Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ТИТРОВАНИЯ ГРУППОВЫХ АНТИТЕЛ СИСТЕМЫ АВО

Изобретение относится к медицине, в частности к клинической лабораторной диагностике, может быть использовано для предотвращения антитело-опосредованной реакции отторжения при проведении АВО-несовместимых трансплантаций органов.

Недостаток донорских органов приводит к увеличению числа пациентов, ожидающих трансплантацию. Одним из путей, дающих возможность увеличить число доноров печени, почки, сердца, является преодоление иммунологического барьера - АВО-несовместимости. Несовместимость по АВО зачастую приводит к отказу от подходящего по другим параметрам донора. Трансплантация АВО-несовместимого органа может привести к реакции опосредованного антителами молниеносного отторжения (hyperacute rejection). В зависимости от распределения групп крови в различных популяциях исключаются около 30-35% потенциальных доноров вследствие несовместимости по АВО.

Первые АВО-несовместимые трансплантации были проведены в середине прошлого века, однако результат был негативным в связи с реакцией молниеносного отторжения.

После введения в практику специфических анти-А или анти-В иммуносорбционных колонок (Glycosorb®) и анти-CD2O моноклональных антител (rituximab) в различных терапевтических режимах, АВО-несовместимая почечная трансплантация стала обычной процедурой в европейских странах, особенно в Швеции и Германии (Tyden G, Kumlien G, Genberg H, et al. (2005) ABO-incompatible kidney transplantations without splenectomy, using antigen-specific immunoadsorption and rituximab. Am JTransplant, 5:145-148).

Разработка предоперационного протокола подготовки для достижения целевого титра анти-А/В<1:16 в последние годы дала возможность снизить и поддерживать анти-А/В титры против группы опосредованной реакции отторжения, и проводить АВО-несовместимые трансплантации от доноров.

Основным фактором выживания трансплантата в этих случаях является предотвращение молниеносной реакции отторжения и установление аккомодации. Аккомодация означает отсутствие реакции антиген-антитело несмотря на наличие «чужеродного» антигена на эндотелиальных клетках сосудов трансплантата и наличие антител в крови реципиента (Takahashi КА. (2005) New concept of accomodation in ABO-incompatible kidney transplantation. Clin Transplant 19:Suppl 14, 76-85).

Точное определение титров групповых агглютининов системы АВО позволяет выбрать адекватную схему предоперационного протокола подготовки пациентов, надежно контролировать течение послеоперационного периода со своевременным определением показаний для назначения соответствующей корригирующей терапии при проведении АВО-несовместимых трансплантаций органов.

Важно отметить, что реципиентами части печени в большинстве случаев являются дети. Известно, что у детей титры агглютининов ниже, чем у взрослых из-за несовершенства иммунной системы, которая достигает зрелости к 5-10 году жизни. В этих случаях предъявляются особые требования к точности титрования групповых агглютининов.

Известен рекомендуемый Приказом МЗ РФ №2 от 09.01.1998 метод титрования антител в солевой среде на плоскости (Изогемагглютинирующий тест серийных разведений в солевой среде на плоскости - Приказ МЗ РФ №2 от 09.01.1998 г. Об утверждении инструкций по иммуносерологии), который выбран нами в качестве прототипа.

Он регламентирует определение титров естественных α и β антител, полных иммунных антител системы АВО, и неполных иммунных антител системы АВО с проведением исследований на белых пластинах со смачиваемой поверхностью с использованием не менее 1 мл сыворотки крови в каждой реакции. Известный способ предполагает выполнение разведений сыворотки крови, смешивание их с 3% взвесью стандартных эритроцитов, длительную инкубацию (45-60 минут) и оценку результатов по наибольшему разведению сыворотки, в котором наступила агглютинация стандартных эритроцитов. Причем для определения титров иммунных антител требуется предварительная подготовка сыворотки в виде специального разведения и прогревания.

Как оказалось на практике, способ-прототип является не достаточно чувствительным и наглядным, что негативно сказывается на результатах АВО-несовместимых трансплантаций, требует длительного времени для проведения исследования.

Известна также микротипирующая гелевая технология, предложенная французским ученым Y. Lapierre в 1986 году. Эта технология использует комбинацию методов агглютинации и гель-фильтрации. Все реакции проводятся в пластиковых диагностических карточках - ID-гелевая система, колонки которых содержат специальный гель, к которому добавляют эритроциты и сыворотки. После центрифугирования агглютинированные эритроциты задерживаются в верхних слоях геля, в то время как неагглютинированные эритроциты, беспрепятственно пройдя через гель, образуют осадок на дне пробирок.

Однако гелевая технология предназначена для скрининга антител, другими словами - для «качественной оценки» реакции антиген-антитело (установления самого факта произошедшей реакции).

Только в одной работе, ранее опубликованной нами, содержатся сведения об использовании гелевой технологии для титрования естественных антител (α и β агглютининов системы АВО) (Готье С.В., Цирульникова О.М. и др. Опыт АВО-несовместимых трансплантаций печени. Вестник трансплантологии и искусственных органов, 2011, №2, с.21-28).

Однако использование гелевых карт, содержащих модифицированный Sephadex с нанесенным на него IgG (кролика), C3d-компонентом системы комплимента фирмы Diamed для титрования естественных антител, не позволило получить стабильные результаты, что было подтверждено постановкой параллельных реакций солевым методом на плоскости. Результаты титрования были противоречивыми, надежную методику титрования отработать не удалось.

Нами поставлена задача - создать лабораторный метод, позволяющий точно, надежно и наглядно производить титрование групповых антител системы АВО, в том числе у пациентов с низкой исходной концентрацией агглютининов в крови; более экономный в плане расходования сыворотки крови, требующий меньших временных затрат.

Технический результат, достигаемый при осуществлении предлагаемого способа, заключается в повышении точности, чувствительности титрования естественных, полных и неполных иммунных антител системы АВО, обеспечении его наглядности, снижении травматичности за счет использования микродоз крови обследуемого, что особенно важно в педиатрии, а также в упрощении способа за счет сокращения времени проведения исследования.

Разработанный нами способ позволяет точнее на 1-3 разведения сыворотки крови, по сравнению с прототипом, определять титр исследуемых антител; выявлять появление сенсибилизации пациента на более ранних стадиях ее развития. Он является более наглядным, поскольку исключает трудно интерпретируемые результаты за счет возможности проведения визуальной оценки реакции агглютинации в толще колонки гелевой карты; требует меньше времени для проведения исследования за счет сокращения времени инкубации реагентов. При этом результаты могут быть сохранены для сравнения с результатами дальнейших исследований, что невозможно при титровании по способу-прототипу.

Нами эмпирически подобраны режимы, обеспечивающие возможность титрования агглютининов системы АВО с помощью гелевых карт, то есть возможность «количественной оценки» реакции антиген-антитело при больших разведениях сыворотки крови, как это необходимо при подготовке больных к АВО-несовместимым трансплантациям.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Предложен способ титрования групповых антител системы АВО, при котором определяют титры естественных антител, полных иммунных антител, неполных иммунных антител.

Для определения титра естественных антител используют 200-400 мкл сыворотки крови. Готовят ее разведения. Далее в каждую колонку нейтральной гелевой карты вносят 50 мкл 0,8% взвеси стандартных эритроцитов и 25 мкл одного из приготовленных разведений. Инкубируют полученные смеси, оставляя нейтральную гелевую карту или карты на 20-25 минут при температуре 21-23°C. После чего нейтральную гелевую карту или карты центрифугируют и определяют титр исследуемых антител по предельному разведению, при котором выявляется видимая агглютинация в толще колонки гелевой карты.

Для определения титра полных иммунных антител используют 100-200 мкл сыворотки крови. Разводят ее в четыре раза. Затем прогревают сыворотку в разведении 1:4 в течение 10 минут при температуре 70°C. Готовят последующие разведения прогретой сыворотки, разведенной 1:4. Далее в каждую колонку нейтральной гелевой карты вносят 50 мкл 0,8% взвеси стандартных эритроцитов и 25 мкл одного из приготовленных разведений. Инкубируют полученные смеси, оставляя нейтральную гелевую карту или карты на 20-25 минут при температуре 21-23°C. После чего нейтральную гелевую карту или карты центрифугируют и определяют титр исследуемых антител по предельному разведению, при котором выявляется видимая агглютинация в толще колонки гелевой карты.

Для определения титра неполных иммунных антител используют 100-200 мкл сыворотки крови, разводят ее в четыре раза. Затем прогревают разведенную сыворотку крови в течение 10 минут при температуре 70°C. Готовят последующие разведения прогретой сыворотки, разведенной 1:4. Далее в каждую колонку гелевой карты с реактивом Кумбса вносят 50 мкл 0,8% взвеси стандартных эритроцитов и 25 мкл одного из приготовленных разведений. Инкубируют полученные смеси, оставляя гелевую карту или карты с реактивом Кумбса на 20-25 минут при температуре 37°C. После чего гелевую карту или карты с реактивом Кумбса центрифугируют и определяют титр исследуемых антител по предельному разведению, при котором выявляется видимая агглютинация в толще колонки гелевой карты.

Способ осуществляется следующим образом.

Перед АВО-несовместимой трансплантацией для определения схемы предоперационной подготовки, а также в послеоперационном периоде для своевременного назначения адекватного лечения с учетом титров групповых антител системы АВО проводят определение этих титров.

Производят забор крови у пациента, методом центрифугирования отделяют сыворотку крови, в которой определяют титр естественных (нормальных) и иммунных (полных и неполных) антител системы АВО.

Для определения титра естественных и полных иммунных антител могут быть использованы, например, нейтральные гелевые карты Bio-Rad ID-Card “NaCl, Enzyme Test and Cold Agglutinins”, для определения неполных иммунных антител - карты LISS/Coombs Anti-IgG+C3d.

Для проведения исследования могут быть использованы следующие реагенты и оборудование:

- стандартные эритроциты группы A₁ (II) и В (III) ID-DiaCell АВ0 0,8% Bio-Rad или Grifols SerigrupDiana A₁/B,

- изотонический 0,9% раствор NaCl

- культуральный планшет для разведения сыворотки (вместо него можно использовать пробирки типа эппендорф, планшет для ИФА),

- термостат 37°C,

- центрифуга для гелевых карт ID-Centrifuge 12 SII для колоночных карт,

- термостат на 70°C,

- дозаторы с переменным объемом от 25 до 200 мкл.

Для определения α и β естественных антител класса Ig M сыворотку, полученную в результате центрифугирования крови пациента, последовательно разводят в планшете от 1:1 до 1:1024.

1. Начиная со второй лунки в каждую лунку планшета вносят 200 мкл изотонического раствора NaCl.

2. В первую и во вторую лунку вносят по 200 мкл неразведенной сыворотки.

Во второй лунке сыворотку перемешивают пипетированием с раствором NaCl, затем 200 мкл разведенной сыворотки переносят в третью лунку, где перемешивают и переносят в четвертую лунку и так далее до последней лунки, где получают разведение 1024.

3. Подписывают гелевую нейтральную карту - Ф.И.О. пациента, дата исследования, разведение сыворотки.

4. В каждую колонку гелевой карты вносят 50 мкл 0,8% взвеси стандартных эритроцитов A₁, если определяют титр α изоагглютининов, или 50 мкл 0,8% взвеси стандартных эритроцитов В, если определяют титр β изоагглютининов. При необходимости определения одновременно титра α и β антител количество колонок удваивается.

5. В первую колонку вносят 25 мкл неразведенной сыворотки, во вторую и последующие колонки вносят по 25 мкл сыворотки каждого разведения.

6. Карты оставляют на 20-25 минут при комнатной температуре для реакции агглютинации.

7. Затем карты центрифугируют при стандартном режиме в центрифуге для карт 10 минут и оценивают результаты.

Титром считается последнее разведение, при котором в толще колонки гелевой карты будут наблюдаться сагглютинированные эритроциты (следующая колонка, в которой все эритроциты осели на дно, уже считается отрицательной).

Определение иммунных антител системы АВО (анти-А и анти-В) проводят следующим образом.

Исследуемую сыворотку в пробирке эппендорф разводят в четыре раза изотоническим 0,9% раствором NaCl (например, 100 мкл сыворотки+300 мкл NaCl), затем прогревают в течение 10 минут при 70°C. Таким образом получают прогретую сыворотку с разведением 1:4.

Далее, для определения полных иммунных антител титруют прогретую сыворотку по методике определения титра естественных групповых антител, описанной нами выше, с применением нейтральных гелевых карт. Сыворотку, полученную в результате центрифугирования крови пациента, разведенную 1/4, прогретую, последовательно разводят в планшете от 1:4 до 1:1024.

1. Начиная со второй лунки в каждую лунку планшета вносят 200 мкл изотонического раствора NaCl.

2. В первую и во вторую лунку вносят по 200 мкл прогретой разведенной 1:4 сыворотки.

Во второй лунке сыворотку перемешивают пипетированием с раствором NaCl, затем 200 мкл разведенной сыворотки переносят в третью лунку, где перемешивают и переносят в четвертую лунку и так далее до последней лунки, где получают разведение 1:1024.

3. Подписывают гелевую нейтральную карту - Ф.И.О. пациента, дата исследования, разведение сыворотки.

4. В каждую колонку гелевой карты вносят 50 мкл 0,8% взвеси стандартных эритроцитов A₁, если определяют титр - Анти-А, и 50 мкл 0,8% взвеси стандартных эритроцитов В, если определяют титр Анти-В. При необходимости определения одновременно титра анти-А и анти-В антител количество колонок удваивается.

5. В первую колонку вносят 25 мкл разведенной 1:4 сыворотки, во вторую и последующие колонки вносят по 25 мкл сыворотки каждого разведения.

6. Карты оставляют на 20-25 минут при комнатной температуре для реакции агглютинации.

7. Затем карты центрифугируют при стандартном режиме в центрифуге для карт 10 минут и оценивают результаты.

Титром считается последнее разведение, при котором в толще колонки гелевой карты будут наблюдаться сагглютинированные эритроциты (следующая колонка, в которой все эритроциты осели на дно, уже считается отрицательной).

Для выявления неполных иммунных IgG антител (анти-А и анти-В), выполняют следующие операции.

Сыворотку, полученную в результате центрифугирования крови пациента, разведенную 1/4, прогретую, последовательно разводят в планшете от 1:4 до 1:1024.

1. Определение неполных иммунных антител начинают последующим разведением прогретой сыворотки изотоническим раствором NaCl в культуральном планшете, как для естественных изоагглютининов. Начиная со второй лунки, в каждую лунку вносят 200 мкл изотонического раствора NaCl.

2. В первую и во вторую лунку вносят по 200 мкл прогретой сыворотки с разведением 1/4. Во второй лунке сыворотку перемешивают с раствором NaCl, используя пипетку, затем 200 мкл разведенной сыворотки переносят в третью лунку, где перемешивают, и 200 мкл переносят в четвертую лунку и так далее до последней лунки, где получается разведение 1/4096. Если сыворотка титруется второй раз и известен ее последний титр, то достаточно внести в карточку последнее известное разведение+2 разведения.

3. Подписывают гелевые карты LISS/Coombs Anti-IgG+C3d (Ф.И.О. пациента, дата исследования, разведение сыворотки).

4. Затем в каждую колонку гелевой карты Liss/Coombs вносят 50 мкл 0,8% взвеси стандартных эритроцитов A₁, если определяем титр анти-А, и эритроцитов В, если определяем титр анти-В. При необходимости определения одновременно титра Анти-А и Анти-В антител количество колонок удваивается.

5. В первую колонку вносят 25 мкл сыворотки с разведения 1/4, во вторую и последующие колонки вносят по 25 мкл последовательно разведенных сывороток в соответствующие колонки.

6. Карты оставляют на 20-25 минут при 37°C для реакции агглютинации.

7. Затем карты откручивают в центрифуге при стандартном режиме для карт 10 минут.

Оценивают результаты: титром антител считается последнее разведение, при котором в толще колонки гелевой карты будут наблюдаться сагглютинированные эритроциты (следующая колонка, в которой все эритроциты осели на дно, уже считается отрицательной.).

В результате исследования выявляются естественные антитела - агглютинины α и β (термолабильные) и иммунные полные и неполные анти-А и анти-В антитела (термостабильные).

Высокий титр естественных агглютининов (α выше чем 1:256 и β выше чем 1:128) при отсутствии иммунных антител в момент исследования отражает состояние повышенной сенсибилизации организма, что позволяет сделать предположение о бывшем в прошлом поступления антигена, несовместимого по АВО системе.

Выявление иммунных антител свидетельствует об имевшем место поступлении в организм человека антигена, несовместимого по АВО системе.

Отсутствие иммунных термостабильных антител при титре естественных изоагглютининов α не выше чем 1:256 и β не выше чем 1:128 говорит об отсутствии у человека изоиммунизации групповыми факторами системы АВО.

Для доказательства возможности осуществления заявленного изобретения с достижением указанного назначения и технического результата приводим следующие данные.

Нами проведено титрование изоагглютининов по предложенному способу при 38 разногруппных трансплантациях. Для одного пациента, в среднем, проводилось от 2 до 5 титрований до операции и от 5 до 30 титрований после операции (АВО-несовместимой трансплантации). Всего было выполнено 680 титрований. Во всех исследованиях получены результаты, в зависимости от которых проводилась предоперационная подготовка пациентов и их ведение в послеоперационном периоде.

110 титрований были поставлены в параллели с общепринятым солевым методом на плоскости. В 90% случаев разница с солевым методом (способ-прототип) составляла от 1 до 3 разведений. Причем агглютинация была выявлена при проведении заявляемого способа при большем разведении сыворотки.

Клинический пример.

Пациент М., 03.10.2011 г. рождения. Диагноз: цирроз печени в исходе болезни Caroli. Группа крови 0(I) Rh-фактор положительный.

18.06.2012 г. пациенту была проведена операция трансплантации части печени от донора-родственника - группа крови А(II), Rh-фактор положительный.

При исследовании сыворотки крови пациента до операции методом серийных разведений в солевой среде на плоскости определился титр естественных α-антител 1/16, титр иммунных полных антител 0, неполных антител 1/16. При таких исходных показателях предоперационная подготовка с целью снижения титра антител не требуется.

Одновременно проводилось титрование тех же проб сывороток по предложенному способу, титры антител соответственно были равны 1/64; 0; 1/64, что потребовало предоперационной подготовки в виде введения мабтеры, проведения пяти процедур плазмафереза с 8.06.2012 по 17.06.2012 с целью уменьшения титра естественных и неполных иммунных антител в крови пациента. В результате, ко дню операции, титр естественных α-антител снизился до 1/1 в геле и до 0 - в солевом методе, титр иммунных неполных анти-А в геле снизился до 1/4. В послеоперационном периоде естественные и полные иммунные групповые антитела не определялись в обоих методах титрования, титр неполных антител в солевом методе не определялся, в предлагаемом методе - постепенно снижался с 1:4 до 0. На фоне проводимой терапии в настоящее время антитела у пациента не определяются.

Таким образом, разница в результатах двух методов была в 1-3 разведения, более чувствительным был предлагаемый способ титрования.

Клинический пример

Пациент Л., 19 лет. Диагноз: Врожденная аномалия развития мочевыделительной системы. Аплазия правой почки. Состояние после пластики гидронефроза слева. ХПН, терминальная стадия. Нефрогенная анемия. Группа крови 0(I), Rh-фактор положительный.

01.03.2012 г. пациенту была проведена операция родственной аллотрансплантации почки справа от донора- родственника - группа крови А(II), Rh-фактор положительный.

При исследовании сыворотки крови пациента до операции методом серийных разведений в солевой среде на плоскости определился титр естественных α-антител 1/32, титр иммунных полных антител 1/8, неполных антител 1/4.

Одновременно проводилось титрование тех же проб сывороток по предложенному способу, титры антител соответственно были равны 1/128; 1/16; 1/16, что потребовало предоперационной подготовки в виде введения мабтеры 15.02.2012 г. и проведения четырех процедур анти-А иммуносорбции с 22.02.2012 по 29.02.2012 г. с целью уменьшения титра естественных, полных и неполных иммунных антител в крови пациента. В результате, ко дню операции, титр естественных α-антител снизился до 1/8 в геле и до 0 - в солевом методе, титр иммунных полных анти-А снизился до 1/8 (в солевом методе 1:4) и титр полных антител до 1/16 в геле (в солевом 1:4).В послеоперационном периоде титр естественных антител в геле был 1:4 (в солевом методе антитела не определялись), полные иммунные групповые антитела не определялись в обоих методах титрования, титр неполных антител в солевом методе не определялся, в предлагаемом методе - 1/8 постепенно снижался до 1/4. На фоне проводимой терапии в настоящее время антитела у пациента не определяются.

Таким образом, разница в результатах двух методов была в 1-3 разведения, более чувствительным был предлагаемый способ титрования