Результат интеллектуальной деятельности: ЛЕКАРСТВЕННЫЙ ПРЕПАРАТ И СПОСОБ УЛУЧШЕНИЯ РЕОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МОКРОТЫ И ИНГАЛЯЦИОННОЕ ПРИМЕНЕНИЕ ТАКОГО ПРЕПАРАТА

Изобретение относится к медицине и конкретно к препаратам, улучшающим реологические свойства мокроты при лечении муковисцидоза и препятствующим развитию бактериальных биопленок в воздухоносных путях больных.

Муковисцидоз представляет собой системное наследственное заболевание, обусловленное мутацией гена трансмембранного регулятора муковисцидоза и характеризующееся поражением желез внутренней секреции, тяжелыми нарушениями функций органов дыхания и желудочно-кишечного тракта. Муковисцидоз - самое частое наследственное заболевание, приводящее к смерти. В настоящее время муковисцидозом в Российской Федерации страдает приблизительно 8000 человек, большинство из которых в возрасте до 30 лет.

Накопление вязкого гнойного секрета (мокроты) в дыхательных путях больных муковисцидозом играет роль в уменьшении функциональной способности легких и в обострениях инфекционного процесса. Мокрота больных муковисцидозом имеет ряд характерных особенностей. Вязкость бронхиального секрета обусловлена содержанием двух макромолекул: мукоидных гликопротеидов и ДНК. Главным источником ДНК являются распадающиеся полиморфно-ядерные нейтрофилы, которые скапливаются в дыхательных путях в ответ на хроническую бактериальную инфекцию, а также биопленки микробных агентов, в особенности Р. Aeruginosa. Характерной особенностью хронического воспалительного процесса в легких больных муковисцидозом является стойкая инфильтрация легочной ткани с массивной нейтрофилией в воздухоносных путях.. Дериваты гибнущих нейтрофилов - эластаза, катепсин G, протеаза, коллагеназа, желатиназа, фактор активации плазминогена, свободные радикалы, миелопероксидаза, оксидазы, цитокины, эндотоксин - способствуют развитию «респираторного взрыва» и могут непосредственно оказывать влияние и инактивировать ферментные препараты, реализующие свой фармакологический эффект в подобном агрессивном микроокружении. (Е. Гембицкая, 2008)

Для улучшения функции дыхания у больных муковисцидозом в возрасте старше 5 лет используется лекарственный препарат Пульмозим.

Пульмозим (Дорназа альфа) представляет собой фосфорилированную гликозилированную рекомбинантную дезоксирибонуклеазу I, идентичную выделенной из мочи дезоксрибонуклеазе человека, и состоит из 260 аминокислот, имея молекулярную массу 37 KDa. и производится путем ферментации рекомбинантного штамма клеток яичника китайского хомячка. Лечебная эффективность препарата основывается на его способности гидролизовать высокомолекулярную ДНК мукоальвеолярного секрета больных, улучшая тем самым реологические свойства секрета.

Основным недостатком пульмозима является его ограниченная эффективность, являющаяся следствием следующих причин:

Быстрое снижение концентрации в мокроте, являющееся следствием системной абсорбции - при ингаляции 2.5 мг пульмозима средняя концентрация препарата в мокроте снижается с 3 мкг\мл до 0.6 мкг\мл в течение 2 часов после ингаляции. (Пульмозим; Инструкция по медицинскому применению)

Подавление ферментативной активности пульмозима продуктами деградации клеточного цитоскелета (актин), содержащиеся в больших количествах в мукоальвеолярном секрете больных муковисцидозом. G-форма актина связывается с дорназой альфа в основном в области Tyr65-Val66-Val 67 и подавляет гидролитическую активность фермента (Fujihara, 2006). При этом характерный для пульмозима профиль N-гликозилирования не предотвращает инактивации фермента актином и протеолиз, опосредованный бактериальными и лейкоцитарными пептидазами.

Задачей изобретения является создание лекарственного препарата для гидролиза высокомолекулярной внеклеточной ДНК мокроты у больных муковисцидозом, обладающего способностью длительное время поддерживать высокий уровень ДНК-гидролитической активности в бронхиальной слизи и обладающего пониженной чувствительностью к действию естественных ингибиторов и протеаз, содержащихся в мокроте.

Эта задача решается тем, что в качестве лекарственного препарата для гидролиза высокомолекулярной внеклеточной ДНК мокроты у больных муковисцидозом используется синтетический гликопротеин, представляющий собой рекомбинантную дезоксирибонуклеазу-1 человека, получаемую в микроорганизме E.coli и ковалентно связанную своим N-концом с полисахаридом, содержащим 80 звеньев альфа-2,8 сиаловой кислоты в полисахаридной цепи. Таким образом, согласно настоящему изобретению предлагается лекарственный препарат для улучшения реологических свойств мокроты и подавления образования бактериальных биопленок в бронхах, у больного муковисцидозом, содержащий в качестве активного вещества эффективное количество рекомбинантной дезоксирибонуклеазы-1 человека, ковалентно связанной с гомополимерным полисахаридом, содержащим 80 звеньев альфа-2,8 сиаловой кислоты.

Далее согласно изобретению, предлагается способ улучшения реологических свойств мокроты и подавления образования бактериальных биопленок в бронхах у больного муковисцидозом, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества лекарственного препарата, содержащего в качестве активного вещества рекомбинантную дезоксирибонуклеазу-1 человека, ковалентно связанную с гомополимерным полисахаридом, содержащим 80 звеньев альфа-2,8 сиаловой кислоты.

Далее, согласно изобретению предлагается ингаляционное применение лекарственного препарата, содержащего в качестве активного вещества рекомбинантную дезоксирибонуклеазу-1 человека, ковалентно связанную с гомополимерным полисахаридом, содержащим 80 звеньев альфа-2,8 сиаловой кислоты для улучшения реологических свойств мокроты и подавления образования бактериальных биопленок в бронхах при лечении муковисцидоза.

Полисиаловые кислоты (PSA) представляют собой природные неразветвленные полимеры сиаловой кислоты, вырабатываемые определенными штаммами бактерий и в определенных клетках у млекопитающих (Roth., 1993). Их можно получать с различной степенью полимеризации, от n = примерно 80 или более остатков сиаловой кислоты до n=2 путем кислотного гидролиза или расщеплением нейраминидазами, или фракционированием природных вырабатываемых бактериями видов полимера. Состав различных полисиаловых кислот также изменяется таким образом, что существуют гомополимерные формы, т.е. альфа-2,8 - связанная полисиаловая кислота, включающая капсульный полисахарид штамма К1 E.coli и В-группы менингококков, который также обнаруживают в эмбриональной форме молекулы клеточной адгезии нейрона (N-САМ). Также существуют гетерополимерные формы, такие как чередующаяся альфа-2,8 альфа-2,9 полисиаловая кислота штамма К92 E.coli и полисахариды С группы N. meningitidis. Сиаловую кислоту также можно обнаружить в чередующихся сополимерах с мономерами, отличающимися от сиаловой кислоты, таких как группа W135 или группа Y N. meningitidis.

Полисиаловые кислоты обладают важным биологическим действием, включая уклонения патогенных бактерий от иммунной системы и системы комплемента. Альфа-2,8 - связанная полисиаловая кислота штамма К1 E.coli также известна как «коломиновая кислота» и ее (различной длины) используют в настоящем изобретении.

Среди бактериальных полисахаридов альфа-2,8 связанная форма полисиаловой кислоты представляет собой единственную неиммуногенную (не вызывающую ни ответа Т-клеток, ни образования антител у млекопитающих, даже при конъюгации с иммуногенными носителями белками). Более короткие формы полимера (до n=4) обнаруживают в ганглиозидах клеточной поверхности, которые широко распространены в организме и считаются эффективными для сообщения и поддержания иммунологической толерантности по отношению к полисиаловой кислоте.

В последние годы биологические свойства полисиаловых кислот, в особенности биологические свойства альфа-2,8 связанной гомополимерной полисиаловой кислоты, были использованы для модификации фармакокинетических свойств белковых или низкомолекулярных молекул лекарственных веществ [Gregoriadis, 2001; Jain et al., 2003; US-A-5846951, WO-A-0187922].

Альфа-2,8 - связанная полисиаловая кислота (PSA) предлагает привлекательную альтернативу для модификации белков, представляя собой иммунологически невидимый биологически разрушаемый полимер, являющийся естественной частью человеческого организма, и который разрушается тканевыми нейраминидазами до сиаловой кислоты, нетоксичного сахарида

Выбор основан на результатах исследования, проведенных авторами настоящего изобретения, обнаружившими способность рекомбинантной дезоксирибонуклеазы-1 человека ковалентно связанной с гомополимерным полисахаридом, содержащим 80 звеньев альфа-2,8 сиаловой кислоты в полисахаридной цепи существенно увеличивать продолжительность специфического фармакологического действия рекомбинантной дезоксирибонуклеазы-1 человека в мокроте больных муковисцидозом. В процессе работы над изобретением авторы неожиданно обнаружили, что предложенный синтетический гликопротеин обладает способностью подавлять рост бактериальных биопленок в мокроте больных муковисцидозом.

Сущность изобретения поясняется двумя примерами получения заявляемого лекарственного препарата таблицей с результатами сравнительных испытаний, и рисунками, где дано:

В таблице 1 представлено влияние заявляемого лекарственного препарата на текучесть мокроты больных муковисцидозом в сравнении с пульмозимом.

Пульмозим и заявляемое лекарственный препарат добавлялись к образцам мокроты до концентрации 10 мкг/мл по белку (ВСА метод). Через 15 минут после введения испытуемых препаратов каждый образец мокроты разбавлялся равным объемом свежей мокроты того же больного.

Текучесть мокроты определяли по шкале Keal:

На рисунке 1 представлено влияние заявляемого лекарственного препарата и пульмозима на степень полимеризации ДНК, выделенной из мокроты больных муковисцидозом.

Электрофорез пулированого образца ДНК мокроты через 30 минут после разбавления тест-аликвот равным объемом свежей мокроты (10 и 50 мкг/мл). Размер ДНК указан в стандартах баз.

Слева направо:

полоса 1 - Пульмозим 50 мкг/мл

полоса 2 - Пульмозим 10 мкг/мл

полоса 3 - Заявляемое лекарственный препарат 50 мкг/мл

полоса 4 - Заявляемое лекарственный препарат 10 мкг\мл

На рисунке 2 приведены результаты вестерн-блот анализа ковалентного конъюгата человеческой рекомбинантной дезоксирибонуклеазы-1 с гомополимером альфа-2,8 сиаловой кислоты массой 22 кДа.

Анализ конъюгатов рекомбинантной человеческой дезоксирибонуклеазы-1 и гомополимерного полисахарида альфа-2,8 сиаловой кислоты методом иммуноблоттинга

На рисунке 3 приведены микрофотографии бактериальных биопленок развивающихся в мокроте больных в присутствии пульмозима и заявляемого синтетического гликопротеина.

Эффект рекомбинантной дезоксирибонуклеазы-1 человека, ковалентно связанной с гомополимерным полисахаридом, содержащим 80 звеньев альфа-2,8 сиаловой кислоты в концентрации 5.0 мкг\мл (А) и пульмозима (Б) в концентрации 5,0 мкг/мл на рост бактериальных биопленок в мокроте больного муковисцидозом через 24 часа после добавления препаратов.

Заявляемый лекарственный препарат получают, например, следующим образом.

Пример 1. Получение рекомбинантной дезоксирибонуклеазы-1 человека, ковалентно связанной с гомополимерным полисахаридом, содержащим 80 звеньев альфа-2,8 сиаловой кислоты

Синтетический ген, кодирующий дезоксирибонуклеазу человека и экспрессионный штамм были сконструированы по методике описанной Worrall (Worrall AF, Connolly BA. The chemical synthesis of a gene coding for bovine pancreatic DNase I and its cloning and expression in Escherichia coli. J Biol Chem. 1990 Dec 15; 265(35):21889-95). Рефолдинг и очистка белка проводились по методике описанной Linardou (Linardou H, Epenetos AA, Deonarain MP. A recombinant cytotoxic chimera based on mammalian deoxyribonuclease-I. Int J Cancer. 2000 May 15; 86(4):561-9.). Был получен негликозилированный белок с молекулярной массой 29 KDa и аминокислотной последовательностью, полностью соответствующей аминокислотной последовательности дезоксирибонуклеазы I из мочи человека, но не имеющий N-связанной олигосахаридной группы. Удельная активность полученного белка, измеренная методом Куница, соответствовала опубликованной удельной активности N-гликозилированной рекомбинантной дезоксирибонуклеазы 1 человека

Полученную человеческую рекомбинантную дезоксирибонуклеазу-1 растворяли в 0,15 М фосфатном буферном растворе (ФБР) (pH 7,4) и ковалентно связывали с окисленной полисиаловой кислотой. Использовали полисиаловую кислоту с молекулярной массой 22 кДа, добавляя ее к человеческой рекомбинантной дезоксирибонуклеазе-1 (2 мг) в молярных соотношениях полисиаловая кислота: дезоксирибонуклеаза-1 (12,5:1). Цианоборгидрид натрия добавляли до конечной концентрации 4 мг/мл. Реакционные смеси герметично закрывали и перемешивали при помощи магнитной мешалки в течение 24 часов при 35±2°С. Смеси затем осаждали сульфатом аммония ((NH₄)₂SO₄) путем медленного добавления соли при непрерывном перемешивании для достижения 70% мас./об. насыщения, перемешивали 1 час при 4°C, затем центрифугировали (5000·g) в течение 15 минут, и гранулы повторно суспендировали в насыщенном растворе (NH₄)₂SO₄ и вновь центрифугировали в течение 15 минут (5000·g). Выделенные осадки повторно растворяли в 1 мл PBS pH 7,4 и подвергали активному диализу (24 часа) при 4°C против того же буфера. Контроли включали конъюгацию нативного белка в присутствии неокисленной полисиаловой кислоты или в отсутствие полисиаловой кислоты. Встряхивание было сведено к минимуму, чтобы избежать сопутствующей денатурации белка. Конъюгат выделяли последовательно ионообменной и обращено-фазовой хроматографией. Очищенный ковалентный конъюгат человеческой рекомбинантной дезоксирибонуклеазы-1 с гомополимером альфа-2,8 сиаловой кислоты содержащим 80 звеньев сиаловой кислоты анализировали с помощью гель-электрофореза в присутствии додецилсульфатом натрия и вестерн-блот анализа. Результаты приведены на рисунке 2.

Пример 2. Получение рекомбинантной дезоксирибонуклеазы-1 человека, ковалентно связанной с гомополимерным полисахаридом, содержащим 80 звеньев альфа-2,8 сиаловой кислоты.

На первой стадии тиольные группы вводили в последовательность человеческой рекомбинантной дезоксирибонуклеазы-1 тиолированием амина лизина. Полученную, как описано ранее в примере 1, человеческую рекомбинантную дезоксирибонуклеазу-1,4 мг, растворяли в 0,25 мл PBS+10 мМ ЭДТА и добавляли 0,498 мг 2-иминотиолана (2-IT или реактива Траута 50 моль-эквивалентов 3,6×10^-6 моль) в 0,25 мл того же буфера. Пробирку закрывали фольгой и оставляли для инкубации при перемешивании гибкой мешалкой в течение 1 ч при 37°C. Тиолированную человеческую рекомбинантную дезоксирибонуклеазу-1 очищали от свободного 2-IT (реактив Траута) гель-фильтрацией (PD-10) и 0,5 мл фракции анализировали на присутствие белка (ВСА анализ) или тиола (анализ Элмана). Окисленную полисиаловую кислоту с молекулярной массой 22 кДа вводили в реакцию с 5 молярными эквивалентами гидразида N-[в-малеимидпропионовой кислоты] в 0,1 М ацетате натрия в течение 2 часов при 37°C. Полученный гидразон (САМ) осаждали в этаноле, повторно суспендировали в ацетате натрия и повторно осаждали в этаноле, повторно растворяли в воде и подвергали сухой заморозке. К тиолированной человеческой рекомбинантной дезоксирибонуклеазе-1 (3,6 мг) в 2 мл PBS/ЭДТА добавляли 22,5 мг САМ (9×10^-7 моль, 15 моль-эквивалентов). Пробирку запечатывали и оставляли для инкубации при 37°C в течение 1 ч при мягком перемешивании. Полученный конъюгат затем выделяли последовательно ионообменной и обращено-фазовой хроматографией. Очищенный ковалентный конъюгат человеческой рекомбинантной дезоксирибонуклеазы-1 с гомополимером альфа-2,8 сиаловой кислоты содержащим 80 звеньев сиаловой кислоты анализировали с помощью гель-электрофореза в присутствии додецилсульфатом натрия и вестерн-блот анализа.

В таблице 1 представлено влияние применения по заявляемому способу лекарственного препарата - ковалентного конъюгата человеческой рекомбинантной дезоксирибонуклеазы-1 с гомополимером альфа-2,8 сиаловой кислоты массой 22 кДа, содержащим 80 звеньев сиаловой кислоты на текучесть мокроты больных муковисцидозом в сравнении с пульмозимом в фармакодинамическом тесте ExVivo. Из таблицы 1 видно, что заявляемый лекарственный препарат превосходит пульмозим в способности улучшать реологические свойства индивидуальных образцов мокроты больных во всех исследованных образцах.

На рисунке 1 представлено влияние применения по заявляемому способу лекарственного препарата - ковалентного конъюгата человеческой рекомбинантной дезоксирибонуклеазы-1 с гомополимером альфа-2,8 сиаловой кислоты массой 22 кДа, содержащим 80 звеньев сиаловой кислоты на степень полимеризации ДНК, выделенной из мокроты больных муковисцидозом после обработки заявляемым препаратом и пульмозимом. Из рисунке 1 видно, что заявляемый лекарственный препарат превосходит пульмозим по способности усиливать дефрагментацию высокомолекулярной внеклеточной ДНК мокроты больных муковисцидозом.

На рисунке 2 приведены результаты вестерн-блот анализа ковалентного конъюгата человеческой рекомбинантной дезоксирибонуклеазы-1 с гомополимером альфа-2,8 сиаловой кислоты массой 22 кДа, содержащим 80 звеньев сиаловой кислоты, свидетельствующие об образовании истинного конъюгата.

На рисунке 3 представлено влияние применения по заявляемому способу лекарственного препарата - ковалентного конъюгата человеческой рекомбинантной дезоксирибонуклеазы-1 с гомополимером альфа-2,8 сиаловой кислоты массой 22 кДа, содержащим 80 звеньев сиаловой кислоты на рост бактериальных биопленок в мокроте больного муковисцидозом в сравнении с пульмозимом. Из рисунке 3 видно, что заявляемый лекарственный препарат превосходит пульмозим по способности подавлять рост бактериальных биопленок в мокроте больного муковисцидозом.

Пример 3. Заявляемый лекарственный препарат - рекомбинантную дезоксирибонуклеазу-1 человека, ковалентно связанную с гомополимерным полисахаридом, содержащим 80 звеньев альфа-2,8 сиаловой кислоты приготавливали, как это описано в Примере 2.

Дополнительно приготавливали препарат сравнения - рекомбинантную дезоксирибонуклеазу-1 человека, ковалентно связанную с гомополимерным полисахаридом, содержащим 40 звеньев альфа-2,8 сиаловой кислоты, так же как это описано а примере 2, за исключением того, что использовали для создания конъюгата окисленную полисиаловую кислоту с молекулярной массой 11 кДа, а не 22 кДа, и содержащую, соответственно, не 80, а 40 звеньев сиаловой кислоты.

Пульмозим, заявляемый лекарственный препарат (рекомбинантную дезоксирибонуклеазу-1 человека, ковалентно связанную с гомополимерным полисахаридом, содержащим 80 звеньев альфа-2,8 сиаловой кислоты), а также препарат сравнения (рекомбинантную дезоксирибонуклеазу-1 человека, ковалентно связанную с гомополимерным полисахаридом, содержащим 40 звеньев альфа-2,8 сиаловой кислоты) добавляли к образцам мокроты больных муковисцидозом до концентрации 10 мкг/мл по белку (ВСА метод). Через 15 минут после введения в среду испытуемых препаратов каждый образец мокроты разбавляли равным объемом свежей мокроты того же больного.

Текучесть мокроты определяли сразу, затем через 15 и 45 минут по шкале Keal:

Результаты исследования представлены в таблице 2.

Из таблицы 2 видно, что дезоксирибонкулеаза, конъюгированная с более коротким полисахаридом, содержащим только 40 звеньев альфа-2,8 сиаловой кислоты, обладает значительно меньшей способностью увеличивать текучесть мокроты больных муковисцидозом, а у отдельных пациентов она не оказывала заметного влияния на текучесть мокроты, что говорило о том, что такая конъюгация привела к значительной потере ферментативной активности фермента без увеличения продолжительности его действия.

Пример 4. Улучшение реологических свойств мокроты и подавления образование бактериальных биопленок в бронхах при муковисцидозе при ингалационном применении заявляемого лекарственного препарата.

Пациент, 14 лет, Диагноз: Муковисцидоз, средняя тяжесть, смешанная форма. В посеве мокроты отмечается рост синегнойной палочки в ассоциации со стафилококком, альфа - гемолитическим стрептококком, грибами рода Candida.

По 2,5 мл раствора (в концентрации 1 мг/мл) ковалентного конъюгата человеческой рекомбинантной дезоксирибонуклеазы-1 с гомополимером альфа-2,8 сиаловой кислоты содержащим 80 звеньев сиаловой кислоты, полученного так, как это описано в Примере 1 в физиологическом растворе (0,9% раствор натрия хлорида) ингалировали в течении 30 дней один раз в день, в дозе 2,5 мг через небулайзер, в одно и тоже время, в первую половину дня.

Кашель стал влажный (разжижение мокроты) на 4-ый день, в то время как, в предыдущие госпитализации (лечение без применения заявляемого лекарственного препарата) влажный кашель появлялся в среднем только на 10-12-ые дни. Также на 5 день началось отделение гнойной мокроты. В предыдущие госпитализации (лечение без применения заявляемого лекарственного препарата) отделение гнойной мокроты начиналось не раньше 11-12 дня. В посевах мокроты исчез стафилококк и грибы рода Кандида, количество синегнойной палочки уменьшилось.

Таким образом, заявляемый лекарственный препарат эффективно улучшает реологические свойства мокроты и подавляет образования бактериальных биопленок в бронхах при муковисцидозе при ингалационном применении.

Таким образом, приведенные выше материалы позволяют утверждать, что заявляемое применение рекомбинантной дезоксирибонуклеазы-1 человека, ковалентно связанной с гомополимерным полисахаридом, содержащим 80 звеньев альфа-2,8 сиаловой кислоты для улучшения реологических свойств мокроты и подавления образования бактериальных биопленок в бронхах при лечения муковисцидоза является новым. Из опубликованных источников информации заявителям не известно применение рекомбинантной дезоксирибонуклеазы-1 человека, ковалентно связанной с гомополимерным полисахаридом, содержащим 80 звеньев альфа-2,8 сиаловой кислоты для лечения муковисцидоза

Заявляемый лекарственный препарат промышленно применим, что подтверждено примерами его изготовления и применения.

Заявляемое применение является неочевидным. Биологическая активность рекомбинантной дезоксирибонуклеазы-1 человека, ковалентно связанной с гомополимерным полисахаридом, содержащим 80 звеньев альфа-2,8 сиаловой кислоты существенно отличается от таковой природной человеческой дезоксирибонуклеазы. Применение гомополимерного полисахарида, содержащего от 80 звеньев альфа-2,8 сиаловой кислоты для изменения улучшения фармакологических свойств рекомбинантной дезоксирибонуклеазы при ингаляционном применении является новым.

Механизмы указанного феномена в настоящий момент исследуются авторами.

Из вышеизложенного следует, что заявленное применение ново, неочевидно и промышленно применимо, т.е. соответствует всем требованиям, предъявляемым к изобретению.

Junko Fujihara et. al., Actin-inhibition and folding of vertebrate deoxyribonuclease I are affected by mutations at residues 67 and 114. Comparative Biochemistry and Physiology, Part В 143 (2006) 70-75

Е. Гембицкая, А.Г. Черменский, Поражение легких при муковисцидозе: современные аспекты, Consilium Medicum, №3, 2008

Roth, J., Rutishauser, U., Troy, F.A. (Eds.), Polysialic acid: from microbes to man, Birkhauser Verlag, Basel, Advances in Life Sciences, 1993.

Gregoriadis, G., Drug and vaccine delivery systems, in: PharmaTech, World Markets Research Centre Limited, London (2001) 172-176.

Jain, S., Hirst, D.H., Laing, P., Gregoriadis, G., Polysialylation: The natural way to improve the stability and pharmacokinetics of protein and peptide drugs, Drug Delivery Systems and Sciences, 4(2) (2004) 3-9

Worrall AF, Connolly BA. The chemical synthesis of a gene coding for bovine pancreatic DNase I and its cloning and expression in Escherichia coli. J Biol Chem. 1990 Dec 15; 265(35):21889-95.

Linardou H, Epenetos AA, Deonarain MP. A recombinant cytotoxic chimera based on mammalian deoxyribonuclease-I. Int J Cancer. 2000 May 15; 86(4):561-9.