СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛУТАТИОНА В МОДЕЛЬНЫХ ВОДНЫХ РАСТВОРАХ МЕТОДОМ ЦИКЛИЧЕСКОЙ ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИИ НА ГРАФИТОВОМ ЭЛЕКТРОДЕ, МОДИЦИФИРОВАННОМ КОЛЛОИДНЫМИ ЧАСТИЦАМИ ЗОЛОТА

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способу определения содержания глутатиона в водных растворах методом циклической вольтамперометрии.

Предложена методика вольтамперометрического определения глутатиона в модельных растворах на платиновом электроде в растворе фонового электролита 0,05 М H₂SO₄ при сканировании потенциала от 0,0 до,1,3 В со скоростью развертки потенциала 20 мВ/с. Нижняя граница определяемых содержаний глутатиона составляет 1,9·10^-5 М [Будников Г.К., Зиятдинова Г.К., Валитова Я.Р. Электрохимическое определение глутатиона // Журнал аналитической химии. - 2004. - Т.59. - №6. - С.645-648]. Недостатками способа являются низкая чувствительность определения глутатиона и использование электрода из дорогостоящего материала - платины.

Предложена методика электрохимического определения глутатиона в водных растворах биологически активных веществ в режиме катодной вольтамперометрии на ртутно-пленочном электроде в боратном буферном растворе фонового электролита рН 9,18 при сканировании потенциала от 0,0 до -0,8 В со скоростью развертки потенциала 20 мВ/с.

Предел обнаружения составляет 6,3·10^-5 моль/л [Короткова Е.И., Дорожко Е.В. Патент №2441225 от 27.01.2012. Бюл. №3 // Способ определения глутатиона в биологически активных добавках методом катодной вольтамперометрии]. Недостатками являются низкая чувствительность определения глутатиона и использование токсичного индикаторного ртутно-пленочного электрода.

Предложен способ определения глутатиона методом циклической вольтамперометрии в растворе фонового электролита 0.05 М Na₂B₄O₇ при рН=9.2 на ртутно-капающем электроде, при сканировании потенциала от -0,8 до -0,2 В со скоростью 5 мВ/с. Нижняя граница определяемых содержаний составляет 1,5·10^-4 моль/л [D. Huska, О. Zitka, V. Adam, M. Beklova, S. Křižkova, L. Zeman, А. Horna, L/ Havel, J. Zehnalek, R. Kizek A sensor for investigating the interaction between biologically important heavy metals and glutathione // Czech J. Anim. Sci., 52, 2007 (2): 37-43]. Недостатками являются низкая чувствительность определения глутатиона и использование токсичного индикаторного ртутно-капающего электрода.

Электрохимическое определение глутатиона проводили методом циклической вольтамперометрии в модельных растворах, имитирующих состав вина, состоящий из 12% этанола, 0,05 М винной кислоты с добавлением NaOH до рН 3,6 на угольно-настовых электродах из различных углеродсодержащих материалов в растворе фонового электролита 0,1 М KCl при сканировании потенциала от -0,5 до +1,3 В со скоростью 100 мВ/с. Предел обнаружения глутатиона на угольно-пастовом электроде, приготовленном из графита, составляет 4,47·10^-6 М; на угольно-пастовом электроде, приготовленном из микросфер - составляет 6,32·10^-6 М; на угольно-пастовом электроде, приготовленном из нанотрубок, равен 5,48·10^-6 М [Apetrei С., Apetrei I.M., De Saja J. A. and Rodriguez-Mendez М.L. «Carbon paste electrodes made from different carbonaceous materials: application in the study of antioxidants» // Sensors. - 2011. - V.11. - P.328-1344]. (Прототип). Недостатками являются низкая чувствительность определения глутатиона и использование многосоставного фонового электролита.

В работе была поставлена задача снизить предел и нижнюю границу определяемых содержаний глутатиона по высоте анодного максимума на циклической кривой полученного на графитовом электроде (ГЭ), модифицированном коллоидными частицами золота методом циклической вольтамперометрии.

Поставленная задача достигается тем, что проводят электроокисление глутатиона на поверхности модифицированного ГЭ. Модифицирование поверхности ГЭ коллоидными частицами золота проводят из золя золота (мольное соотношение HAuCl₄:Na₃C₆H₅O₇:NaBH₄=1:15:5) в течение 300 с при потенциале электролиза Е_э=-1,0 В. Вольтамперные зависимости регистрируют в растворе фонового электролита 0,1 М NaOH при скорости развертки, равной 100 мВ/с, в диапазоне потенциалов от -1,0 до +1,0 В относительно насыщенного хлоридсеребряного электрода (нас.х.э.). Концентрацию глутатиона определяют по высоте анодного максимума на анодной ветви циклической кривой от 0,3 до 0,6 В. Новым в способе является то, что для получения полезного сигнала, зависящего от концентрации глутатиона, используется ГЭ, модифицированный коллоидными частицами золота, позволяющий увеличить каталитическую активность за счет увеличения рабочей поверхности электрода, увеличения числа активных центров и большей электрокаталитической активностью коллоидных частиц золота по сравнению с ионами золота (III).

В предлагаемом способе впервые установлена способность глутатиона окисляться на ГЭ, модифицированном коллоидными частицами золота, полученными по боргидрид-цитратной методике.

В качестве индикаторного электрода применяли ГЭ, модифицированный коллоидными частицами золота (в прототипе применяли различные угольно-пастовые электроды).

Использование таких электродов обусловлено высокой химической и электрохимической устойчивостью графита, широкой областью рабочих потенциалов, простотой изготовления, механического обновления поверхности и требованиями техники безопасности (не используются опасные или вредные вещества при работе с электродом).

В данном изобретении предлагается способ модифицирования поверхности электрода коллоидными частицами золота из аликвоты его золя объемом 0,1 мл (мольное соотношение HAuCl₄:Na₃C₆H₅O₇:NaBH₄=1:15:5). Проводили модифицирование коллоидными частицами золота поверхности углеродсодержащих электродов трех типов: стеклоуглеродного, графитового, сажевого. Модифицированная поверхность всех исследуемых электродов чувствительна к присутствию глутатиона в растворе, что позволяет судить о его наличии. Максимальное значение регистрируемого тока наблюдается у графитового электрода, модифицированного коллоидными частицами золота.

Предлагаемый в заявляемом изобретении фоновый электролит 0,1 М NaOH позволяет определять низкие содержания глутатиона с хорошей воспроизводимостью при минимальной концентрации, равной 1·10^-12 М, что соответствует минимально определяемой концентрации (в прототипе предел обнаружения 4,47·10^-6 М). Тогда как в кислых фоновых электролитах (0,1-1 М H₂SO₄ и 0,1-1 М HClO₄) наблюдается разовый прирост максимума окисления глутатиона, что свидетельствует о невозможности использования данных фоновых электролитов при концентрации, равной 1·10^-7 M.

Рассчитанные коэффициенты чувствительности исследованных электродов, модифицированных коллоидными частицами золота из аликвоты 0,1 мл золя (мольное соотношение HAuCl₄:Na₃C₆H₅O₇:NaBH₄=1:15:5), в растворе фонового электролита 0,1 М NaOH приведены в таблице 1. Из таблицы видно, что графитовый электрод, модифицированный коллоидными частицами золота из аликвоты его золя, имеет самый высокий коэффициент чувствительности.

На фиг.1 представлены циклические вольтамперные кривые глутатиона на поверхности графитового электрода, предварительно электрохимически модифицированного коллоидными частицами золота. Кривая 1 ан., 1 кат. ветвь - фон 0,1 М NaOH, кривая 2 ан., 2 кат. ветвь - C_Glu=2·10^-12 М, 3 ан., 3 кат. ветвь - C_Glu=4·10^-12 М, 4 ан., 4 кат. ветвь - C_Glu=6·10^-12 М.

Таким образом, установленные условия впервые позволили количественно определять содержание глутатиона на основе реакции электрокаталитического окисления глутатиона на поверхности графитового электрода, предварительно электрохимически модифицированного коллоидными частицами золота. Кривая 1 - фон 0,1 М NaOH, кривая 2 - C_Glu=2·10^-12 М, кривая 3 - C_Glu=4·10^-12 М (фиг.2).

Предлагаемый вольтамперометрический способ позволил повысить чувствительность определения (1·10^-12 М), что на несколько порядков ниже по сравнению с прототипом (табл.2).

Примеры конкретного выполнения:

Пример 1. Измерения были проведены в модельном растворе. Графитовый электрод помещают в электрохимическую ячейку (кварцевый стаканчик), заполненную 10 мл 0,1 М раствора HCl и добавкой 0,1 мл золя золота (мольное соотношение HAuCl₄:Na₃C₆H₅O₇:NaBH₄=1:15:5). Проводят электролиз раствора для модификации ГЭ коллоидными частицами золота при условии: Е_э=-1,0 В, τ_э=300 с. Для проверки работы электрода снимают вольтамперную кривую электроокисления золота при скорости развертки 50 мВ/с, в диапазоне от 0,20 до 1,00 В. На кривой регистрируется пик окисления золота при Е=0,70±0,10 В. Наличие пика золота свидетельствует об электроконцентрировании золота из боргидрид-цитратного золя золота, на поверхности графитового электрода. Затем проводят электролиз еще раз при тех же условиях, но не проводят съемку вольтамперной кривой. Полученный модифицированный графитовый электрод ополаскивают бидистиллированной водой и помещают в другую электрохимическую ячейку (кварцевый стаканчик), заполненную 10 мл 0,1 М раствора NaOH. He проводя накопления, регистрируют анодную ветвь, а затем катодную ветвь циклической вольтамперной кривой фонового электролита при скорости развертки 100 мВ/с, начиная с потенциала от минус 1,0 и до плюс 1,0 В. На анодной ветви вольтамперной кривой фонового электролита наблюдается анодный максимум в диапазоне потенциалов от +0,3 до +0,6 В. При добавлении раствора глутатиона происходит увеличение высоты анодного максимума в диапазоне потенциалов от +0,3 до +0,6 В.

Пример 2. Измерения были проведены в водопроводной воде.

Графитовый электрод помещают в электрохимическую ячейку (кварцевый стаканчик), заполненную 10 мл 0,1 М раствора HCl и добавкой 0,1 мл золя золота (мольное соотношение HAuCl₄:Na₃C₆H₅O₇:NaBH₄=1:15:5). Проводят электролиз раствора для модифицирования ГЭ коллоидными частицами золота при условии: Е_э=-1,0 В, τ_э=300 с. Для проверки работы электрода снимают вольтамперную кривую электроокисления золота при скорости развертки 50 мВ/с, в диапазоне от 0,20 до 1,00 В. На кривой регистрируют пик окисления золота при Е=0,70±0,10 В. Наличие пика золота свидетельствует об электроконцентрировании золота, из боргидрид-цитратного золя золота, на поверхности графитового электрода. Затем проводят электролиз еще раз при тех же условиях, но не проводят съемку вольтамперной кривой. Потом полученный модифицированный графитовый электрод ополаскивают бидистиллированной водой и помещают в другую электрохимическую ячейку (кварцевый стаканчик), заполненную 10 мл водопроводной воды с добавлением 1 мл 1 М раствора NaOH. He проводя накопления, регистрируют анодную ветвь, а затем катодную ветвь циклической вольтамперной кривой фонового электролита при скорости развертки 100 мВ/с, начиная с потенциала минус 1,0 и до плюс 1,0 В. На катодной ветви вольтамперной кривой фонового электролита наблюдается анодный максимум в диапазоне потенциалов от +0,3 до +0,6 В.

Затем добавляют 0,02 мл аттестованной смеси глутатиона концентрации 1·10^-12 М и, не проводя накопления, регистрируют анодную ветвь, а затем катодную ветвь циклической вольтамперной кривой фонового электролита при скорости развертки 100 мВ/с, начиная с потенциала минус 1,0 и до плюс 1,0 В. На катодной ветви вольтамперной кривой фонового электролита наблюдается анодный максимум в диапазоне потенциалов от +0,3 до +0,6 В (относительно нас.х.э.).

Делают 0,02 мл добавку аттестованной смеси глутатиона и снова регистрируют аналитический сигнал. По разнице высоты анодного максимума пробы и добавки вычисляют концентрацию глутатиона в растворе.

Таким образом, впервые установлена способность количественного определения глутатиона по анодным максимумам.

Предложенный способ прост, не используются токсические вещества из-за их отрицательного физиологического действия. Способ может быть применен в любой химической лаборатории, имеющей компьютеризированные анализаторы типа ТА или полярограф. Предложенный способ может быть использован для определения глутатиона в водных растворах.

Способ определения глутатиона в модельных растворах методом циклической вольтамперометрии на графитовом электроде, модифицированном коллоидными частицами золота