Результат интеллектуальной деятельности: НАБОР ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ГЕРМИНАЛЬНЫХ МУТАЦИЙ В ГЕНЕ RET, АССОЦИИРОВАННЫХ С НАСЛЕДСТВЕННОЙ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТЬЮ К РАКУ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Изобретение относится к медицине, а именно молекулярной биологии и онкологии.

Известна нуклеотидная последовательность для детекции мутаций 11 экзона гена RET (Патент США №6171791 В1).

Недостатки: небольшая протяженность исследуемой ДНК (только 11 экзон с 1810 по 1845 позиции), отсутствие точного определения рисков развития рака щитовидной железы (РЩЖ), трудоемкость проведения и высокая стоимость исследований (секвенирование).

Известно изобретение, посвященное выявлению онкогенов RET/PTC при папиллярном РЩЖ (Патент Украины №29847 U).

Недостатки: трудоемкость процесса (выделение РНК применением метода обратной транскрипции и амплификации), изучение соматических мутаций, а не герминальных, что не позволяет оценивать риск развития заболевания, изучение только папиллярного рака.

Задачей заявляемого изобретения является создание оптимального набора последовательностей олигонуклеотидов для анализа герминальных мутаций в гене RET, ассоциированных с наследственной предрасположенностью к РЩЖ, исходя из частот мутаций среди пациентов в российской популяции.

Задача решается путем создания оптимального набора последовательностей олигонуклеотидов для детекции точковых герминальных мутаций С634 в 11 экзоне и М918Т в 19 экзоне гена RET с использованием мультиплексной «гнездовой» полимеразной цепной реакции (ПЦР) и аллель-специфичной гибиридизации с набором иммобилизованных дифференцирующих олигонуклеотидов.

Техническим результатом заявляемого изобретения является создание оптимального набора последовательностей олигонуклеотидов для диагностики герминальных мутаций в гене RET, ассоциированных с наследственной предрасположенностью к РЩЖ, исходя из частот мутаций среди пациентов в российской популяции.

Технический результат достигается подбором оптимального набора последовательностей олигонуклеотидов для мультиплексной «гнездовой» ПЦР и гибридизации, которые используются для диагностики герминальных мутаций в гене RET, ассоциированных с наследственной предрасположенностью к РЩЖ, у пациентов в российской популяции, имеющий следующий нуклеотидный состав:

5'-CATGGCCACTCCCAGTGC-3'

5'-CACAGGGACTCCTCAGCAC-3'

5'-CACCCCCACCCACAG-3'

5'-GAGATGGGTGGCTTGTG-3'

5'-GGCTAGTGCTGTCAGGCC-3'

5'-CTAAGCACCCTAGACGCG-3'

5'-CAGGGATAGGGCCTGG-3'

5'-CCCCAAGAGAGCAACACC-3'

TACGAGCCGTGCCT

GATGGGCTGCGCAG

CACGTGCTGGGCCT

TAGAAGCTGTACAT

CACGAGAAGTGGAG

TACGAGCTGAGCTG

GGAAATGGATGGGATTTG

CCATATGGACGGCAATTC

Подбор последовательностей олигонуклеотидов включает: синтез олигонуклеотидов SEQ ID NO:9-16, строго комплементарных целевой последовательности ДНК и соответствующих температурным условиям гибридизации; амплификацию фрагментов гена RET с использованием на I этапе мультиплексной «гнездовой» ПЦР, в которой матрицей служит образец ДНК, набор олигонуклеотидов с последовательностями, представленными в SEQ ID NO:1-8, с образованием на II этапе ПЦР биотип-меченого ПЦР-продукта; наличие набора иммобилизованных олигонуклеотидов с последовательностями, представленными в SEQ ID NO:9-16; гибридизацию меченого ПЦР-продукта с набором иммобилизованных олигонуклеотидов.

Для проведения молекулярно-генетического исследования биологическим материалом служила геномная ДНК, выделенная из лимфоцитов периферической крови.

Олигонуклеотиды для амплификации и олигонуклеотидные зонды синтезировали с использованием фосфодиэфирного и гидрофосфорильного методов. Синтез олигонуклеотидов осуществляли используя автоматический ДНК/РНК синтезатор.

Олигонуклеотиды для гибридизации аллелей гена RET, ассоциированного с наследственной предрасположенностью к РЩЖ, подбирали таким образом, чтобы идентифицировать все выбранные для анализа точковые мутации

Для определения точковых мутаций гена RET были подобраны и синтезированы 8 высокоспецифичных дифференцирующих олигонуклеотидных зондов, структура которых обеспечивала связывание только с полностью комплементарными ДНК-мишенями.

ПЦР проводили с использованием термостабильной Taq-полимеразы в соответствующем буфере на приборе Dyad. Смесь ПЦР I этапа объемом 25 мкл включала в себя: 1×ПЦР-буфер (Трис-HCl 67 мМ, рН 8,6, (NH₄)₂SO₄ 166 мМ, Тритон Х-100 0,01%), MgCl₂ 1,5 мМ, 0,2 мМ каждого из дНТФ, Taq-полимеразы 2,5 U, по 0,2 мкМ олигонуклеотидов.

Амплификация включала: денатурацию двухцепочечной ДНК при t=94°C в течение 3 мин 30 сек, далее - 35 циклов полимеразной цепной реакции: при t=94°C в течение 30 сек, при t=60°C в течение 20 сек, при t=72°C в течение 10 сек, затем элонгация при t=72°C в течение 3 мин. Смесь II этапа ПЦР содержала 0.2 мкМ прямого праймера, 2 мкМ обратного биотип-меченого праймера. В качестве матрицы в смесь добавляли 2 мкл продукта I этапа ПЦР и проводили амплификацию, включающую: денатурацию при t=94°C в течение 3 мин 30 сек, далее 35 циклов ПЦР: при t=94°C в течение 30 сек, при t=61°C в течение 20 сек, при t=72°C в течение 10 сек, элонгацию при t=72°C в течение 3 мин. Получали одноцепочечный ампликон, способный к гибридизации с аллель-специфичными ДНК-зондами. Амплификацию каждого образца ДНК проводили в отдельной пробирке. Олигонуклеотиды, используемые для иммобилизации, несут по 5'- или 3'-концу активную группу, обеспечивающую иммобилизацию.

Набор дифференцирующих олигонуклеотидов наносили на поверхность мембраны, содержащей активные группы.

В мультиплексной «гнездовой» реакции I этапа ПЦР использовали олигонуклеотиды SEQ ID NO:1, 2, 5, 6.

В мультиплексной «гнездовой» реакции II этапа ПЦР использовали олигонуклеотиды SEQ ID NO:3, 4, 7, 8.

В таблице 1 представлены последовательности олигонуклеотидов для мультиплексной «гнездовой» реакции I и II этапов ПЦР.

В таблице 2 представлены последовательности олигонуклеотидных зондов, используемых для гибридизации.

В таблице 3 представлены олигонуклеотиды SEQ ID NO для «гнездовой» ПЦР: 1-4 для ДНК-локуса С634 и 4-8 для ДНК-локуса М918Т.

В таблице 4 представлены последовательности иммобилизованных олигонуклеотидов: 9-16 для гибридизации.

Гибридизационная смесь общим объемом 500 мкл включала формамида 100 мкл, 20×SSPE (sodium chloride, sodium phosphate, EDTA) 100 мкл и амплификата 20 мкл. Готовую гибридизационную смесь денатурировали при t=95°C в течение 5. мин, охлаждали во льду 2 мин, далее мембрану с иммобилизованными олигонуклеотидами инкубировали в гибридизационной смеси в течение 10-12 ч. После завершения инкубации проводили отмывку от непрореагировавшей гибридизационной смеси в 1×SSPE буфере при комнатной температуре в течение 15 мин.

Затем проводили блокирование мест неспецифического связывания, для этого мембрану инкубировали в блокирующем буфере, в состав которого входил БСА (бычий сывороточный альбумин). Промывали мембрану SSC (saline-sodium citrate) буфером (NaCl 0,15М) два раза. После этого проводили инкубацию с разведенным в буфере конъюгатом (стрептавидин-щелочная фосфатаза). Не связавшийся коньюгат удаляли с мембраны SSC буфером. Мембрану инкубировали с буфером (Трис-HCl 0,1М рН 7.6, MgCl₂ 10 мМ, ZnCl₂ 10 мМ, Тритон Х-100 0.1%) в течение 2 мин. После этого инкубировали мембрану в красящем буфере, содержащим субстраты НСТ и БХИФ (5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат и нитросиний тетразолий). Для прекращения реакции промывали мембрану дистиллированной водой.

Фермент щелочная фосфатаза превращала бесцветный субстрат в конечный продукт реакции сине-сиреневого цвета. Реакцию окрашивания наблюдали в местах связывания зонда и комплементарной последовательности.

Наличие одного из мутантных аллелей (C634WT, C634R, C634G, C634Y, C634W, C634S, M918WT, М918Т) в исследуемом образце определяли с учетом расположения олигонуклеотидных зондов на мембране. Наличие мутаций в генотипе пациента подтверждает генетический диагноз наследственной предрасположенности к РЩЖ или определяет высокий риск его развития в течение жизни.

Изобретение иллюстрируется примерами 1,2:

Пример 1.

Пациент Р., 9 лет

Предварительный диагноз: подозрение на синдром множественных эндокринных неоплазий 2Б типа (МЭН 2Б).

Семейный анамнез: онкологическими заболеваниями не отягощен.

Исследование: определение мутаций в прото-онкогене RET, ассоциированного с развитием синдрома множественных эндокринных неоплазий 2Б (МЭН 2Б).

Материал исследования: ДНК, выделенная из лимфоцитов периферической крови.

Результат: выявлена герминальная миссенс-мутация р.М918Т (с.2753Т>С) в гетерозиготном состоянии в 918 ко доне 16 экзоне протоонкогена RET, ассоциированная с синдромом МЭН2Б. Диагностированная мутация зарегистрирована в международной базе данных MEN2 Database ARUP [arup.utah.edu].

Заключительный диагноз: синдром множественных эндокринных неоплазий тип 2Б (с-м МЭН 2Б). Высокий риск билатеральной феохромоцитомы, множественных неврином желудочно-кишечного тракта.

Учитывая результаты молекулярно-генетического исследования, пациент относится к наивысшей группе риска (уровень D) развития прогностически неблагоприятных (агрессивных) форм медуллярного РЩЖ, с 50%-ным риском развития феохромоцитомы надпочечников.

Тип наследования - аутосомно-доминантный.

Рекомендовано:

1. учитывая полную пенетрантность прото-онкогена RET, пациенту целесообразно проведение хирургического лечения в объеме тотальной тиреоидэктомии с лимфодисекцией;

2. динамическое наблюдение:

- наблюдение онкологом, эндокринологом, генетиком;

- контроль уровня кальцитонина базального и стимулированного в динамике+УЗИ области шеи;

- контроль общего и ионизированного кальция в динамике;

- контроль метанефрина плазмы крови и суточной мочи+УЗИ забрюшинного пространства для своевременной диагностики феохромоцитомы в динамике;

3. ДНК-диагностика на наличие мутации в гене RET родственников 1-11 степени родства.

Пример 2.

Пациентка П., 13 лет

Диагноз: подозрение на синдром множественных эндокринных неоплазий 2А типа (МЭН 2А).

Семейный анамнез: отягощен медуллярным РЩЖ.

Исследование: определение мутаций в прото-онкогене RET.

Материал исследования: ДНК, выделенная из лимфоцитов периферической крови.

Результат: выявлена герминальная миссенс-мутация p.C634Y в гетерозиготном состоянии в 634 кодоне протоонкогена RET. Диагностированная мутация зарегистрирована в международной базе данных MEN2 Database ARUP [amp.utah.edu] как клинически значимый вариант.

Заключение: наследственный RET-ассоциированный медуллярный РЩЖ в составе синдрома МЭН2А.

Учитывая результаты молекулярно-генетического исследования, пациент относится к группе высокого риска (уровень D) развития прогностически неблагоприятных (агрессивных) форм медуллярного РЩЖ с 50%-ным риском развития феохромоцитомы надпочечников.

Рекомендуется:

1. учитывая полную пенетрантность прото-онкогена RET, пациенту целесообразно проведение хирургического лечения в объеме тотальной тиреоидэктомии с лимфодисекцией;

2. динамическое наблюдение:

- определение уровня базального и пентагастрин-стимулированного кальцитонина;

- контроль метанефрина плазмы крови и суточной мочи+УЗИ забрюшинного пространства для своевременной диагностики феохромоцитомы в динамике;

3. ДНК-диагностика на наличие мутации в гене RET родственников I-II степени родства.