, соответствует теоретической массе (4202,8).

Пример 2а. Получение и анализ РВ-110 (ПЭГ5000-РВ-105)

2,0 мг РВ-105 растворяли в 1 мл 20 мМ фосфатного буфера (рН 6,5), и 5 мг ПЭГ5000 (поставляемого PegBio Co., Ltd. (Suzhou), 5000 указывает на то, что молекулярный вес ПЭГ составляет 5 кДа, а молекулярная структура показана на фиг.2) взвешивали в соответствии с молярным соотношением ПЭГ к пептиду как 2:1 и добавляли к вышеуказанному раствору. Раствор соответственно качали для растворения ПЭГ и образования гомогенной смеси с пептидом. Реакцию проводили в течение 1 ч при 20°С и останавливали добавлением избытка раствора цистеина (0,1 мл 0,5 М раствора цистеина) и после хранили при -20°С для дальнейшей очистки.

Образец разводили в 5 раз в 50 мМ натрий-ацетатном буфере (рН 4,5) и наносили на SP-ионообменную хроматографическую колонку (колонку ХК16/20, macroCap SP packing, GE Inc.), уравновешенную 5 объемами колонки 50 мМ натрий-ацетатного буфера (рН 4,5). После наноса колонку уравновешивали двумя объемами колонки 50 мМ натрий-ацетатного буфера (рН 4,5), и буфер затем линейно меняли на 100%-ный буфер В (50 мМ натрий-ацетатный буфер (рН 4,5), содержащий 1 М NaCl) в 20 объемах колонки. Элюируемый пик собирали в AKTA Purifier. Было определено, что получен примерно 1 мг пептида.

Анализ проводили с использованием аналитической ВЭЖХ (Agilent 1200), оборудованной обращенно-фазовой аналитической колонкой С4 с размером пор 300 Е (Jupiter C4 300Е, 4,6×250 мм) в смеси 0,1%-ного водного раствора TFA и 0,1%-ного раствора TFA в ацетонитриле с градиентом от 61/39 до 54/46 за 10 мин. При анализе образца с помощью аналитической ВЭЖХ (Agilent 1200) время удерживания составляло 10,4 мин, а чистота - 100% (см. фиг.3). При использовании GPC-анализа (на хроматографе SHIMADZU LC-20AD с тремя колонками SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ) в 0,1 М растворе нитрата натрия элюцию проводили со скоростью 1,0 мл/мин, а чистота составляла 97%.

Пример 2b. Получение и анализ РВ-110b (ПЭГ5000b-РВ-105)

2,0 мг РВ-105 растворяли в 1 мл 20 мМ фосфатного буфера (рН 6,5), и 5 мг ПЭГ5000b (поставляемого PegBio Co., Ltd. (Suzhou), а молекулярная структура показана на фиг.4) взвешивали в соответствии с молярным соотношением ПЭГ к пептиду как 2:1 и добавляли к вышеуказанному раствору. Раствор соответственно качали для растворения ПЭГ и образования гомогенной смеси с пептидом. Другие стадии были аналогичны примеру 2а. В конце использовали GPC-анализ (на хроматографе SHIMADZU LC-20AD с тремя тандемными колонками SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ в 0,1 М растворе нитрата натрия, элюцию проводили со скоростью 1,0 мл/мин), а чистота была определена как 96,7%.

Пример 2с. Получение и анализ РВ-110с (ПЭГ5000с-РВ-102)

2,0 мг РВ-105 растворяли в 1 мл 20 мМ фосфатного буфера (рН 6,5), и 5 мг ПЭГ5000с (поставляемого PegBio Co., Ltd. (Suzhou), а молекулярная структура показана на фиг.5) взвешивали в соответствии с молярным соотношением ПЭГ к пептиду как 2:1 и добавляли к вышеуказанному раствору. Раствор соответственно качали для растворения ПЭГ и образования гомогенной смеси с пептидом. Другие стадии были аналогичны примеру 2а. В конце использовали GPC-анализ (на хроматографе SHIMADZU LC-20AD с тремя тандемными колонками SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ в 0,1 М растворе нитрата натрия, элюцию проводили со скоростью 1,0 мл/мин), а чистота была определена как 97,8%.

Пример 3а. Получение и анализ РВ-106 (ПЭГ20000-РВ-105)

2,0 мг РВ-105 растворяли в 1 мл 20 мМ фосфатного буфера (рН 6,5), и 5 мг ПЭГ20000 (поставляемого PegBio Co., Ltd. (Suzhou), 20000 указывает на молекулярный вес ПЭГ 20 кДа, а молекулярная структура показана на фиг.2) взвешивали в соответствии с молярным соотношением ПЭГ к пептиду как 2:1 и добавляли к вышеуказанному раствору. Раствор соответственно качали для растворения ПЭГ и образования гомогенной смеси с пептидом. Реакцию проводили в течение 1 ч при 20°C и останавливали добавлением избытка раствора цистеина (0,1 мл 0,5 М раствора цистеина) и после хранили при -20°C для очистки.

Образец разводили в 5 раз в 50 мМ натрий-ацетатном буфере (pH 4,5) и наносили на SP-ионообменную хроматографическую колонку (колонку ХК16/20, macroCap SP packing, GE Inc.), уравновешенную пятью объемами колонки 50 мМ натрий-ацетатного буфера (рН 4,5). После наноса колонку уравновешивали двумя объемами колонки 50 мМ натрий-ацетатного буфера (рН 4,5) и буфер затем линейно меняли на 100%-ный буфер В (50 мМ натрий-ацетатный буфер (рН 4,5), содержащий 1 М NaCl) в 20 объемах колонки. Элюируемый пик собирали в AKTA Purifier. Было определено, что получен примерно 1 мг пептида.

Собранный раствор анализировали с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ и окрашивания Кумасси бриллиантовым синим и йодом (см. фиг.6А и 6В). Элюцию проводили на обращенно-фазовой аналитической колонке С4 с размером пор 300 Е (Jupiter C4 300Е, 4,6×250 мм) в смеси 0,1%-ного водного раствора TFA и 0,1%-ного раствора TFA в ацетонитриле с градиентом от 61/39 до 54/46 за 10 мин. Анализ образца проводили с помощью аналитической ВЭЖХ (Agilent 1200), и время удерживания составляло 11,5 мин, а чистота - 100% (см. фиг.7). При использовании GPC-анализа (на хроматографе SHIMADZU LC-20AD с тремя тандемными колонками SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ) в 0,1 М растворе нитрата натрия элюцию проводили со скоростью 1,0 мл/мин, а чистота была определена как 98,9%.

Пример 3b. Получение и анализ РВ-106b (ПЭГ20000b-РВ-105)

1,0 мг РВ-105 растворяли в 1 мл 20 мМ фосфатного буфера (рН 6,5), и 2,5 мг ПЭГ20000b (поставляемого PegBio Co., Ltd. (Suzhou), 20000 указывает на то, что молекулярный вес ПЭГ составляет 20 кДа, а молекулярная структура показана на фиг.8) взвешивали в соответствии с молярным соотношением ПЭГ к пептиду как 2:1 и добавляли к вышеуказанному раствору. Раствор соответственно качали для растворения ПЭГ и образования гомогенной смеси с пептидом. Другие стадии были аналогичны примеру 3а. В конце использовали GPC-анализ (на хроматографе SHIMADZU LC-20AD с тремя тандемными колонками SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ) в 0,1 М растворе нитрата натрия, элюцию проводили со скоростью 1,0 мл/мин, а чистота была определена как 98,2%.

Пример 3с. Получение и анализ РВ-106с (ПЭГ20000с-РВ-105)

2,0 мг РВ-105 растворяли в 1 мл 20 мМ фосфатного буфера (рН 6,5), и 20 мг ПЭГ20000с (поставляемого PegBio Co., Ltd. (Suzhou), 20000 указывает на то, что молекулярный вес ПЭГ составляет 20 кДа, а молекулярная структура показана на фиг.9) взвешивали в соответствии с молярным соотношением ПЭГ к пептиду как 2:1 и добавляли к вышеуказанному раствору. Раствор соответственно качали для растворения ПЭГ и образования гомогенной смеси с пептидом. Другие стадии были аналогичны примеру 3а. В конце использовали GPC-анализ (на хроматографе SHIMADZU LC-20AD с тремя тандемными колонками SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ) в 0,1 М растворе нитрата натрия, элюцию проводили со скоростью 1,0 мл/мин, а чистота была определена как 97,2%.

Пример 3d. Получение и анализ РВ-106d (ПЭГ20000d-РВ-105)

2,0 мг РВ-105 растворяли в 1 мл 20 мМ фосфатного буфера (рН 6,5), и 20 мг ПЭГ20000с (поставляемого PegBio Co., Ltd. (Suzhou), 20000 указывает на то, что молекулярный вес ПЭГ составляет 20 кДа, а молекулярная структура показана на фиг.10) взвешивали в соответствии с молярным соотношением ПЭГ к пептиду как 2:1 и добавляли к вышеуказанному раствору. Раствор соответственно качали для растворения ПЭГ и образования гомогенной смеси с пептидом. Другие стадии были аналогичны примеру 3а. В конце использовали GPC-анализ (на хроматографе SHIMADZU LC-20AD с тремя тандемными колонками SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ) в 0,1 М растворе нитрата натрия, элюцию проводили со скоростью 1,0 мл/мин, а чистота была определена как 97,5%.

Пример 3е. Получение и анализ РВ-106е (ПЭГ20000е-РВ-105)

2,0 мг РВ-105 растворяли в 1 мл 20 мМ фосфатного буфера (рН 6,5), и 20 мг ПЭГ20000е (поставляемого PegBio Co., Ltd. (Suzhou), 20000 указывает на то, что молекулярный вес ПЭГ составляет 20 кДа, а молекулярная структура показана на фиг.11) взвешивали в соответствии с молярным соотношением ПЭГ к пептиду как 2:1 и добавляли к вышеуказанному раствору. Раствор соответственно качали для растворения ПЭГ и образования гомогенной смеси с пептидом. Другие стадии были аналогичны примеру 3а. В конце использовали GPC-анализ (на хроматографе SHIMADZU LC-20AD с тремя тандемными колонками SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ) в 0,1 М растворе нитрата натрия, элюцию проводили со скоростью 1,0 мл/мин, а чистота была определена как 95,8%.

Пример 3f. Получение и анализ РВ-112 (ПЭГ20000-РВ-111)

2,0 мг РВ-111 растворяли в 1 мл 20 мМ фосфатного буфера (рН 6,5), и 19 мг ПЭГ20000 (поставляемого PegBio Co., Ltd. (Suzhou), 20000 указывает на молекулярный вес ПЭГ 20 кДа, а молекулярная структура показана на фиг.2) взвешивали в соответствии с молярным соотношением ПЭГ к пептиду как 2:1 и добавляли к вышеуказанному раствору. Раствор соответственно качали для растворения ПЭГ и образования гомогенной смеси с пептидом. Реакцию проводили в течение 1 часа при 20°С и останавливали добавлением избытка раствора цистеина (0,1 мл 0,5 М раствора цистеина) и после хранили при -20°С для очистки.

Образец разводили в 5 раз в 50 мМ натрий-ацетатном буфере (рН 4,5) и наносили на SP-ионообменную хроматографическую колонку (GE, колонка ХК16/20, macroCap SP packing), уравновешенную 5 объемами колонки 50 мМ натрий-ацетатного буфера (рН 4,5). После наноса колонку уравновешивали двумя объемами колонки 50 мМ натрий-ацетатного буфера (рН 4,5), и буфер затем линейно меняли на 100%-ный буфер В (50 мМ натрий-ацетатный буфер (рН 4,5), содержащий 1 М NaCl) в 20 объемах колонки. Элюируемый пик собирали в AKTA Purifier. Было определено, что получен примерно 1 мг пептида.

Собранный раствор элюировали на обращенно-фазовой аналитической колонке С4 с размером пор 300 Е (Jupiter C4 300Е, 4,6×250 мм) в смеси 0,1%-ного водного раствора TFA и 0,1%-ного раствора TFA в ацетонитриле с градиентом от 61/39 до 54/46 за 10 мин. Анализ образца проводили с помощью аналитической ВЭЖХ, и время удерживания составляло 10,6 мин, а чистота - 98,5% (см. фиг.12). При использовании GPC-анализа (на хроматографе SHIMADZU LC-20AD с тремя тандемными колонками SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ) в 0,1 М растворе нитрата натрия элюцию проводили со скоростью 1,0 мл/мин, а чистота была определена как 98,7%.

Пример 4. Получение и анализ РВ-107 (ПЭГ30000-РВ-105)

2,0 мг РВ-105 растворяли в 1 мл 20 мМ фосфатного буфера (рН 6,5), и 30 мг ПЭГ30000 (поставляемого PegBio Co., Ltd. (Suzhou), 30000 указывает молекулярный вес ПЭГ 30 кДа, а молекулярная структура показана на фиг.2) взвешивали в соответствии с молярным соотношением ПЭГ к пептиду как 2:1 и добавляли к вышеуказанному раствору. Раствор соответственно качали для растворения ПЭГ и образования гомогенной смеси с пептидом. Реакцию проводили в течение 1 ч при 20°С и останавливали добавлением избытка раствора цистеина (0,1 мл 0,5 М раствора цистеина) и после хранили при -20°С для очистки.

Образец разводили в 5 раз в 50 мМ натрий-ацетатном буфере (рН 4,5) и наносили на SP-ионообменную хроматографическую колонку (GE, колонка ХК16/20, macroCap SP packing), уравновешенную 5 объемами колонки 50 мМ натрий-ацетатного буфера (рН 4,5). После наноса колонку уравновешивали двумя объемами колонки 50 мМ натрий-ацетатного буфера (рН 4,5), и буфер затем линейно меняли на 100%-ный буфер В (50 мМ натрий-ацетатный буфер (рН 4,5), содержащий 1 М NaCl) в 20 объемах колонки. Элюируемый пик собирали в AKTA Purifier. Было определено, что получен примерно 1 мг пептида.

Собранный раствор анализировали с помощью гель-электрофореза в ДСН-ПААГ и окрашивания Кумасси бриллиантовым синим и йодом (см. фиг.6А и 6В). Элюцию проводили на обращенно-фазовой аналитической колонке С4 с размером пор 300 Е (Jupiter C4 300Е, 4,6×250 мм) в смеси 0,1%-ного водного раствора TFA и 0,1%-ного раствора TFA в ацетонитриле с градиентом от 61/39 до 54/46 за 10 мин. Анализ образца проводили с помощью аналитической ВЭЖХ, и время удерживания составляло 11,5 мин, а чистота - 97,3% (см. фиг.13). При использовании GPC-анализа (на хроматографе SHIMADZU LC-20AD с тремя тандемными колонками SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ) в 0,1 М растворе нитрата натрия элюцию проводили со скоростью 1,0 мл/мин, а чистота была определена как 98,7%.

Пример 5а. Получение и анализ РВ-108 (ПЭГ40000-РВ-105)

2,0 мг РВ-105 растворяли в 1 мл 20 мМ фосфатного буфера (рН 6,5), и 40 мг ПЭГ40000 (поставляемого PegBio Co., Ltd. (Suzhou), 40000 указывает молекулярный вес ПЭГ 40 кДа, а молекулярная структура показана на фиг.2) взвешивали в соответствии с молярным соотношением ПЭГ к пептиду как 2:1 и добавляли к вышеуказанному раствору. Раствор соответственно качали для растворения ПЭГ и образования гомогенной смеси с пептидом. Реакцию проводили в течение 1 ч при 20°С и останавливали добавлением избытка раствора цистеина (0,1 мл 0,5 М раствора цистеина) и после хранили при -20°С для очистки.

Образец разводили в 5 раз в 50 мМ натрий-ацетатном буфере (рН 4,5) и наносили на SP-ионообменную хроматографическую колонку (GE, колонка ХК16/20, macroCap SP packing), уравновешенную 5 объемами колонки 50 мМ натрий-ацетатного буфера (рН 4,5). После наноса колонку уравновешивали двумя объемами колонки 50 мМ натрий-ацетатного буфера (рН 4,5), и буфер затем линейно меняли на 100%-ный буфер В (50 мМ натрий-ацетатный буфер (рН 4,5), содержащий 1 М NaCl) в 20 объемах колонки. Элюируемый пик собирали в AKTA Purifier. Было определено, что получен примерно 1 мг пептида.

Собранный раствор анализировали с помощью гель-электрофореза в ДСН-ПААГ и окрашивания Кумасси бриллиантовым синим и йодом (см. фиг.6А и 6В). Элюцию проводили на обращенно-фазовой аналитической колонке С4 с размером пор 300 Е (Jupiter C4 300Е, 4,6×250 мм) в смеси 0,1%-ного водного раствора TFA и 0,1%-ного раствора TFA в ацетонитриле с градиентом от 61/39 до 54/46 за 10 мин. Анализ образца проводили с помощью аналитической ВЭЖХ (Agilent 1200), и время удерживания составляло 11,4 мин, а чистота - 100% (см. фиг.14). При использовании GPC-анализа (на хроматографе SHIMADZU LC-20AD с тремя тандемными колонками SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ) в 0,1 М растворе нитрата натрия элюцию проводили со скоростью 1,0 мл/мин, а чистота была определена как 97,2%.

Пример 5b. Получение и анализ РВ-114 (ПЭГ40000-РВ-113)

2,0 мг РВ-113 растворяли в 1 мл 20 мМ фосфатного буфера (рН 6,5), и 40 мг ПЭГ40000 (поставляемого PegBio Co., Ltd. (Suzhou), 40000 указывает молекулярный вес ПЭГ 40 кДа, а молекулярная структура показана на фиг.2) взвешивали в соответствии с молярным соотношением ПЭГ к пептиду как 2:1 и добавляли к вышеуказанному раствору. Раствор соответственно качали для растворения ПЭГ и образования гомогенной смеси с пептидом. Реакцию проводили в течение 1 ч при 20°С и останавливали добавлением избытка раствора цистеина (0,1 мл 0,5 М раствора цистеина) и после хранили при -20°С для очистки.

Образец разводили в 5 раз в 50 мМ натрий-ацетатном буфере (рН 4,5) и наносили на SP-ионообменную хроматографическую колонку (GE, колонка ХК16/20, macroCap SP packing), уравновешенную 5 объемами колонки 50 мМ натрий-ацетатного буфера (рН 4,5). После наноса колонку уравновешивали двумя объемами колонки 50 мМ натрий-ацетатного буфера (рН 4,5), и буфер затем линейно меняли на 100%-ный буфер В (50 мМ натрий-ацетатный буфер (рН 4,5), содержащий 1 М NaCl) в 20 объемах колонки. Элюируемый пик собирали в AKTA Purifier. Было определено, что получен примерно 1 мг пептида.

Элюцию собранного раствора проводили с использованием обращенно-фазовой аналитической колонки С4 с размером пор 300 Е (Jupiter C4 300Е, 4,6×250 мм) в смеси 0,1%-ного водного раствора TFA и 0,1%-ного раствора TFA в ацетонитриле с градиентом от 61/39 до 54/46 за 10 мин. Анализ образца проводили с помощью аналитической ВЭЖХ, и время удерживания составляло 12,6 мин, а чистота - 97,9% (см. фиг.15). При использовании GPC-анализа (на хроматографе SHIMADZU LC-20AD с тремя тандемными колонками SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ) в 0,1 М растворе нитрата натрия элюцию проводили со скоростью 1,0 мл/мин, а чистота была определена как 98,4%.

Пример 6а. Получение и анализ РВ-109 (ПЭГ20000×2(двухлучевой ПЭГ)-РВ-105)

2,0 мг РВ-105 растворяли в 1 мл 20 мМ фосфатного буфера (рН 6,5), и 40 мг ПЭГ20000×2 (поставляемого PegBio Co., Ltd. (Suzhou), 20000 указывает молекулярный вес ПЭГ 20 кДа одного луча, а молекулярная структура показана на фиг.16) взвешивали в соответствии с молярным соотношением ПЭГ к пептиду как 2:1 и добавляли к вышеуказанному раствору. Раствор соответственно качали для растворения ПЭГ и образования гомогенной смеси с пептидом. Реакцию проводили в течение 1 ч при 20°С и останавливали добавлением избытка раствора цистеина (0,1 мл 0,5 М раствора цистеина) и после хранили при -20°С для очистки.

Образец разводили в 5 раз в 50 мМ натрий-ацетатном буфере (рН 4,5) и наносили на SP-ионообменную хроматографическую колонку (GE, колонка ХК16/20, macroCap SP packing), уравновешенную 5 объемами колонки 50 мМ натрий-ацетатного буфера (рН 4,5). После наноса колонку уравновешивали двумя объемами колонки 50 мМ натрий-ацетатного буфера (рН 4,5), и буфер затем линейно меняли на 100%-ный буфер В (50 мМ натрий-ацетатный буфер (рН 4,5), содержащий 1 М NaCl) в 20 объемах колонки. Элюируемый пик собирали в AKTA Purifier. Было определено, что получен примерно 1 мг пептида.

Собранный раствор анализировали с помощью гель-электрофореза в ДСН-ПААГ и окрашивания Кумасси бриллиантовым синим и йодом (см. фиг.6А и 6В). Элюцию проводили на обращенно-фазовой аналитической колонке С4 с размером пор 300 Е (Jupiter C4 300Е, 4,6×250 мм) в смеси 0,1%-ного водного раствора TFA и 0,1%-ного раствора TFA в ацетонитриле с градиентом от 61/39 до 54/46 за 10 мин. При анализе образца с помощью аналитической ВЭЖХ (Agilent 1200) время удерживания составляло 11,5 мин, а чистота - 100% (см. фиг.17). При использовании GPC-анализа (на хроматографе SHIMADZU LC-20AD с тремя тандемными колонками SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ) в 0,1 М растворе нитрата натрия элюцию проводили со скоростью 1,0 мл/мин, а чистота была определена как 99,3%.

Пример 6b. Получение и анализ РВ-109b (ПЭГ20000×2(двухлучевой ПЭГ)b-РВ-105)

2,0 мг РВ-105 растворяли в 1 мл 20 мМ фосфатного буфера (рН 6,5), и 40 мг ПЭГ20000×2b (поставляемого PegBio Co., Ltd. (Suzhou), 20000×2 указывает на молекулярный вес ПЭГ 20×2 кДа, а молекулярная структура показана на фиг.18) взвешивали в соответствии с молярным соотношением ПЭГ к пептиду как 2:1 и добавляли к вышеуказанному раствору. Раствор соответственно качали для растворения ПЭГ и образования гомогенной смеси с пептидом. Другие стадии были аналогичны примеру 6а. В конце использовали GPC-анализ (на хроматографе SHIMADZU LC-20AD с тремя тандемными колонками SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ) в 0,1 М растворе нитрата натрия, элюцию проводили со скоростью 1,0 мл/мин, и чистота была определена как 99,2%.

Пример 6с. Получение и анализ РВ-109с (ПЭГ20000×2(двухлучевой ПЭГ)с-РВ-105)

2,0 мг РВ-105 растворяли в 1 мл 20 мМ фосфатного буфера (рН 6,5), и 40 мг ПЭГ20000×2с (поставляемого PegBio Co., Ltd. (Suzhou), 20000×2 указывает на молекулярный вес ПЭГ 20×2 кДа, а молекулярная структура показана на фиг.19) взвешивали в соответствии с молярным соотношением ПЭГ к пептиду как 2:1 и добавляли к вышеуказанному раствору. Раствор соответственно качали для растворения ПЭГ и образования гомогенной смеси с пептидом. Другие стадии были аналогичны примеру 6а. В конце использовали GPC-анализ (на хроматографе SHIMADZU LC-20AD с тремя тандемными колонками SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ) в 0,1 М растворе нитрата натрия, элюцию проводили со скоростью 1,0 мл/мин, и чистота была определена как 98,8%.

Пример 6d. Получение и анализ РВ-109d (ПЭГ20000×2(двухлучевой ПЭГ)d-РВ-105)

2,0 мг РВ-105 растворяли в 1 мл 20 мМ фосфатного буфера (рН 6,5), и 40 мг ПЭГ20000×2d (поставляемого PegBio Co., Ltd. (Suzhou), 20000×2 указывает на молекулярный вес ПЭГ 20×2 кДа, а молекулярная структура показана на фиг.20) взвешивали в соответствии с молярным соотношением ПЭГ к пептиду как 2:1 и добавляли к вышеуказанному раствору. Раствор соответственно качали для растворения ПЭГ и образования гомогенной смеси с пептидом. Другие стадии были аналогичны примеру 6а. В конце использовали GPC-анализ (на хроматографе SHIMADZU LC-20AD с тремя тандемными колонками SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ) в 0,1 М растворе нитрата натрия, элюцию проводили со скоростью 1,0 мл/мин, и чистота была определена как 99,2%.

Пример 7. Получение и анализ РВ-119 (ПЭГ23000-РВ-105)

2,0 мг РВ-105 растворяли в 1 мл 20 мМ фосфатного буфера (рН 6,5), и 22 мг ПЭГ23000 (поставляемого PegBio Co., Ltd. (Suzhou), 23000 представляет молекулярный вес 23 кДа одного луча в ПЭГ, а молекулярная структура показана на фиг.2) взвешивали в соответствии с молярным соотношением ПЭГ к пептиду как 2:1 и добавляли к вышеуказанному раствору. Раствор соответственно качали для растворения ПЭГ и образования гомогенной смеси с пептидом. Реакцию проводили в течение 1 ч при 20°С и останавливали добавлением избытка раствора цистеина (0,1 мл 0,5 М раствора цистеина) и после хранили при -20°С для очистки.

Образец разводили в 5 раз в 50 мМ натрий-ацетатном буфере (рН 4,5) и наносили на SP-ионообменную хроматографическую колонку (GE, колонка ХК16/20, macroCap SP packing), уравновешенную 5 объемами колонки 50 мМ натрий-ацетатного буфера (рН 4,5). После наноса колонку уравновешивали двумя объемами колонки 50 мМ натрий-ацетатного буфера (рН 4,5), и буфер затем линейно меняли на 100%-ный буфер В (50 мМ натрий-ацетатный буфер (рН 4,5), содержащий 1 М NaCl) в 20 объемах колонки. Элюируемый пик собирали в AKTA Purifier. Было определено, что получен примерно 1 мг пептида.

Элюцию собранного раствора проводили с использованием обращенно-фазовой аналитической колонки С4 с размером пор 300 Е (Jupiter C4 300Е, 4,6×250 мм) в смеси 0,1%-ного водного раствора TFA и 0,1%-ного раствора TFA в ацетонитриле с градиентом от 61/39 до 54/46 за 10 мин. Анализ образца проводили с помощью аналитической ВЭЖХ (Agilent 1200), и время удерживания составляло 11,6 мин, а чистота - 96,0% (см. фиг.21). При использовании GPC-анализа (на хроматографе SHIMADZU LC-20AD с тремя тандемными колонками SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ) в 0,1 М растворе нитрата натрия элюцию проводили со скоростью 1,0 мл/мин, а чистота была определена как 97,1%.

Пример 8. Получение и анализ РВ-120 (ПЭГ27000-РВ-105)

2,0 мг РВ-105 растворяли в 1 мл 20 мМ фосфатного буфера (рН 6,5), и 24 мг ПЭГ27000 (поставляемого PegBio Co., Ltd. (Suzhou), 27000 представляет молекулярный вес 27 кДа одного луча в ПЭГ, а молекулярная структура показана на фиг.2) взвешивали в соответствии с молярным соотношением ПЭГ к пептиду как 2:1 и добавляли к вышеуказанному раствору. Раствор соответственно качали для растворения ПЭГ и образования гомогенной смеси с пептидом. Реакцию проводили в течение 1 ч при 20°С и останавливали добавлением избытка раствора цистеина (0,1 мл 0,5 М раствора цистеина) и после хранили при -20°С для очистки.

Образец разводили в 5 раз в 50 мМ натрий-ацетатном буфере (рН 4,5) и наносили на SP-ионообменную хроматографическую колонку (GE, колонка ХК16/20, macroCap SP packing), уравновешенную 5 объемами колонки 50 мМ натрий-ацетатного буфера (рН 4,5). После наноса колонку уравновешивали двумя объемами колонки 50 мМ натрий-ацетатного буфера (рН 4,5), и буфер затем линейно меняли на 100%-ный буфер В (50 мМ натрий-ацетатный буфер (рН 4,5), содержащий 1 М NaCl) в 20 объемах колонки. Элюируемый пик собирали в AKTA Purifier. Было определено, что получен примерно 1 мг пептида.

Элюцию собранного раствора проводили с использованием обращенно-фазовой аналитической колонки С4 с размером пор 300 Е (Jupiter C4 300Е, 4,6×250 мм) в смеси 0,1%-ного водного раствора TFA и 0,1%-ного раствора TFA в ацетонитриле с градиентом от 61/39 до 54/46 за 10 мин. Анализ образца проводили с помощью аналитической ВЭЖХ (Agilent 1200), и время удерживания составляло 12,1 мин, а чистота - 97,7% (см. фиг.21). При использовании GPC-анализа (на хроматографе SHIMADZU LC-20AD с тремя тандемными колонками SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ) в 0,1 М растворе нитрата натрия элюцию проводили со скоростью 1,0 мл/мин, а чистота была определена как 98,4%.

Пример 9. Тест на стабильность для полиэтиленовых конъюгатов РВ-105

РВ-110 (ПЭГ5000-РВ-105), РВ-106 (ПЭГ20000-РВ-105), РВ-107 (ПЭГ30000-РВ-105), РВ-108 (ПЭГ40000-РВ-105) и РВ-109 (ПЭГ20000×2-РВ-105) помещали соответственно в натрий-ацетатный буфер (рН 4,5) и фосфатный буфер (рН 7,0) при 4°С и -20°С, и оценивали их стабильность. Образцы отбирали для ВЭЖХ-анализа на 7-й, 15-й, 30-й и 60-й день. Результаты для 60-го дня показали, что образцы были стабильны при рН 4,5 и -20°С (фиг.23А) и при рН 7,0 и 4°С или -20°С (фиг.23В, 23С).

Пример 10. In vitro эффект РВ-101 и РВ-105 на уровень активности внутриклеточного цАМФ

Клетки РС12 трипсинизировали, высевали на 24-луночный планшет с плотностью 105 клеток/мл и инкубировали 48 ч (до конфлюентности 60-70%). Культуральную среду удаляли и клетки промывали дважды фосфатно-солевым буфером (PBS). Добавляли 1 мл PBS, содержащий 1% BSA (бычьего сывороточного альбумина). Варианты эксендина-4, РВ-101 и РВ-105 (10-11, 10-10, 10-9, 10-8, 10-7 и 10-6 М) с цистеином в позиции 39 С-конца инкубировали с 3-изобутил-1-метилксантином (IBMX, конечная концентрация - 100 мкМ) в течение 30 мин. Удаляли среду для инкубирования. Добавляли 500 мкл HCl (0,1 М) для остановки расщепления цАМФ ферментом. Клетки собирали и лизировали ультразвуком. Содержание белка в клетках определяли ВСА-методом. Построение стандартной кривой осуществляли с помощью серии групп стандартов с разлиой концентрацией, используя инструкцию набора для цАМФ-твердофазного иммуно-ферментного анализа (U.S. RD System corporation). После реакции поглощение определяли при 450 нм в планшетном спектрофотометре (U.S. Thermo Fisher Scientific Corporation). Концентрацию цАМФ получали из стандартной кривой, используя эти значения поглощения. Затем вычисляли концентрацию цАМФ в образцах. Дозозависимый эффект РВ-101 и РВ-105 на увеличение количества внутриклеточного цАМФ вычисляли с использованием программного обеспечения Graphpad Prizm.

Результаты эксперимента показаны на фиг.24. РВ-101 увеличивал содержание цАМФ в клетках РС12 дозозависимым образом. Максимум увеличения цАМФ (Emax) составлял 133,2±7,2 пмоль/100 мкг (белка), а ЕС50 составляла 1,9×10-9 М. РВ-105 имел аналогичный in vitro эффект на уровень цАМФ в клетках РС12 по сравнению с РВ-101. Максимум увеличения цАМФ (Emax) для РВ-105 составлял 129,4±6,8 пмоль/100 мкг (белка) (РВ-105 относительно РВ-101, Р>0,05); ЕС50 составляла 2,5×10-9 М. Дополнительный анализ показал, что значения log ЕС50 для РВ-101 и РВ-105 составляли соответственно -8,71±0,15 и -8,61±0,15 (РВ-105 относительно РВ-101, Р>0,05). Это указывает на то, что биологическая активность РВ-101 не изменялась в результате введения цистеина (тиола) в позицию 39 С-конца.

Пример 11. In vitro эффект РВ-105 и его ПЭГилированных конъюгатов на уровень активности внутриклеточного цАМФ

Клетки РС12 трипсинизировали, высевали на 24-луночный планшет с плотностью 105 клеток/мл и инкубировали 48 ч (до конфлюентности 60-70%). Культуральную среду удаляли и клетки промывали дважды фосфатно-солевым буфером (PBS). Добавляли 1 мл PBS, содержащий 1% BSA. РВ-105, ПЭГилированный (ПЭГ5000) конъюгат РВ-105 (РВ-110), ПЭГилированный (ПЭГ20000) конъюгат РВ-105 (РВ-106), ПЭГилированный (ПЭГ30000) конъюгат РВ-105 (РВ-107), ПЭГилированный (ПЭГ40000) конъюгат РВ-105 (РВ-108) и ПЭГилированный (ПЭГ20000×2, с двумя лучами) конъюгат РВ-105 (РВ-109) (в концентрации 10-11, 10-10, 10-9, 10-8, 10-7, 10-6 и 10-5 М) инкубировали с 3-изобутил-1-метилксантином (IBMX, конечная концентрация 100 мкМ) в течение 30 мин. Удаляли среду для инкубирования. Добавляли 500 мкл HCl (0,1 М) для остановки расщепления цАМФ ферментом. Клетки собирали и лизировали ультразвуком. Содержание белка в клетках определяли ВСА-методом. Построение стандартной кривой осуществляли с помощью серии групп стандартов с различной концентрацией, используя инструкцию набора для цАМФ-твердофазного иммуноферментного анализа (U.S. RD System corporation). После реакции поглощение определяли при 450 нм в планшетном спектрофотометре (U.S. Thermo Fisher Scientific Corporation). Концентрацию цАМФ получали из стандартной кривой, используя эти значения поглощения. Затем вычисляли концентрацию цАМФ в образцах. Дозозависимый эффект РВ-106, РВ-107, РВ-108, РВ-109 и РВ-110 на увеличение количества внутриклеточного цАМФ вычисляли с использованием программного обеспечения Graphpad Prizm.

Результаты эксперимента указывают на то, что РВ-105 увеличивает содержание цАМФ в клетках РС12 дозозависимым образом; максимум увеличения цАМФ (Emax) составлял 103,9±1,5 пмоль/100 мкг (белка), а ЕС50 составляла 1,3×10-9 М. ПЭГилирование белка сдвигало параллельно вправо кривую зависимости от дозы независимо от молекулярной массы (5-40 кДа) и снижало биологическую активность РВ-105 (фиг.25). ЕС50 для РВ-110, РВ-106, РВ-107, РВ-108 и РВ-109 составляла соответственно 1,1×10-9, 1,1×10-9, 1,2×10-8, 9,7×10-8 и 1,3×10-7. ПЭГилирование молекулой ПЭГ 5 кДа (РВ-110) и 20 кДа (РВ-106) практически не оказывало влияния на активность РВ-105 (активность составляла соответственно 115% от активности РВ-105), а модификации молекулами ПЭГ 30 кДа (РВ-107) и 40 кДа (включая линейный ПЭГ и ПЭГ с двумя лучами - РВ-108 и РВ-109) соответственно снижали активность РВ-105 примерно на 90% и 99%. Корреляция между молекулярным весом ПЭГ в ПЭГилированном конъюгате и активностью этих лекарственных соединений (log ЕС50) показаны на фиг.26А (включая ЕС50 для РВ-105 на фиг.24).

Пример 12. In vitro эффект РВ-105 и его ПЭГилированных конъюгатов на уровень активности внутриклеточного цАМФ

Клетки РС12 трипсинизировали, высевали на 24-луночный планшет с плотностью 105 клеток/мл и инкубировали 48 ч (до конфлюентности 60-70%). Культуральную среду удаляли и клетки промывали дважды фосфатно-солевым буфером (PBS). Добавляли 1 мл PBS, содержащий 1% BSA. РВ-105, ПЭГилированный (ПЭГ23000) конъюгат РВ-105 (РВ-119) и ПЭГилированный (ПЭГ27000) конъюгат РВ-105 (РВ-120) (в концентрации 10-11, 10-10, 10-9, 3×10-9, 10-8 и 10-7 М) инкубировали с 3-изобутил-1-метилксантином (IBMX, конечная концентрация 100 мкМ) в течение 30 мин. Удаляли среду для инкубирования. Добавляли 500 мкл HCl (0,1 М) для остановки расщепления цАМФ ферментом. Клетки собирали и лизировали ультразвуком. Содержание белка в клетках определяли ВСА-методом. Построение стандартной кривой осуществляли с помощью серии групп стандартов с различной концентрацией, используя инструкцию набора для цАМФ-твердофазного иммуноферментного анализа (U.S. RD System corporation). После реакции поглощение определяли при 450 нм в планшет-ридере ELISA (U.S. Thermo Fisher Scientific Corporation). Концентрацию цАМФ получали из стандартной кривой, используя эти значения поглощения. Затем вычисляли концентрацию цАМФ в образцах. Дозозависимый эффект РВ-105, РВ-119 и РВ-120 на увеличение количества внутриклеточного цАМФ вычисляли, используя программное обеспечение Graphpad Prizm.

Результаты эксперимента указывают на то, что РВ-105 увеличивает содержание цАМФ в клетках РС12 дозозависимым образом, а ЕС50 составляла 2,7×10-9 М. Модификации в РВ-106 (ПЭГ20000) и РВ-119 (ПЭГ23000) не влияли на активность РВ-105 в отношении цАМФ, а модификация в РВ-120 (ПЭГ27000) сдвигала кривую зависимости от дозы параллельно вправо и снижала биологическую активность РВ-105 в отношении цАМФ примерно на 50% (фиг.27). Величины ЕС50 для РВ-106, РВ-119 и РВ-120 составляли соответственно 1,5×10-9, 2,5×10-9 и 5,4×10-9.

Обычно считается, что биологическая активность конъюгированной биомолекулы снижается экспоненциально с увеличением молекулярного веса конъюгирующей группы (например, от 4 кДа) (Bailon et al. Rational design of potent, long-lasting form of interferon: A 40 kDa branched polyethylene glycol-conjugated interferon α-2a for the treatment of hepatitis C. Bioconjugate Chem. 2001; 12: 195-202; Bowen et al. Relationship between molecular weight and duration of activity of polyethylene glycol conjugated granulocyte colony-stimulating factor mutein. Experimental Hematology 1999; 27: 425-32; Bailon et al. PEG-modified biopharmaceuticals. Expert Opin Deliv. 2009; 6: l-16). Однако автор изобретения неожиданно обнаружил (показано на фиг.25 и 27), что связь между молекулярным весом конъюгирующей полимерной группы и способностью конъюгата варианта эксендина стимулировать in vitro уровень цАМФ не соответствует этому предположению. По меньшей мере для варианта эксендина, конъюгированного с ПЭГ с молекулярным весом до 23 кДа, ПЭГилирование не оказывало эффекта на способность конъюгата варианта эксендина стимулировать in vitro продукцию цАМФ в клетках (а когда молекулярный вес ПЭГ достигал 27 кДа, то наблюдался только слабый эффект). В отличие от этого, ПЭГилирование не оказывало эффекта на максимальный эффект РВ-105 в отношении стимуляции продукции цАМФ (Emax). Emax для РВ 110, РВ-106, РВ-107, РВ-108 и РВ-109 составляла соответственно 102,1±1,8, 111,9±2,1, 126,2±3,4, 100,4±1,7 и 115,5±3,5 пмоль/100 мкг белка. Молекулярный вес ПЭГ в ПЭГилированных конъюгатах не коррелировал с Emax этих лекарственных соединений (см. фиг.26В) (включая Emax для РВ-105 на фиг.24).

Следующие эксперименты автор изобретения провел исходя из этого неожиданного результата. Поскольку среду, содержащую сыворотку, в которой присутствует множество протеаз, не использовали в качестве реакционной системы в этом примере и в реакционный раствор не добавляли никаких протеаз, то ферментативное разрушение варианта эксендина и его конъюгатов было значительно снижено по сравнению с ситуацией in vivo. Другими словами, в случаях проведения более длительного теста in vivo степень снижения биологической активности конъюгатов варианта эксендина по настоящему изобретению будет меньше относительно неконъюгированного эксендина дикого типа или варианта эксендина, даже если биологическая активность конъюгатов варианта эксендина по настоящему изобретению является более высокой. В другом аспекте, молекулу полимера с весом, превышающим 23 кДа, можно использовать для конъюгации с вариантом эксендина, существенно не затрагивая его биологическую активность in vivo. Хотя эта теория не ограничивает изобретение, эта гипотеза подтверждена нижеследующими примерами.

Пример 13. Зависимость гипогликемического эффекта РВ-101 и РВ-105 от времени

Использовали самцов мышей Kunming (вес тела 27-32 г). Перед экспериментом мыши не испытывали недостатка в воде или пище. Мышей распределяли случайным образом по трем группам с 6 мышами в каждой группе. Каждой мыши вводили подкожной болюсной инъекцией равные объемы физиологического раствора (10 мл/кг), РВ-101 (10 мкг/кг) и варианта эксендина РВ-105 с цистеином в позиции 39 С-конца (10 мкг/кг). Через 0, 1, 2, 4, 8, 12 ч после инъекции собирали образцы крови из кончика хвоста. Содержание глюкозы в крови определяли с использованием глюкометра OneTouch и прилагаемых к устройству тестовых полосок (U.S. Johnson & Johnson). Для построения кривой зависимости гипогликемического эффекта от времени откладывали значения уровня глюкозы в крови в различных временных точках по оси y, а временные точки - по оси x и вычисляли биологическую половину длительности гипогликемического эффекта РВ-101 и РВ-105. Результаты показаны на фиг.28. Период полужизни варианта эксендина-4, замещенного цистеином, и эксендина-4 составлял соответственно 4,7±0,2 ч и 4,4±0,2 ч (РВ-105 относительно РВ-101, Р>0,05). Это указывает на то, что вариант эксендина-4, замещенный цистеином по позиции 39 С-конца, и эксендин-4 имеют аналогичный период полужизни.

Пример 14. Зависимость гипогликемического эффекта РВ-101 и РВ-105 от дозы

Использовали самцов мышей Kunming (вес тела 23-27 г). Перед экспериментом мыши не получали пищи в течение 3 часов, а воду получали свободно. Мышей распределяли случайным образом по трем группам с 6 мышами в каждой группе. Каждой мыши вводили подкожной болюсной инъекцией равные объемы физиологического раствора (10 мл/кг), РВ-101 (0,01, 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 100 мкг/кг) и варианта эксендина РВ-105 с цистеином в позиции 39 С-конца (0,01, 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 100 мкг/кг). Через 1 ч после инъекции собирали образцы крови из кончика хвоста. Содержание глюкозы в крови определяли с использованием глюкометра OneTouch и прилагаемых к устройству тестовых полосок (U.S. Johnson & Johnson). Для построения кривой зависимости гипогликемического эффекта от дозы откладывали значения уровня глюкозы в крови по оси y, а используемую дозу - по оси x (фиг.29). После чего вычисляли параметры зависимости эффекта от дозы для РВ-101 и РВ-105 (Emax и ED50), используя программное обеспечение Graphpad Prizm. Результаты указывали на то, что максимальная гипогликемическая эффективность при болюсной инъекции РВ-101 и РВ-105 составляла соответственно 32,2% и 36,1%, а значения ED50 составляли соответственно 0,6 и 1,2 мкг/кг. Дополнительный анализ показал, что log ED50 для РВ-101 и РВ-105 составлял соответственно -0,25±0,17 и 0,08±0,20 (РВ-105 относительно РВ-101, Р>0,05). Результаты эксперимента указывали на то, что вариант эксендина-4, РВ-105, с цистеином в позиции 39 С-конца, по существу, не отличается от эксендина-4 в отношении гипогликемического эффекта.

Пример 15. Зависимость гипогликемического эффекта РВ-101 и его варианта (РВ-102) от дозы

Использовали самцов мышей Kunming (вес тела 22-26 г). Перед экспериментом мыши не получали пищи в течение 3 ч, а воду получали свободно. Мышей распределяли случайным образом по 18 группам с 6 мышами в каждой группе. Каждой мыши вводили подкожной болюсной инъекцией равные объемы физиологического раствора (10 мл/кг), РВ-101 (0,01, 0,1, 1, 10, 100 мкг/кг) и варианта эксендина РВ-102 с цистеином в позиции 35 С-конца (0,01, 0,1, 1, 10, 100 мкг/кг). Через 1 ч после инъекции собирали образцы крови из кончика хвоста. Содержание глюкозы в крови определяли с использованием глюкометра OneTouch и прилагаемых к устройству тестовых полосок (U.S. Johnson & Johnson). Для построения кривой зависимости гипогликемического эффекта от дозы откладывали значения уровня глюкозы в крови по оси y, а используемую дозу - по оси x (фиг.30). После чего вычисляли параметры зависимости эффекта от дозы для РВ-101 и РВ-102 (Emax и ED50), используя программное обеспечение Graphpad Prizm. Результаты указывали на то, что максимальная гипогликемическая эффективность для болюсной инъекции РВ-101 и РВ-102 составляла соответственно 39,8% и 32,8%, а значения ED50 составляли соответственно 0,5 и 2,5 мкг/кг. Дополнительный анализ показал, что log ED50 для РВ-101 и РВ-105 составлял соответственно -0,2867±0,2272 и 0,4015±0,2946 (РВ-102 относительно РВ-101, Р>0,05). Результаты эксперимента указывали на то, что вариант эксендина-4, РВ-102, с цистеином в позиции 35 С-конца, по существу, не отличается от эксендина-4 в отношении гипогликемического эффекта.

Пример 16. Зависимость гипогликемического эффекта равных количеств РВ-105 и ПЭГилированных конъюгатов от времени

Использовали самцов мышей Kunming (вес тела 22-26 г). Перед экспериментом мыши не испытывали недостатка в воде и пище. Мышей распределяли случайным образом по шести группам с 12 мышами в каждой группе. Каждой мыши вводили подкожной болюсной инъекцией равные объемы РВ-105 (10 мкг/кг), ПЭГилированного (ПЭГ5000) конъюгата РВ-105 (РВ-110) (10 мкг/кг), ПЭГилированного (ПЭГ20000) конъюгата РВ-105 (РВ-106) (10 мкг/кг), ПЭГилированного (ПЭГ30000) конъюгата РВ-105 (РВ-107) (10 мкг/кг), ПЭГилированного (ПЭГ40000) конъюгата РВ-105 (РВ-108) (10 мкг/кг) и ПЭГилированного (ПЭГ20000×2, с двумя лучами) конъюгата РВ-105 (РВ-109) (10 мкг/кг). Через 0, 1, 2, 4, 8, 12, 18, 24, 36 ч после инъекции собирали образцы крови из кончика хвоста. Содержание глюкозы в крови определяли с использованием глюкометра OneTouch и прилагаемых к устройству тестовых полосок (U.S. Johnson & Johnson). Для построения кривой зависимости гипогликемического эффекта от времени откладывали значения уровня глюкозы в крови в различных временных точках по оси y, а временные точки - по оси x (фиг.31) и вычисляли биологический период полужизни и максимальный гипогликемический эффект РВ-105 и его ПЭГилированных конъюгатов, а также площадь над кривой гипогликемического эффекта (таблица 1). Как видно из таблицы 1, каждый конъюгат в этом эксперименте имел аналогичный или даже значительно более высокий (РВ-106) суммарный гипогликемический эффект (см. площадь над кривой), и эти конъюгаты варианта эксендина имели значительно больший биологический период полужизни по сравнению с неконъюгированным РВ-105. Анализ молекулярного веса ПЭГ относительно биологического периода полужизни, максимального гипогликемического эффекта и площади над кривой гипогликемического эффекта указывает на то, что ПЭГилированные конъюгаты РВ-105 - РВ-106, РВ-107, РВ-108 и РВ-109 - все значительно увеличивают длительность гипогликемического эффекта РВ-105 (время полужизни, t1/2). Однако при молекулярном весе ПЭГ в диапазоне 5-20 кДа увеличение биологического периода полужизни пропорционально молекулярному весу, а при молекулярном весе ПЭГ выше 20 кДа длительность гипогликемического эффекта (биологического периода полужизни) остается неизменной (фиг.32А). ПЭГилированные конъюгаты имеют одинаковый максимальный гипогликемический эффект при молекулярном весе ПЭГ в диапазоне 5-20 кДа, но при молекулярном весе ПЭГ больше 20 кДа максимальный гипогликемический эффект снижается с увеличением молекулярного веса ПЭГ (фиг.32В). В отношении площади над кривой гипогликемического эффекта, только РВ-106 (ПЭГ 20 кДа) имел значительно больший суммарный гипогликемический эффект относительно РВ-105, а другие конъюгаты имели аналогичный или немного меньший эффект (фиг.32С). Как видно из приведенных выше экспериментов, сайт-специфичная модификация ПЭГилированием (РВ-110 и РВ-106) значительно не влияет на максимальный гипогликемический эффект конъюгатов варианта эксендина (соответственно, 96% от РВ-105) по меньшей мере тогда, когда молекулярный вес ПЭГ не превышает 20 кДа. Модификация ПЭГилированием значительно снижает максимальный гипогликемический эффект, когда молекулярный вес ПЭГ составляет 30 кДа или даже выше (РВ-107, РВ-108 и РВ-109), хотя эти конъюгаты все еще имеют сравнительно похожий суммарный гипогликемический эффект и значительно более продолжительный биологический период полужизни. Эти результаты указывают на то, что конъюгирующая молекула с более высокой молекулярной массой может быть пригодна для получения конъюгатов вариантов эксендина. Фактически достигается значительное увеличение биологического периода полужизни и более мягкая регуляция, а также более стабильный уровень глюкозы в крови для предупреждения слишком резкого падения уровня глюкозы за короткий период времени и предупреждения флуктуаций уровня глюкозы в большом диапазоне. Эти данные согласуются с результатами, полученным в in vitro экспериментах по измерению уровня цАМФ, описанных выше (см. фиг.26).

Таблица 1
Биологический период полужизни, максимальный гипогликемический эффект и площадь над кривой снижения уровня глюкозы в крови (ААС) для РВ-105 и его ПЭГилированных конъюгатов (по 12 мышей в каждой группе)
Конъюгаты эксендина Т1/2 (часы) Максимальный гипогликемический эффект (% от значения до введения дозы соединения) Площадь над кривой уровня глюкозы в крови (ААС, ммоль·ч/л)
PB-105 4,9±0,1 38,0±4,3 32,8±5,4
PB-110 7,0±2,0 36,3±1,2 31,8±4,6
PB-106 13,4±0,5* 36,5±3,2 53,9±4,3*
PB-107 12,5±2,0* 24,3±2,8* 30,0±7,2
PB-108 10,8±2,0* 22,6±2,9* 25,3±5,7
PB-109 9,2±2,2* 20,2±3,2* 21,6±4,8
*Р<0,05 (относительно РВ-105)

Пример 17. Зависимость от времени гипогликемического эффекта эквивалентных количеств РВ-105 и его ПЭГилированного (ПЭГ30000) конъюгата (РВ-107)

Поскольку конъюгат с ПЭГ30000 (РВ-107) in vitro снижал биологическую активность РВ-105 примерно на 90% (фиг.25), а in vivo снижал биологическую активность РВ-105 примерно на 50% (фиг.31), дозу РВ-107 увеличивали для исследования биологического периода полужизни РВ-107 при условиях его эквивалентности с РВ-105. Использовали самцов мышей Kunming (вес тела 22-25 г). Перед экспериментом мыши не испытывали недостатка в пище или воде. Мышей распределяли случайным образом по двум группам с 6 мышами в каждой группе. Каждой мыши вводили подкожной болюсной инъекцией РВ-105 (10 мкг/кг) и ПЭГилированный (ПЭГ30000) конъюгат РВ-105 (РВ-107) (100 мкг/кг, эта доза давала примерно 100% гипогликемического эффекта относительно 10 мкг/кг РВ-105). Через 0, 1, 2, 4, 8, 12, 18, 24, 36, 48, 72 ч после инъекции собирали образцы крови из кончика хвоста. Содержание глюкозы в крови определяли с использованием глюкометра OneTouch и прилагаемых к устройству тестовых полосок (U.S. Johnson & Johnson). Для построения кривой зависимости гипогликемического эффекта от времени откладывали значения уровня глюкозы в крови в различных временных точках по оси y, а временные точки - по оси х, и вычисляли биологический период полужизни РВ-105 (10 мкг/кг) и РВ-107 (100 мкг/кг). Результаты показаны на фиг.33, биологический период полужизни РВ-105 (10 мкг/кг) и РВ-107 (100 мкг/кг) составляет соответственно 4,5±0,4 ч и 44,6±4,5 ч (Р>0,05, РВ-107 относительно РВ-105). Исследование зависимости эффекта от времени для эквивалентных доз указывает на то, что ПЭГилирование (ПЭГ30000) (РВ-107) увеличивает продолжительность гипогликемического эффекта РВ-105 в десять раз.

Пример 18. Зависимость гипогликемического эффекта РВ-105 и его ПЭГилированного (ПЭГ20000) конъюгата (РВ-106) от дозы

Использовали самцов мышей Kunming (вес тела 20-24 г). Перед экспериментом мыши не получали пищи в течение 3 ч, но воду получали свободно. Мышей распределяли случайным образом по 13 группам с 6 мышами в каждой группе. Каждой мыши вводили подкожной болюсной инъекцией равные объемы физиологического раствора (10 мл/кг), РВ-105 (0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30 мкг/кг) и равную дозу ПЭГилированного (ПЭГ20000) конъюгата РВ-106 (0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30 мкг/кг). Через 1 ч после инъекции для РВ-105 группы (временная точка пика снижения глюкозы, см. фиг.28 и 31) и через 4 ч после инъекции для РВ-106 группы (временная точка пика снижения глюкозы, см. фиг.31) собирали образцы крови из кончика хвоста. Содержание глюкозы в крови определяли с использованием глюкометра OneTouch и прилагаемых к устройству тестовых полосок (U.S. Johnson & Johnson). Для построения кривой зависимости гипогликемического эффекта от дозы откладывали значения уровня глюкозы в крови по оси y, а используемую дозу - по оси x (фиг.34). После чего вычисляли параметры зависимости эффекта от дозы для РВ-105 и РВ-106 (Emin, Emax и ED50), используя программное обеспечение Graphpad Prizm. Emin для болюсной инъекции РВ-105 и РВ-106 составляла, соответственно, 8,3±0,2 и 8,4±0,3 ммоль/л; а Emax составляла соответственно 6,0±0,3 и 5,5±0,6 ммоль/л (максимальная гипогликемическая эффективность соответственно составляла 27,8% и 34,5%). Значения ED50 составляли соответственно 1,2 и 3,3 мкг/кг. Дополнительный анализ показал, что log ED50 для РВ-105 и РВ-106 составлял соответственно 0,07±1,2 и 0,5±0,2 (РВ-106 относительно РВ-105, Р>0,05). Результаты эксперимента указывают на то, что ПЭГилированные (ПЭГ20000) конъюгаты РВ-105 (РВ-106), по существу, не отличаются от РВ-105 в отношении гипогликемического эффекта (включая Emax и ED50).

Пример 19. Зависимость от времени гипогликемического эффекта РВ-105, РВ-111 и ПЭГилированных конъюгатов (РВ-106 и РВ-112) у нормальных мышей

Использовали самцов мышей Kunming (вес тела 24-30 г). Перед экспериментом мыши не испытывали недостатка в воде и пище. Мышей распределяли случайным образом по четырем группам с 6 мышами в каждой группе. Каждой мыши вводили подкожной болюсной инъекцией РВ-105 (10 мкг/кг), ПЭГилированный (ПЭГ20000) конъюгат РВ-105 (РВ-106) (10 мкг/кг), РВ-111 (10 мкг/кг) и ПЭГилированный (ПЭГ20000) конъюгат РВ-111 (РВ-112) (10 мкг/кг). РВ-111 представляет собой производное РВ-105, в котором цистеин в позиции 39 С-конца соединен с тирозином. Через 0, 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48 ч после инъекции собирали образцы крови из кончика хвоста. Содержание глюкозы в крови определяли с использованием глюкометра OneTouch и прилагаемых к устройству тестовых полосок (U.S. Johnson & Johnson). Для построения кривой зависимости гипогликемического эффекта от времени откладывали значения уровня глюкозы в крови в различных временных точках по оси y, а временные точки - по оси х, и вычисляли биологическое время полужизни и максимальный гипогликемический эффект РВ-105, РВ-111 и их ПЭГилированных конъюгатов. Результаты показаны на фиг.35, снижение случайного уровня глюкозы в крови под действием РВ-105, РВ-106, РВ-111 и РВ-112 зависело от времени. Биологический период полужизни РВ-105 и РВ-111 составлял соответственно 4,6 ч и 6,0 ч, а максимальный гипогликемический эффект составлял соответственно 44,7% и 36,4%. Биологический период полужизни РВ-106 и РВ-112 составлял соответственно 19,6 ч и 21,7 ч, а максимальный гипогликемический эффект составлял соответственно 37,3% и 34,9%. Результаты указывают на то, что присоединение тирозина к 39-й позиции С-конца не влияет на гипогликемический эффект и биологический период полужизни РВ-105 и его ПЭГилированного конъюгата (РВ-106).

Пример 20. Зависимость от времени гипогликемического эффекта РВ-101 и вариантов РВ-105, РВ-111 и РВ-113, а также ПЭГилированных конъюгатов РВ-106, РВ-112 и РВ-114 у мышей с STZ-индуцированным диабетом

Перед индукцией диабета мыши голодали в течение 14 ч. Отбирали образец крови из кончика хвоста для определения исходного уровня глюкозы в крови. Затем вводили подкожно болюсной инъекцией свежеприготовленный STZ (стрептозотоцин) (120 мг/10 мл/кг, свежеприготовленный, растворенный в 0,1 М растворе нитрата, рН 4,5). Уровень глюкозы в крови определяли через 3 дня. Если у мышей случайный уровень глюкозы в крови превышал 16,7 ммоль/л, то индукцию диабета считали успешной. Перед проведением эксперимента мыши не испытывали недостатка в еде или воде. Мышей распределяли по 7 группам по 4-6 мышей в каждой группе. Уровень глюкозы в крови в начальной временной точке (0 ч) определяли в образце крови из хвостовой вены. Каждой мыши вводили подкожной болюсной инъекцией равные объемы РВ-101 (10 мкг/10 мл/кг), РВ-105 (10 мкг/кг), РВ-106 (10 мкг/кг), РВ-111 (10 мкг/кг), РВ-112 (10 мкг/кг), РВ-113 (10 мкг/кг) и РВ-114(10 мкг/кг). РВ-111 представляет собой производное РВ-105, в котором цистеин в позиции 39 С-конца соединен с тирозином, РВ-113 представляет собой производное РВ-105, в котором глицин в позиции 2 N-конца замещен D-аланином, а РВ-114 представляет собой ПЭГилированный (ПЭГ40000) конъюгат РВ-113. Образцы крови отбирали во временных точках: 0, 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48 ч после инъекции и определяли содержание глюкозы в крови. Кривую зависимости гипогликемического эффекта от времени для РВ-101, РВ-105, РВ-106, РВ-111, РВ-112, РВ-113 и РВ-114 строили, откладывая значения уровня глюкозы в различных временных точках по оси y, а используемые временные точки - по оси х. Построение кривой осуществляли с помощью программного обеспечения GraphPad Prizm 5 Demo (Prizm v5, GraphPad Software, Inc., San Diego, CA), и вычисляли и сравнивали биологический период полужизни (t1/2) для РВ-101, РВ-105, РВ-106, РВ-111, РВ-112, РВ-113 и РВ-114 с использованием методов математической статистики.

Как показано на фиг.36, снижение случайного уровня глюкозы в крови у мышей с STZ-индуцированным диабетом в результате болюсных инъекций РВ-101, РВ-105, РВ-106, РВ-111, РВ-112, РВ-113 и РВ-114 зависело от времени. Максимальная эффективность составляла соответственно 47,5%, 57,6%, 69,8%, 54,4%, 59,7%, 49,2% и 17,9% (только 38% для РВ-101). Биологический период полужизни для РВ-101, РВ-105, РВ-106, РВ-111, РВ-112 и РВ-113 составлял соответственно 5,5, 5,5, 21,8, 5,0, 20,3 и 5,9 ч, а биологический период полужизни для РВ-114 невозможно было вычислить вследствие гипогликемического эффекта. Результаты эксперимента указывают на то, что добавление тирозина к позиции 39 С-конца или замена глицина D-аланином в позиции 2 N-конца не снижают противогликемическую активность РВ-105, ПЭГилирование (ПЭГ20000) не снижает активность РВ-105 и его производных, а ПЭГилирование (ПЭГ40000) значительно снижает активность РВ-105 и его производных.

Пример 21. Зависимость гипогликемического эффекта от времени для эквивалентных количеств РВ-105 и РВ-106, РВ-119 и РВ120

Использовали самцов мышей Kunming (вес тела 24-30 г). Перед экспериментом мыши не испытывали недостатка в воде и пище. Мышей распределяли случайным образом по четырем группам с 6 мышами в каждой группе. Каждой мыши вводили подкожной болюсной инъекцией РВ-105 (10 мкг/кг), ПЭГилированный (ПЭГ20000) конъюгат РВ-105 (РВ-106) (10 мкг/кг), ПЭГилированный (ПЭГ23000) конъюгат РВ-105 (РВ-119) (10 мкг/кг) и ПЭГилированный (ПЭГ27000) конъюгат РВ-105 (РВ-120) (10 мкг/кг). Через 0, 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48 ч после инъекции собирали образцы крови из кончика хвоста. Содержание глюкозы в крови определяли с использованием глюкометра OneTouch и прилагаемых к устройству тестовых полосок (U.S. Johnson & Johnson). Для построения кривой зависимости гипогликемического эффекта от времени откладывали значения уровня глюкозы в крови в различных временных точках по оси y, а временные точки - по оси x, и вычисляли биологический период полужизни и максимальный гипогликемический эффект для РВ-105 и его ПЭГилированных конъюгатов. Результаты показаны на фиг.37, снижение случайного уровня глюкозы в крови у мышей в результате действия РВ-105, РВ-106, РВ-119 и РВ-120 зависело от времени. Их биологический период полужизни составлял соответственно 6,0, 21,7, 24,1 и 26,1 ч, и биологический период полужизни увеличивался вместе в увеличением молекулярного веса ПЭГ. Пиковое время гипогликемического эффекта составляло примерно 1 ч (РВ-105) и 4 ч (РВ-106, РВ-119 и РВ-120). Пиковые значения гипогликемического эффекта составляли соответственно 35,0%, 50,9% 48,2% и 42,2% (фиг.37А). По вычисленной площади под кривой зависимости гипогликемического эффекта от времени РВ-106, РВ-119 и РВ-120 все значительно увеличивали гипогликемический эффект РВ-105 (в 3-4 раза). А суммарный эффект увеличивался с увеличением молекулярного веса (фиг.37В). Результаты эксперимента указывают на то, что ПЭГилирование не снижает гипогликемическую активность РВ-105 и значительно увеличивает продолжительность гипогликемического эффекта и увеличивает суммарный гипогликемический эффект при молекулярном весе в диапазоне 20-27 кДа. Из результатов видно, что когда молекулярный вес ПЭГ находится в диапазоне 20-27 кДа, конъюгаты вариантов эксендина по настоящему изобретению, РВ-106, РВ-119 и РВ-120, имеют более высокие пиковые значения гипогликемического эффекта по сравнению с неконъюгированным РВ-105. Кроме того, эти конъюгаты имеют значительно более продолжительный гипогликемический эффект, а суммарный гипогликемический эффект увеличивается с увеличением молекулярного веса ПЭГ, что обеспечивает более хороший комбинированный гипогликемический эффект.

Пример 22. Тестирование РВ-101, РВ-105, РВ-106 и РВ-120 на способность вызывать рвоту у голубей

Здоровых голубей, самок и самцов, распределяли по 7 группам по 4-8 голубей в каждой группе. РВ-101 (3 мг/кг, N=4 или 6 мг/кг, N=8), РВ-105 (3 мг/кг, N=4 или 6 мг/кг, N=8), РВ-106 (3 мг/кг, N=4 или 6 мг/кг, N=8) и РВ-120 (6 мг/кг, N=8) вводили по отдельности с помощью болюсной инъекции подкожно. Продолжительность рвоты и задержку рвоты (период от введения дозы до первой рвоты) наблюдали и регистрировали с помощью электронной системы наблюдения в течение 24 ч после введения соединений. Время рвоты определяли, начиная с вытягивания шеи, открывания рта, подрагивания конечностей, сокращений брюшины и до успокоения или окончания рвоты. Из предшествующих экспериментов было известно, что рвота не возникает в норме, например, без введения соединений, а введение РВ-101 (3 и 6 мг/кг) и РВ-105 (3 и 6 мг/кг) вызывает существенную рвоту в зависимости от дозы. Для РВ-106 (3 и 6 мг/кг) и РВ-120 (3 и 6 мг/кг) время задержки рвоты значительно увеличилось (примерно в 5-18 раз, см. фиг.38А), а время рвоты было значительно снижено (снижено примерно на 50-70%, см. фиг.38В) по сравнению с группами, которым вводили соответствующие дозы РВ-101 и РВ-105. Для дозировки 6 мг/кг различия были статистически достоверными (р<0,05). Результаты указывают на то, что ПЭГилирование значительно снижает рвоту, вызываемую эксендином и его вариантами.

Пример 23. Системная аллергическая реакция и эффекты на вес тела, вызываемые РВ-101, РВ-105 и РВ-106 у морских свинок

Использовали 44 самца морских свинок, и вес тела каждой морской свинки составлял примерно 300 г. Их распределяли по 5 группам, а именно: группа, которой вводили физиологический раствор (N=10), РВ-101 (N=10), РВ-105 (N=10), РВ-106 (N=10) и группа, которой вводили альбумин (N=4). Физиологический раствор (1 мл/кг), РВ-101 (100 мкг/кг), РВ-105 (100 мкг/кг), РВ-106 (100 мкг/кг) и куриный овальбумин (80 мкг/кг) соответственно вводили с помощью подкожных инъекций три раза через день. Через 14 дней после последней инъекции стимулирующее количество физиологического раствора (1 мл/кг), РВ-101 (300 мкг/кг), РВ-105 (300 мкг/кг), РВ-106 (300 мкг/кг) и куриного овальбумина (240 мкг/кг) соответственно вводили с помощью инъекций в вену пальца ноги. Сразу после инъекций наблюдали реакцию у животных в течение 0-3 ч после стимуляции. Симптомы аллергической реакции у животных регистрировали, как показано в таблице 2, и оценивали, как показано в таблице 3 (полуколичественно).

Таблица 2
Симптомы аллергической реакции у животных
0 - Норма 7 - Одышка 14 - Аллюр
1 - Беспокойство 8 - Мочеиспускание 15 - Прыжки
2 - Шерсть дыбом 9 - Дефекация 16 - Временное облегчение
3 - Дрожание 10 - Слезы 17 - Спазмы
4 - Чешет нос 11 - Затрудненное дыхание 18 - Кружение
5 - Чиханье 12 - Хрипы 19 - Поверхностное дыхание
6 - Кашель 13 - Пурпура 20 - Смерть

Таблица 3
Оценка степеней системной аллергической реакции у животных и полуколичественный стандарт
0 - 0 Отрицательная аллергическая реакция
Симптомы 1-4 + 1 Слабая отрицательная аллергическая реакция
Симптомы 5-10 ++ 2 Положительная аллергическая реакция
Симптомы 11-19 +++ 3 Сильная положительная аллергическая реакция
20 ++++ 4 Очень сильная положительная аллергическая реакция

Кривую строили, откладывая временные точки по оси х и степени аллергического ответа (полуколичественную оценку) по оси y, как показано на фиг.39. У свинок из группы, которой вводили физиологический раствор, не наблюдалось никакой аллергической реакции, то есть они показывали отрицательную аллергическую реакцию. Свинки из группы, которой вводили альбумин, умерли сразу после стимуляции (за промежуток времени меньше 2 мин), то есть они имели очень сильную положительную аллергическую реакцию. У морских свинок из групп, которым вводили РВ-101 и РВ-105, наблюдался иммунный ответ, то есть положительная аллергическая реакция. РВ-101 и РВ-105 представляют собой полипептиды, имеющие 39 аминокислотных остатков в длину, которые могут вызывать продукцию антител in vivo после введения соединений в течение длительного времени (Buse et al. Effects of exenatide (exendin-4) on glycemic control over 30 weeks in sulfonylurea-treated patients with type 2 diabetes. Diabetes Care. 2004; 27: 2628-2635). А ПЭГилированный (ПЭГ20000) конъюгат РВ-105 (РВ-106) приводил к слабой отрицательной аллергической реакции у морских свинок. Этот результат указывает на то, что ПЭГилирование (РВ-106) способно значительно снизить иммуногенность РВ-101 или РВ-105 и аллергическую реакцию.

Кривая зависимости веса тела морских свинок (ось y) от времени (ось х) (фиг.40) указывает на то, что вес тела морских свинок в группе, которой вводили физиологический раствор, непрерывно увеличивался во время сенсибилизации (вес тела увеличился примерно на 38% за 18-дневный эксперимент). Вес тела не снижался через 4 дня после двух последовательных доз альбумина (по сравнению с группой, которой вводили физиологический раствор). Однако вес тела свинок, соответственно, снижался примерно на 8% и 11% (p<0,05) через 4 дня после двух последовательных доз РВ-101 (100 мкг/кг) или РВ-105 (100 мкг/кг). Вес тела морских свинок снижался больше после введения эквивалентного количества РВ-106 (по сравнению с РВ-101 или РВ-105). А введение доз РВ-106 приводило к дополнительному снижению, соответственно, примерно на 8% и 11% (p<0,05) по сравнению с введением РВ-101 и РВ-105. Вес тела морских свинок в группах, получавших РВ-101, РВ-105 и РВ-106, восстанавливался через 12 дней после отмены соединений до значений, сравнимых с весом животных в группе, получавшей физиологический раствор.

Пример 24. Эффект РВ-105, РВ-106, РВ-119 и РВ-120 на вес тела крыс и количество потребляемой пищи

В эксперименте использовали 24 здоровых самца крыс SD, вес которых составлял примерно 200 г. Крыс распределяли по 5 группам: физиологический раствор (1 мл/кг, N=4), РВ-105 (100 мкг/кг, N=5), РВ-106 (100 мкг/кг, N=5), РВ-119 (100 мкг/кг, N=5) и РВ-120 (100 мкг/кг, N=5). Физиологический раствор и лекарственные соединения вводили подкожно с помощью инъекций через день три раза. Вес тела крыс и потребление пищи наблюдали каждый день.

Кривая зависимости веса тела (ось y) от времени (ось х) (фиг.41А) показала, что вес тела крыс в группе, которой вводили физиологический раствор, непрерывно повышался в ходе введения (вес тела увеличился на 33,4% в течение 9 дней эксперимента). По сравнению с группой, которой вводили физиологический раствор, вес тела (показателем веса тела являлась площадь под кривой (AUC)) снижался примерно на 5,3% (p<0,05) через 9 дней после последовательного трехкратного введения РВ-105 (100 мкг/кг). Введение эквивалентного количества РВ-106, РВ-119 и РВ-120 приводило к большему снижению веса относительно РВ-105. Вес тела (показателем веса тела являлась AUC) соответственно снижался примерно на 7%, 8% и 8% (p<0,05) в случае введения РВ-106, РВ-119 и РВ-120 по сравнению с введением РВ-105.

Кривая, по оси х которой откладывали временные точки, а по оси y - количество потребляемой пищи (фиг.41В), показала, что количество потребляемой пищи у крыс, которым вводили физиологический раствор, оставалось таким же. По сравнению с введением физиологического раствора количество потребляемой пищи (показателем потребляемой пищи являлась AUC) снижалось примерно на 16% после трехкратного последовательного введения РВ-105 (100 мкг/кг). Введение эквивалентного количества РВ-106, РВ-119 и РВ-120 приводило к большему снижению потребления пищи относительно РВ-105. Дополнительное снижение на 18%, 19% и 19% (p<0,05) было получено в случае введения РВ-106, РВ-119 и РВ-120 по сравнению с введением РВ-105.

Хорошо известно, что эксенатид может снижать вес тела у пациентов с ожирением и вызывать тошноту и рвоту, причем механизм их действия ассоциирован с ингибированием пищевого центра и активацией рвотного центра в центральной нервной системе (Larsen. Mechanisms behind GLP-1 induced weight loss, Br. J. Diabetes Vasc. Dis. 2008; 8 (Suppl 2): S34-S41; Schick et al. Glucagonlike peptide 1 (7-36)-amide acts at lateral and medial hypothalamic sites to suppress feeding in rats. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 2003; 284: R1427-35). Однако для конъюгатов эксендина или его вариантов трудно преодолевать гематоэнцефалический барьер вследствие увеличившегося молекулярного веса, и поэтому они в меньшей степени вызывают рвоту по сравнению с РВ-101 (см. пример 22). Соответственно, перед проведением эксперимента автор изобретения ожидал, что конъюгаты эксендина и его вариантов будут снижать эффект эксендина на потребление пищи и вес тела, который опосредован центральной нервной системой. Однако автор изобретения с удивлением обнаружил, что ПЭГ-конъюгаты эксендина и его вариантов имели значительно более выраженный эффект снижения веса тела и потребления пищи, несмотря на то, что эксендин дикого типа и неконъюгированный вариант эксендина, оба, снижали вес тела и потребление пищи.

Пример 25. Исследование фармакокинетики РВ-101 и РВ-105

Самцов крыс SD (вес тела 250-300 г, приобретены в Shanghai Lab Animal Center, Chinese Science Academy) анестезировали 30%-ным хлоральгидратом (300 мг/кг, внутрибрюшинно). Катетеризацию бедренной артерии и вены проводили, делая разрез в правом верхнем крае паховой области и надсекая бедренную артерию и вену (использовали полиэтиленовую трубку РЕ50, U.S. Beckton Dickinson Corporation). Катетер в правой артерии использовали для забора образцов крови, а катетер в правой вене использовали для введения соединений. РЕ-трубку направляли от загривка под кожей вдоль спины. Катетер заполняли раствором гепарина (200 Ед/мл) и разрез зашивали. После проведения операции крыс содержали по отдельности в индивидуальных клетках, и давали восстановиться в течение более 12 ч. В клетках крыс с катетерами не ограничивали в подвижности и пище. Крыс распределяли по группам РВ-101 и РВ-105 (3-6 крыс в каждой группе). 5 мкг/кг агента вводили болюсной инъекцией в правую бедренную вену. Образцы крови соответственно отбирали через 0,08, 0,25, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6 часов после введения соединения. Образцы крови помещали в микроцентрифужную пробирку Эппендорфа и центрифугировали для получения плазмы (5000 об/мин, 5 мин) и хранили при -20°С до использования. Концентрацию лекарственных соединений в образцах определяли с помощью набора Exenatide EIA Kit (Phoenix Pharmaceuticals, Inc., USA) после завершения получения образцов каждой группы. Кривые зависимости концентрации лекарственного средства РВ-101 и РВ-105 от времени строили, откладывая концентрации в плазме по оси y, а время - по оси х. Результаты показали, что у крыс РВ-105 и РВ-101 имели аналогичные профили распределения и выведения.

Параметрический статистический анализ методом без использования камерной модели проводили с использованием программного обеспечения Kinetica 5.0 ( Thermo Fisher Scientific Inc., USA) для вычисления фармакокинетических параметров РВ-101 и РВ-105 (Cmax, AUC0-t, AUC0-∞, t1/2, MRT, CL и Vss и т.д.). Результаты показаны в таблице 4. Период полужизни в плазме для РВ-101 и РВ-105 составлял, соответственно, 4,8±0,7 и 4,9±1,4 ч (РВ-105 относительно РВ-101, Р>0,05). Площадь под кривой зависимости концентрации лекарственного средства от времени составляла, соответственно, 45,4±1,6 и 47,9±19,0 нг·ч/мл (РВ-105 относительно РВ-101, Р>0,05). Экспериментальные результаты показали, что РВ-105 и РВ-101 имели аналогичные фармакокинетические свойства.

Таблица 4
Фармакокинетические параметры РВ-101 и РВ-105 (3-6 крыс в каждой группе)
N Cmax (нг/мл) AUC0-t (нг·ч/мл) AUC0-∞ (нг·ч/мл)
РВ-101 3 33,0±2,0 45,4±1,6 85,2±4,4
РВ-105 6 36,8±10,6 47,9±19,0 103,8±51,1

Т1/2 (ч) MRT (ч) CL (мл/(ч·кг)) Vss (мл/кг)
РВ-101 4,8±0,7 6,9±0,7 59,0±3,1 403,2±21,3
РВ-105 4,9±1,4 7,2±2,2 117,7±58,5 563,8±186,1

Пример 26. Исследование фармакокинетики РВ-105 и его ПЭГилированных конъюгатов

Самцов крыс SD (вес тела 250-300 г, приобретены в Shanghai Lab Animal Center, Chinese Science Academy) анестезировали 30%-ным хлоральгидратом (300 мг/кг, внутрибрюшинно). Катетеризацию бедренной артерии и вены проводили, делая разрез в правом верхнем крае паховой области и надсекая бедренную артерию и вену (использовали полиэтиленовую трубку РЕ50, U.S. Beckton Dickinson Corporation). Катетер в правой артерии использовали для забора образцов крови, а катетер в правой вене использовали для введения соединений. РЕ-трубку направляли от загривка под кожей вдоль спины. Катетер заполняли раствором гепарина (200 Ед./мл) и разрез зашивали. После проведения операции крыс содержали по отдельности в индивидуальных клетках и давали восстановиться в течение более 12 ч. В клетках крыс с катетерами не ограничивали в подвижности и пище. Крыс распределяли по 6 группам (по 3 крысы в каждой группе): РВ-105, РВ-110, РВ-106, РВ-107, РВ-108 и РВ-109. 5 мкг/кг каждого агента вводили болюсной инъекцией в правую бедренную вену и образцы крови (0,2 мл) отбирали в различных временных точках. В течение первых 48 ч после введения соединений образцы крови отбирали, используя трубку РЕ50, а после 48 ч образцы крови отбирали из хвостовой вены. Конкретнее, для группы РВ-105 образцы отбирали через 0,08, 0,25, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6 ч после введения соединения, для группы РВ-110 - через 0,08, 0,25, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 ч, для группы РВ-106 - через 0,08, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96 ч, для группы РВ-107 - 0,08, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 108, 120, 132, 144 ч, для групп РВ-108 и РВ-109 образцы отбирали через 0,08, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 108, 120, 132, 144, 156, 168 ч после введения соединения. Образцы крови помещали в микроцентрифужную пробирку Эппендорфа и центрифугировали для получения плазмы (5000 об/мин, 5 мин) и хранили при -20°С до использования. Концентрацию лекарственных средств в образцах определяли с помощью набора Exenatide EIA Kit (Phoenix Pharmaceuticals, Inc., USA) после завершения получения образцов плазмы каждой группы. Кривые зависимости концентрации ПЭГилированных конъюгатов от времени строили, откладывая концентрации в плазме по оси y, а время - по оси х. Результаты показали, что РВ-105 и его ПЭГилированные конъюгаты быстро распределялись по тканям и медленно выводились (см. фиг.43).

Параметрический статистический анализ методом без использования камерной модели проводили с использованием программного обеспечения Kinetica 5.0 (Thermo Fisher Scientific Inc., USA) для вычисления фармакокинетических параметров РВ-105 и его ПЭГилированных конъюгатов (Cmax, AUC0-1, AUC0-∞, t1/2, MRT, CL и Vss и т.д.) Результаты показаны в таблице 5. Период полужизни в плазме для РВ-105 составлял 2,9±0,1 ч, а период полужизни в плазме ПЭГилированных конъюгатов увеличивался по мере увеличения молекулярного веса ПЭГ. Площадь под кривой зависимости концентрации от времени для РВ-105 составляла 18,2±1,9 нг·ч/мл, а площадь под кривой зависимости концентрации от времени для ПЭГилированных конъюгатов увеличивалась по мере увеличения молекулярного веса ПЭГ. На фиг.44А и 44В показана, соответственно, взаимосвязь между молекулярным весом ПЭГ в ПЭГилированных конъюгатах и периодом полужизни в плазме, а также площадью под кривой зависимости концентрации лекарственного средства от времени.

Таблица 5
Фармакокинетические параметры РВ-105 и его ПЭГилированных конъюгатов (3 крысы в каждой группе)
Cmax (нг/мл) AUC0-t (нг·ч/мл) AUC0-∞ (нг·ч/мл)
РВ-105 2,30±2,8 18,2±1,9 24,5±2,2
РВ-110 76,1±14,5 101,0±25,8 165,5±45,3
РВ-106 149,2±5,7 942,5±84,6 1146,0±65,2
РВ-107 128,2±15,5 1485,2±123,0 1879,3±82,1
РВ-108 148,1±24,5 1780,7±279,9 2202,5±318,8
РВ-109 240,1±20,9 5478,8±654,3 7033,4±861,6

Т1/2 (ч) MRT (ч) CL (мл/ч·кг) Vss (мл/кг)
РВ-105 2,9±0,1 4,1±0,2 207,8±20,9 846,3±79,0
РВ-110 6,1±0,8 9,6±1,0 37,5±13,5 340,1±92,9
РВ-106 42,6±8,1 47,3±11,6 4,4±0,3 209,0±57,3
РВ-107 70,5±2,6 75,3±9,5 2,7±0,1 201,6±27,3
РВ-108 74,8±4,5 90,2±10,2 2,3±0,3 193,6±50,0
РВ-109 103,6±2,4 102,0±6,8 0,7±0,1 74,8±10,4

Варианты эксендина по настоящему изобретению имеют улучшенные фармакокинетические свойства, значительно снижают уровень глюкозы в крови и имеют сравнимую или лучшую биологическую активность. Конъюгаты вариантов эксендина, полученные в результате сайт-специфичного присоединения полимеров через тиольные группы цистеинов, значительно увеличивают период полужизни вариантов эксендина и сохраняют высокую биологическую активность.

Настоящее изобретение проиллюстрировано конкретными примерами. Однако для опытного специалиста будет ясно, что настоящее изобретение не ограничено конкретными примерами, и опытный специалист может внести в объем настоящего изобретения некоторые изменения или модификации, не выходя за рамки сущности и объема настоящего изобретения. Эти изменения и модификации входят в объем настоящего изобретения.


НОВЫЙ ВАРИАНТ ЭКСЕНДИНА И ЕГО КОНЪЮГАТ
НОВЫЙ ВАРИАНТ ЭКСЕНДИНА И ЕГО КОНЪЮГАТ
НОВЫЙ ВАРИАНТ ЭКСЕНДИНА И ЕГО КОНЪЮГАТ
НОВЫЙ ВАРИАНТ ЭКСЕНДИНА И ЕГО КОНЪЮГАТ
НОВЫЙ ВАРИАНТ ЭКСЕНДИНА И ЕГО КОНЪЮГАТ
НОВЫЙ ВАРИАНТ ЭКСЕНДИНА И ЕГО КОНЪЮГАТ
НОВЫЙ ВАРИАНТ ЭКСЕНДИНА И ЕГО КОНЪЮГАТ
НОВЫЙ ВАРИАНТ ЭКСЕНДИНА И ЕГО КОНЪЮГАТ
НОВЫЙ ВАРИАНТ ЭКСЕНДИНА И ЕГО КОНЪЮГАТ
НОВЫЙ ВАРИАНТ ЭКСЕНДИНА И ЕГО КОНЪЮГАТ
НОВЫЙ ВАРИАНТ ЭКСЕНДИНА И ЕГО КОНЪЮГАТ
НОВЫЙ ВАРИАНТ ЭКСЕНДИНА И ЕГО КОНЪЮГАТ
НОВЫЙ ВАРИАНТ ЭКСЕНДИНА И ЕГО КОНЪЮГАТ
НОВЫЙ ВАРИАНТ ЭКСЕНДИНА И ЕГО КОНЪЮГАТ
НОВЫЙ ВАРИАНТ ЭКСЕНДИНА И ЕГО КОНЪЮГАТ
НОВЫЙ ВАРИАНТ ЭКСЕНДИНА И ЕГО КОНЪЮГАТ
НОВЫЙ ВАРИАНТ ЭКСЕНДИНА И ЕГО КОНЪЮГАТ
НОВЫЙ ВАРИАНТ ЭКСЕНДИНА И ЕГО КОНЪЮГАТ
НОВЫЙ ВАРИАНТ ЭКСЕНДИНА И ЕГО КОНЪЮГАТ
НОВЫЙ ВАРИАНТ ЭКСЕНДИНА И ЕГО КОНЪЮГАТ
НОВЫЙ ВАРИАНТ ЭКСЕНДИНА И ЕГО КОНЪЮГАТ
НОВЫЙ ВАРИАНТ ЭКСЕНДИНА И ЕГО КОНЪЮГАТ
НОВЫЙ ВАРИАНТ ЭКСЕНДИНА И ЕГО КОНЪЮГАТ
НОВЫЙ ВАРИАНТ ЭКСЕНДИНА И ЕГО КОНЪЮГАТ
НОВЫЙ ВАРИАНТ ЭКСЕНДИНА И ЕГО КОНЪЮГАТ
НОВЫЙ ВАРИАНТ ЭКСЕНДИНА И ЕГО КОНЪЮГАТ
НОВЫЙ ВАРИАНТ ЭКСЕНДИНА И ЕГО КОНЪЮГАТ
НОВЫЙ ВАРИАНТ ЭКСЕНДИНА И ЕГО КОНЪЮГАТ
НОВЫЙ ВАРИАНТ ЭКСЕНДИНА И ЕГО КОНЪЮГАТ
НОВЫЙ ВАРИАНТ ЭКСЕНДИНА И ЕГО КОНЪЮГАТ
НОВЫЙ ВАРИАНТ ЭКСЕНДИНА И ЕГО КОНЪЮГАТ
НОВЫЙ ВАРИАНТ ЭКСЕНДИНА И ЕГО КОНЪЮГАТ
НОВЫЙ ВАРИАНТ ЭКСЕНДИНА И ЕГО КОНЪЮГАТ
НОВЫЙ ВАРИАНТ ЭКСЕНДИНА И ЕГО КОНЪЮГАТ
НОВЫЙ ВАРИАНТ ЭКСЕНДИНА И ЕГО КОНЪЮГАТ
НОВЫЙ ВАРИАНТ ЭКСЕНДИНА И ЕГО КОНЪЮГАТ
НОВЫЙ ВАРИАНТ ЭКСЕНДИНА И ЕГО КОНЪЮГАТ
НОВЫЙ ВАРИАНТ ЭКСЕНДИНА И ЕГО КОНЪЮГАТ
НОВЫЙ ВАРИАНТ ЭКСЕНДИНА И ЕГО КОНЪЮГАТ
НОВЫЙ ВАРИАНТ ЭКСЕНДИНА И ЕГО КОНЪЮГАТ
НОВЫЙ ВАРИАНТ ЭКСЕНДИНА И ЕГО КОНЪЮГАТ
НОВЫЙ ВАРИАНТ ЭКСЕНДИНА И ЕГО КОНЪЮГАТ
НОВЫЙ ВАРИАНТ ЭКСЕНДИНА И ЕГО КОНЪЮГАТ
НОВЫЙ ВАРИАНТ ЭКСЕНДИНА И ЕГО КОНЪЮГАТ
НОВЫЙ ВАРИАНТ ЭКСЕНДИНА И ЕГО КОНЪЮГАТ
НОВЫЙ ВАРИАНТ ЭКСЕНДИНА И ЕГО КОНЪЮГАТ
НОВЫЙ ВАРИАНТ ЭКСЕНДИНА И ЕГО КОНЪЮГАТ
НОВЫЙ ВАРИАНТ ЭКСЕНДИНА И ЕГО КОНЪЮГАТ
Источник поступления информации: Роспатент

Показаны записи 1-1 из 1.
20.04.2020
№220.018.1607

Композиция, включающая агонист рецептора glp-1 и агонист глюкагонового рецептора, и ее применение

Предложены фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения неалкогольной жировой болезни печени, похудения, снижения уровня сахара в крови, снижения уровня липидов, ингибирования аппетита у субъекта, снижения уровня общего холестерина в сыворотке и/или снижения содержания...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002719144
Дата охранного документа: 17.04.2020
+ добавить свой РИД